H2AX의 BRCA1 NLS domain과 BARD1 BRCT domain 각각과의 in vitro 상호 결합 H2AX Directly Interacts with BRCA1 and BARD1 via its NLS and BRCT Domain Respectively in vitro원문보기
본 연구에서는 H2AX의 생리학적인 기능 및 분자세포 생물학적 기전 해석에 대한 보다 명확한 정보를 제시하고자, H2AX 관련 단백질들을 literature review 및 생물정보학적인 기술을 이용하여 최적의 결합 단백질체를 40개를 예측하곤 이들 가운데 상호작용 가능성이 높은 BRCA1와 BARD1 단백질을 선별하여 in vitro 결합실험을 통해 이를 증명하였다. 이들 두 가지의 유전자를 발굴하여, 클로닝하였다. 클로닝된 유전자를 이용하여 두 가지 단백질을 발현 및 정제하였으며, 단백질들의 자체적인 구조에 의한 결합능력을 판단하기 위해 in vitro binding assay법을 실시하였다. 단백질의 구조적 안정과 비특이적 결합을 억제하는 detergent만이 포함된 상태에서, 구조학적 및 물리학적 상호 결합의 유무를 판정할 수 있게 하였으며, BRCA1과 BARD1은 모두 H2AX에 결합함을 확인하였다. 이런 실험결과를 바탕으로 각각의 단백질에 대해 H2AX와의 최적 결합 부위를 알아내기 위해 각 유전자의 domain을 생물정보학적으로 분석하였다. 이에 RING domain, NES, NLS 및 BRCT domain에 해당하는 유전자 부분을 새로 클로닝하여, 다시 in vitro 결합실험 및 실험결과에 대한 literature review를 통한 분석을 실시한 결과, H2AX는 BRCA1의 NLS, BARD1의 BRCT domain 부분과 결합하는 것을 확인하였다. H2AX에 대한 BRCA1과 BARD1과의 결합은 DNA repair에 있어 BRCA1의 NLS와 BARD1의 BRCT domain을 통해 H2AX foci의 관련 세포 신호전달 기전에 중요한 역할을 하여 전체적으로 genomic stability에 영향을 미칠 가능성이 농후할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 H2AX의 생리학적인 기능 및 분자세포 생물학적 기전 해석에 대한 보다 명확한 정보를 제시하고자, H2AX 관련 단백질들을 literature review 및 생물정보학적인 기술을 이용하여 최적의 결합 단백질체를 40개를 예측하곤 이들 가운데 상호작용 가능성이 높은 BRCA1와 BARD1 단백질을 선별하여 in vitro 결합실험을 통해 이를 증명하였다. 이들 두 가지의 유전자를 발굴하여, 클로닝하였다. 클로닝된 유전자를 이용하여 두 가지 단백질을 발현 및 정제하였으며, 단백질들의 자체적인 구조에 의한 결합능력을 판단하기 위해 in vitro binding assay법을 실시하였다. 단백질의 구조적 안정과 비특이적 결합을 억제하는 detergent만이 포함된 상태에서, 구조학적 및 물리학적 상호 결합의 유무를 판정할 수 있게 하였으며, BRCA1과 BARD1은 모두 H2AX에 결합함을 확인하였다. 이런 실험결과를 바탕으로 각각의 단백질에 대해 H2AX와의 최적 결합 부위를 알아내기 위해 각 유전자의 domain을 생물정보학적으로 분석하였다. 이에 RING domain, NES, NLS 및 BRCT domain에 해당하는 유전자 부분을 새로 클로닝하여, 다시 in vitro 결합실험 및 실험결과에 대한 literature review를 통한 분석을 실시한 결과, H2AX는 BRCA1의 NLS, BARD1의 BRCT domain 부분과 결합하는 것을 확인하였다. H2AX에 대한 BRCA1과 BARD1과의 결합은 DNA repair에 있어 BRCA1의 NLS와 BARD1의 BRCT domain을 통해 H2AX foci의 관련 세포 신호전달 기전에 중요한 역할을 하여 전체적으로 genomic stability에 영향을 미칠 가능성이 농후할 것으로 사료된다.
