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문제 정의
- 본 연구에서는 다양한 배지조건에서 장염비브리오를 배양했을 때 biofilm 생성능의 차이 및 biofilm 생성에 관련하는 activat이.와 repressor 물질을 검색하였다.
제안 방법
- , 2000). Biofilm 생성능 실험에 사용한 배지는 brain heart infusion broth, LB broth, marine broth, nutrient broth 및 1% peptone수 5종을 사용하였으며 marine broth를 제외한 나머지 배지에는 최종농도 3%가 되도록 NaCl를 첨가하여 28℃에서 정치배양하면서 측정하였다. 일반적으로 증균에 사용한 배지는 식염을 3% 첨가한 LB broth를 사용하였다.
- , 2005). LB broth에 균을 접종하여 35℃에서 하룻밤 진탕배양한 후 멸균된 생리식염수로 2회 수세하고 현탁한 후 spectrophotometer (Beckman coulter, USA)를 사용하여 600 nm에서 OD를 1.0으로 조정하였다. 조정된 균체는 각배지에 1/1,000 량을 첨가한 후 멸균된 culture tube (Borex, 12x75 mm)에 0.
- 결과는 Table 3에 나타내었다. LB broth에는 activator 물질로 magnesium sulfate를 repressor로는 glucose를 각각 0.5%7} 되도록 첨가하였으며, 1% peptone broth에는 calcium chloride 와 glucose을 각각 첨가하였다. 배 양 24시간 후 각 시험관에생성된 biofilm 생성량은 대조구에 비해 현저하게 낮았다.
- 1의 결과는 배지에 포함되어 있는 어떤 성분이 biofilm 형성에 관여할 가능성을 시사하였다. 따라서 biofilm 형성이 거의 이루어지지 않은 1% peptone broth에 다양한 물질을 최종농도가 0.5%가 되도록 첨가하여 배양시간 경과에 따른 biofilm 형성능을 검토하였으며 결과는 Table 1에 나타내었다. 배지 이외에 다른 성분을 첨가하지 않은 대조구에 비해 biofilm 생성을 크게 증가시키는 물질에는 calcium chloride, calcium nitrate 및 calcium sulf淇e이였다.
- , 2004)를 대상으로 실험한 결과가 있을 뿐이다. 배지에 따른 장염비브리오의 biofilm 형성능을 알아보기 위하여 5종의 배지를 사용하여 배양시간에 따른 균 증식속도 및 biofilm 형성능에 관한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. Marine broth, nutrient broth 및 1% peptone broth에서 균 증식속도는 매우 느려 배양 36시간에도 대수 증식기 상태인데 비해, BH1 broth 및 LB 險由에서는 균 증식은 다른 배지에 비해 상대적으로 빨라 배 양 24 및 30시간 이후에는 사멸기에 도달하였다.
- 여기에 18종의 물질 (ammonium nitrate, calcium carbonate, calcium 나il얂代de, calcium lactate, calcium nitrate, calcium sulfate, ferric 아U댢H* de magnesium sulfate, potassium chloride, potassium phosphate, sodium bicarbonate, sodium phosphate, 겨] t2종), ^■(D-(+)-glucosamine hydrochloride, glucose, lactose, sucrose, 계 4종) 및 아미노산 (casamino acid, gelatin, 계 2종)을 10%가 되도록 증류수에 녹인 후 045 pm filter로 여과 멸균하였다, 최종농도 05%가 되도록 배지에 첨가하였으며 여기에 조정된 균을 가하고, 멸균된 culture tube (Borex, 12x75 mm)에 0.8 mL씩 분주한 후 28C에서 정치배양하면서 배양 12, 24 및 36시간 후에 biofilm 생성량으로 확인하였다.
- 0으로 조정하였다. 조정된 균체는 각배지에 1/1,000 량을 첨가한 후 멸균된 culture tube (Borex, 12x75 mm)에 0.8 mL씩 분주한 후 28℃에서 정치배양하면서 6시간 간격으로 36시간까지 biofilm 생성량을 측정하였다. 균체는 증류수로 3회 수세하여 제거하고 여기에 0.
데이터처리
- 0 mL를 가하고 vortex하여 용줄한 후 염색액은 570 nm에서 즉정하였다. 각 배양액은 3개의 시험관을 사용하였으며 3회 반복실험하여 얻은 평균값으로 계산하였다.
성능/효과
- 1에 나타내었다. Marine broth, nutrient broth 및 1% peptone broth에서 균 증식속도는 매우 느려 배양 36시간에도 대수 증식기 상태인데 비해, BH1 broth 및 LB 險由에서는 균 증식은 다른 배지