H2AX, a crucial component of chromatin, is implicated in DNA repair, cell cycle check point and tumor suppression. The aim of this study was to identify direct binding partners of H2AX to regulate cellular responses to above mechanisms. Literature reviews and bioinformatical tools were attempted int...
H2AX, a crucial component of chromatin, is implicated in DNA repair, cell cycle check point and tumor suppression. The aim of this study was to identify direct binding partners of H2AX to regulate cellular responses to above mechanisms. Literature reviews and bioinformatical tools were attempted intensively to find binding partners of H2AX, which resulted in identifying two potential proteins, breast cancer-1 (BRCA1) and BRCA1-associated RING domain 1 (BARD1). Although it has been reported in vivo that BRCA1 co-localizes with H2AX at the site of DNA damage, their biochemical mechanism for H2AX were however only known that the complex monoubiquitinates histone monomers, including unphosphorylated H2AX in vitro. Therefore, it is important to know whether the complex directly interacts with H2AX, and also which regions of these are specifically mediated for the interaction. Using in vitro GST pull-down assay, we present here that BRCA1 and BARD1 directly bind to H2AX. Moreover, through combinational approaches of domain analysis, fragment clonings and in vitro binding assay, we revealed molecular details of the BRCA1-H2AX and BARD1-H2AX complex. These data provide the potential evidence that each of the BRCA1 nuclear localization signal (NLS) and BARD1 BRCA1 C-terminal (BRCT) repeat domain is the novel mediator of H2AX recognition.
H2AX, a crucial component of chromatin, is implicated in DNA repair, cell cycle check point and tumor suppression. The aim of this study was to identify direct binding partners of H2AX to regulate cellular responses to above mechanisms. Literature reviews and bioinformatical tools were attempted intensively to find binding partners of H2AX, which resulted in identifying two potential proteins, breast cancer-1 (BRCA1) and BRCA1-associated RING domain 1 (BARD1). Although it has been reported in vivo that BRCA1 co-localizes with H2AX at the site of DNA damage, their biochemical mechanism for H2AX were however only known that the complex monoubiquitinates histone monomers, including unphosphorylated H2AX in vitro. Therefore, it is important to know whether the complex directly interacts with H2AX, and also which regions of these are specifically mediated for the interaction. Using in vitro GST pull-down assay, we present here that BRCA1 and BARD1 directly bind to H2AX. Moreover, through combinational approaches of domain analysis, fragment clonings and in vitro binding assay, we revealed molecular details of the BRCA1-H2AX and BARD1-H2AX complex. These data provide the potential evidence that each of the BRCA1 nuclear localization signal (NLS) and BARD1 BRCA1 C-terminal (BRCT) repeat domain is the novel mediator of H2AX recognition.
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문제 정의
본 연구는 DNA 및 게놈 안정성에 관련된 H2AX와 직접적으로 결합할 수 있는 새로운 단백질을 찾고자 하였다. 먼저 H2AX의 세포 내 기능과 밀접한 연관성을 지닌 단백질들을 수집하였으며, 이 단백질들을 생물정보학적 기술을 이용하여 기능적으로 H2AX와 가장 중첩되는 기능을 보이는 단백질들을 판별하였다.
본 연구에서는 H2AX의 생리학적인 기능 및 분자세포생물학적 기전 해석에 대한 보다 명확한 정보를 제시하고자, H2AX 관련 단백질들을 literature review 및 생물정보학적인 기술을 이용하여 최적의 결합 단백질체를 40개를 예측하고, 이들 가운데 상호작용 가능성이 높은 BRCA1와 BARD1 단백질을 선별하여 in vitro 결합실험을 통해 이를 증명하였다 이들 두 가지의 유전자를 발굴하여, 클로닝하였다. 클로닝된 유전자를 이용하여 두 가지 단백질을 발현 및 정제하였으며, 단백질들의 자체적인 구조에 의한 결합능력을 판단하기 위해 in vitro binding assay법을 실시하였다.
역할을 하느냐는 것이었다. 이러한 연구의 중심 실험은 H2AX에 직접적으로 결합할 수 있는 단백질을 선별하는것에 있다. 왜냐하면, 최근까지 위의 단백질들은 인산화된 H2AX와 co-localization을 보이는 수준에 머물러 있었다.
제안 방법
H2AX는 뉴클레오솜과 DNA 결합 기능을 하는 H2A 도메인 부분과 C-말단의 인산화 motif를 가지고 있으며, H2AX의 C-말단 부분이 20개의 아미노산임을 감안하여 H2A와 H2AX을 대상으로 H2AX의 결합 부분을 실험적으로 추적하였으며, BRCA1과 BAR이의 도메인 분석을 통해 유비퀴틴화 (Ubiquitination)에 관여하는 RING-fmger (Really Interesting New Gene-Finger) 도메인 NES (Nuclear Export Signal), NLS (Nuclear Localization Signal) 그리고 protein-protein interaction에 관여하는 BRCT (BRCA1 C-Terminus) 도메인을 대상으로 실험하여 H2AX의 결합부분을 추적하였다.
H2AX와 BRCA1, BARD 1의 결합 유무 및 결합 부위추적을 위해 각 단백질들의 도메인 분석을 SMART (Simple Modular Architecture Research Tool)(25) 사이트를 통해 수행하였다. H2AX는 뉴클레오솜과 DNA 결합 기능을 하는 H2A 도메인 부분과 C-말단의 인산화 motif를 가지고 있으며, H2AX의 C-말단 부분이 20개의 아미노산임을 감안하여 H2A와 H2AX을 대상으로 H2AX의 결합 부분을 실험적으로 추적하였으며, BRCA1과 BAR이의 도메인 분석을 통해 유비퀴틴화 (Ubiquitination)에 관여하는 RING-fmger (Really Interesting New Gene-Finger) 도메인 NES (Nuclear Export Signal), NLS (Nuclear Localization Signal) 그리고 protein-protein interaction에 관여하는 BRCT (BRCA1 C-Terminus) 도메인을 대상으로 실험하여 H2AX의 결합부분을 추적하였다.
H2AX와 상호 결합할 가능성이 있는 단백질을 추적하기 위해, 먼저 NCBI (National Center for biotechnology Information)(22) 사이트에 검색어 任I2AX, 을 입력하여 Pubmed 데이터베이스를 통해 나온 관련 논문들을 토대로 H2AX 관련 단백질들의 정보와 Gene 데이터베이스를 통해 지금까지 보고된 결합 및 결합 가능성을 가진 단백질들의 정보를 수집하였으며 또한, EBI-Harvester (European Bioinformatics Insitute)(23) 사이트를 통해 H2AX 단백질과 상호작용을 하는 단백질들의 정보를 수집하여 종합적으로 결과 단백질들을 수집하였다. 이에 해당하는 단백질들은 H2AX, ATM, ATR, NBS1, MDC1, TP53, CCND1, CLU, CHK1, SMC1L1, CHK2, BRCA1, BARD1, DNAPK, JNK, PP2A, PP4C, MRE11, RAD50, RAD51, MCPH1, RNF8, 53BP1, RAP80, TIP60, ARP4, EGFR, ERBB3, ERK1, ERK2, GLO1, HSP25, HSP70, MAPK1, MAPK3, MAPK14, PCNA, CDK4, p21, pl6 그리고 p21 등 총 40개가 해당되었다.
Literature review를 활용하여 H2AX 관련 기전 연구에 있어서 DNA damage나 cell cycle check point에 관련되어 세포 내에서 같은 위치를 보이고, 동시에 immunoprecipitation을 통해 H2AX에 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질들인 BRCA1과 BARD1 을 선별하였다. 이 유전자들은 앞서 설명한 바와 같이 세포 내 DNA repair에 있어 H2AX와 매우 밀접한 관계를 이루며 그 역할을 수행한다.
vitro 상에 합성되었日. pGEX-6p3-H2A와 pGEX-6p3-H2AX을 BL21 (Novagen) 균주에 도입 및 형질전환 시킨뒤, 0.1 mM의 isopropyl b-D-thiogalactoside (IPTG)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 가역적으로 전사를 유도하여 재조합 단백질을 발현시켰다. 발현된 균체를 lysis buffer [30 mM Tris-HCl (pH 7.
그 다음 판별된 단백질들 중에 이미 H2AX와 결합하는 것으로 보고된 것들을 배제 시키고, 남은 단백질들을 대상으로 지금까지 발표된 H2AX 논문을 토대로 결합가능성을 타진할 만한 최종 단백질을 분리하였다 이 단백질들이 BRCA1과 BARD1 이며, 이들과 H2A双와의 상호 결합 부위를 추적하였다 이에 각각의 유전자들을 확보하고, 클로닝된 유전자를 바탕으로 H2AX 와 결합유무를 판단한 결과, 모두 H2AX와 결합함을 보였다. 게다가 H2AX의 결합에 작용하는 BRCA1, BARD 1의 domain을 분석하고, 결합 실험을 통하여 상호작용이 가능한 최적 domain 부위를 추적하였다.
하였다. 먼저 H2AX의 세포 내 기능과 밀접한 연관성을 지닌 단백질들을 수집하였으며, 이 단백질들을 생물정보학적 기술을 이용하여 기능적으로 H2AX와 가장 중첩되는 기능을 보이는 단백질들을 판별하였다. 그 다음 판별된 단백질들 중에 이미 H2AX와 결합하는 것으로 보고된 것들을 배제 시키고, 남은 단백질들을 대상으로 지금까지 발표된 H2AX 논문을 토대로 결합가능성을 타진할 만한 최종 단백질을 분리하였다 이 단백질들이 BRCA1과 BARD1 이며, 이들과 H2A双와의 상호 결합 부위를 추적하였다 이에 각각의 유전자들을 확보하고, 클로닝된 유전자를 바탕으로 H2AX 와 결합유무를 판단한 결과, 모두 H2AX와 결합함을 보였다.
정보는 Table 1에 나타내었다. 모든 클로닝 산물은 양방향 automated DNA sequencing을 통해 확인하였다.
IB). 이 중 기존에 H2AX와 결합하는 것으로 알려진 것 (ATM, ATR, Mdcl, Nbsl, 53BP1)을 제외한 후남은 것들을 H2AX와의 연관성에 기초하여 기존에 보고된 논문들을 통해 최적의 결합 가능성을 지닌 단백질을 선정하였다(재료 및 방법).
이에 해당하는 단백질들은 H2AX, ATM, ATR, NBS1, MDC1, TP53, CCND1, CLU, CHK1, SMC1L1, CHK2, BRCA1, BARD1, DNAPK, JNK, PP2A, PP4C, MRE11, RAD50, RAD51, MCPH1, RNF8, 53BP1, RAP80, TIP60, ARP4, EGFR, ERBB3, ERK1, ERK2, GLO1, HSP25, HSP70, MAPK1, MAPK3, MAPK14, PCNA, CDK4, p21, pl6 그리고 p21 등 총 40개가 해당되었다. 이러한 단백질들과 H2AX간의 기능적 분류를 통해 가장 높은 관련성을 가지는 단백질들을 찾고자 GATHER(Gene Annotation Tool to Help Explain Relationships)(24) 사이트를 이용하여 위의 40개 단백질들과 H2AX을 입력하여 나오는 결과를 대상으로 대표적인 H2AX의 기능인 DNA metabolism, Cell cycle, Cell proliferation, DNA repair, Meiosis 그리고 Response to DNA damage stimulus을 주죽으로 관련 단백질들을 정리하였으며, H2AX와 기능적으로 중첩되는 단백질들을 선별하였다(Fig. IB).
이 부분에는 핵 내로의 이동에 관여하는 NLS 만 존재하고 있어, NLS와 H2AX와 결합함을 보였다. 이런 결과를 토대로 BARD1 을 RING domain과 NES 부분이 있는 14-189, NLS가 있는 250-386, 그리고 BRCT domain이 있는 551-776 부분(Fig. 3B)을 클로닝하여 H2AX와 in vitro binding assay을 하여 결합위치 부분을 추적하였다. 그 결과 BRCA1과 달리, BARD1은 RING domain과 NES가 있는 14-189 부분과 BRCT domain과 결합함을 보였다(Fig.
대상 데이터
1A에 설명하였다. 먼저 H2AX와 기능적으로 관련 있는 40개의 단백질들을 선별하였다. 이러한 단백질들을 온톨로지 기능별로 분류하여 현재까지 보고된 H2AX의 기능과 가장 중첩되는 15개의 유전자로 축약하였다.
선별된 단백질들을 대상으로 지금까지 보고된 논문을 참고하여 H2AX 결합 단백질로써 밝혀진 것들인 ATM, ATR, Mdcl, Nbsl, 53BP1(6, 7, 8, 9, 10)와 H2AX에 비의존적인 세포 내 활성을 가지는 TP53, Smcl, Chkl, Chk2(10)을 제외시켰으며, 남은 단백질들을 대상으로 기존 연구논문들을 바탕으로 가장 H2AX와 상호 결합할 가능성이 있는 BRCA1 과 BARD 1을 선별하였다.
이러한 단백질들을 온톨로지 기능별로 분류하여 현재까지 보고된 H2AX의 기능과 가장 중첩되는 15개의 유전자로 축약하였다. 여기에는 ATM, ATR, BRCA1, Chkl, Chk2, PCNA, Mdcl, Nbsl, Rad51, SMC1, TP53, TIP60들이 포함된다(Fig. IB). 이 중 기존에 H2AX와 결합하는 것으로 알려진 것 (ATM, ATR, Mdcl, Nbsl, 53BP1)을 제외한 후남은 것들을 H2AX와의 연관성에 기초하여 기존에 보고된 논문들을 통해 최적의 결합 가능성을 지닌 단백질을 선정하였다(재료 및 방법).
먼저 H2AX와 기능적으로 관련 있는 40개의 단백질들을 선별하였다. 이러한 단백질들을 온톨로지 기능별로 분류하여 현재까지 보고된 H2AX의 기능과 가장 중첩되는 15개의 유전자로 축약하였다. 여기에는 ATM, ATR, BRCA1, Chkl, Chk2, PCNA, Mdcl, Nbsl, Rad51, SMC1, TP53, TIP60들이 포함된다(Fig.
이론/모형
클로닝된 유전자를 이용하여 두 가지 단백질을 발현 및 정제하였으며, 단백질들의 자체적인 구조에 의한 결합능력을 판단하기 위해 in vitro binding assay법을 실시하였다. 단백질의 구조적 안정과 비특이적 결합을 억제하는 detergent만이 포함된 상태에서, 구조학적 및 물리학적 상호 결합의 유무를 판정할 수 있게 하였으며, BRCA1과 BAR이은 모두 H2AX에 결합함을 확인하였다.
성능/효과
이 유전자들은 앞서 설명한 바와 같이 세포 내 DNA repair에 있어 H2AX와 매우 밀접한 관계를 이루며 그 역할을 수행한다. BRCA1은 아미노산 길이가 1864로 매우 큰 유전자임을 감안하여 일단 BRCA1 1-313, BRCA1 314-1313 그리고 BRCA1 1314-1864의 세 부분으로 나누어 pCITE4c 에 클로닝 하였고, BARD1은 full-length ORF를 같은 벡터에 클로닝 하电 H2AX와 in vitro binding assay을 수행한 결과 H2AX와 결합하는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 특이한 점은 H2AX는 BRCA1 의 314-1313 부분과 결합하였지만 RING domain 과 NES가 있는 1-313 부분과, BRCT domain 부분과는 결합하지 않음을 보였다.
3B)을 클로닝하여 H2AX와 in vitro binding assay을 하여 결합위치 부분을 추적하였다. 그 결과 BRCA1과 달리, BARD1은 RING domain과 NES가 있는 14-189 부분과 BRCT domain과 결합함을 보였다(Fig. 4B). 세포 내에서 BRCA1 과 BARD1 은 각각의 RING domain이 결합되어 hetero击mer를 이루어 NES부분이 노출되지 않는 사실로 미루어 볼 때, BARD1 의 BRCT 부분과 H2AX가 실질적인 결합을 가질 가능성이 농후하다고 유추된다.
먼저 H2AX의 세포 내 기능과 밀접한 연관성을 지닌 단백질들을 수집하였으며, 이 단백질들을 생물정보학적 기술을 이용하여 기능적으로 H2AX와 가장 중첩되는 기능을 보이는 단백질들을 판별하였다. 그 다음 판별된 단백질들 중에 이미 H2AX와 결합하는 것으로 보고된 것들을 배제 시키고, 남은 단백질들을 대상으로 지금까지 발표된 H2AX 논문을 토대로 결합가능성을 타진할 만한 최종 단백질을 분리하였다 이 단백질들이 BRCA1과 BARD1 이며, 이들과 H2A双와의 상호 결합 부위를 추적하였다 이에 각각의 유전자들을 확보하고, 클로닝된 유전자를 바탕으로 H2AX 와 결합유무를 판단한 결과, 모두 H2AX와 결합함을 보였다. 게다가 H2AX의 결합에 작용하는 BRCA1, BARD 1의 domain을 분석하고, 결합 실험을 통하여 상호작용이 가능한 최적 domain 부위를 추적하였다.
흥미로운 점은 IR 조사 후 생기는 foci를 분석한 결과, H2AX fbci가 가장 빠르게 나타났으며, 이후 순차적으로 Rad50 (MRN complex 일원) foci, BRCA1 foci, Rad51 fbci가 형성됨이 보였다. 그러나 BRCA1 과 MRN의 결합은 일부 세포에서만 발견되었으며 IMR90 세포주를 12 Gy의 IR에 노출시킨 후 2시간 이내에 H2AX foci가 100%의 세포 군집에서 나타나지만, Rad50은 6-8시간 후에 H2AX fbci와 co-localization이 관찰 되었으며, 이와는 다르게 BRCA1 foci는 조사 2시간 후 최대에 이르며 상당수가 H2AX foci와 co-localization됨이 관찰되었다. 또한 Rad51 fbci는 BRCA1 fbci 와 co-localization 함■이 알려졌지만 IR 조사 2시간 후 H2AX fbci와 Rad51 fbci간에 겹치는 현상이 보이지 않았다(14).
클로닝된 유전자를 이용하여 두 가지 단백질을 발현 및 정제하였으며, 단백질들의 자체적인 구조에 의한 결합능력을 판단하기 위해 in vitro binding assay법을 실시하였다. 단백질의 구조적 안정과 비특이적 결합을 억제하는 detergent만이 포함된 상태에서, 구조학적 및 물리학적 상호 결합의 유무를 판정할 수 있게 하였으며, BRCA1과 BAR이은 모두 H2AX에 결합함을 확인하였다. 이런 실험결과를 바탕으로 각각의 단백질에 대해 H2AX와의 최적결합 부위를 알아내기 위해 각 유전자의 domain을 생물정보학적으로 분석하였다 이에 RING domain, NES, NLS 및 BRCT domain에 해당하는 유전자 부분을 새로 클로닝하여, 다시 in vitro 결합실험 및 실험결과에 대한 literature review를 통한 분석을 실시한 결과, H2AX는 BRCA1 의 NLS, BARS 의 BRCT domain 부분과 결합하는 것을 확인하였다.
이는 H2AX와의 분자적인 관점에서는 관련성이 耳소 적다고 사료되어 최종적으로 BRCA1 을 H2AX에 결합할 수 있는 최적의 분자물질로 정하였다. 순위 선정 결과, BRCA1 (또한 BRCA1-BARD1 complex)이 가장 높은 관련성을 보였다.
여기에서는 핵 내의 기능에 관여하는 NLS, NES 그리고 BRCT domain들을 중심으로 H2AX와 결합 가능성을 파악하고자 그 부분에 해당하는 유전자 염기서열을 새로이 클로닝하여, in vitro binding assay를 실시하였다 BRCA1 314-1313 의 503-615 amino acids에는 NLS가 존재하는데(Fig. 3A), 이 부분과 H2AX과 결합하는지 확인하기 위해 다시 BRCA1 314-772와 BRCA1 773-1313 부분을 클로닝하여 H2AX와 in vitro binding assay을 실시한 결과, BRCA1 314-772 부분과 결합함이 관찰되었다(Fig. 4A). 이 부분에는 핵 내로의 이동에 관여하는 NLS 만 존재하고 있어, NLS와 H2AX와 결합함을 보였다.
단백질의 구조적 안정과 비특이적 결합을 억제하는 detergent만이 포함된 상태에서, 구조학적 및 물리학적 상호 결합의 유무를 판정할 수 있게 하였으며, BRCA1과 BAR이은 모두 H2AX에 결합함을 확인하였다. 이런 실험결과를 바탕으로 각각의 단백질에 대해 H2AX와의 최적결합 부위를 알아내기 위해 각 유전자의 domain을 생물정보학적으로 분석하였다 이에 RING domain, NES, NLS 및 BRCT domain에 해당하는 유전자 부분을 새로 클로닝하여, 다시 in vitro 결합실험 및 실험결과에 대한 literature review를 통한 분석을 실시한 결과, H2AX는 BRCA1 의 NLS, BARS 의 BRCT domain 부분과 결합하는 것을 확인하였다. H2AX에 대한 BRCA1과 BARTER 결합은 DNA repair에 있어 BRCA1의 NLS와 BARD 1의 BRCT domain을 통해 H2AX foci의 관련 세포 신호전달 기전에 중요한 역할을 하여 전체적으로 genomic stability에 영향을 미칠 가능성이 농후할 것으로 사료된다.
2). 특이한 점은 H2AX는 BRCA1 의 314-1313 부분과 결합하였지만 RING domain 과 NES가 있는 1-313 부분과, BRCT domain 부분과는 결합하지 않음을 보였다. 또한 H2AX에 대한 BRCA1 과 BARD1 의 결합은 H2A와 비교해 봤을 때, H2AX의 특이성을 가지는 부위인 C-말단 꼬리 부분에 의해 매개되지 않으며 H2A와 H2AX의 공통된 단백질 서열 부위와 결합을 하는 것으로 관찰되었다.
게다가 면역형광 연구에 의하면 BRCA1은 DNA damage 후에 H2AX의 인산화로 생기는 nuclear foci와 같은 위치를 보인다(14). 흥미로운 점은 IR 조사 후 생기는 foci를 분석한 결과, H2AX fbci가 가장 빠르게 나타났으며, 이후 순차적으로 Rad50 (MRN complex 일원) foci, BRCA1 foci, Rad51 fbci가 형성됨이 보였다. 그러나 BRCA1 과 MRN의 결합은 일부 세포에서만 발견되었으며 IMR90 세포주를 12 Gy의 IR에 노출시킨 후 2시간 이내에 H2AX foci가 100%의 세포 군집에서 나타나지만, Rad50은 6-8시간 후에 H2AX fbci와 co-localization이 관찰 되었으며, 이와는 다르게 BRCA1 foci는 조사 2시간 후 최대에 이르며 상당수가 H2AX foci와 co-localization됨이 관찰되었다.
후속연구
또한, BARD1 도 잠재적인 tumor suppressor gene이다(17). BRCA1과 BARD1 은 특히 성장 자극에 대한 세포 반응, DNA damage 그리고 cell cycle checkpoints에 있어 그 역할을 가지기 위해 핵내로 들어오게 되는데 그 기전에 대한 연구는 현재 핵막의 importin에 의해 핵-세포질간의 shuttling이 이루어진다고 보고되고 있지만, 그 이후의 DNA damage, DNA repair에 관여하여 genomic stability와 cell cycle checkpoint0]] 중요한 역할을 하는 H2A및 H2AX와의 작용 기작에 대해서는 추가로 연구가 필요한 상태이다.
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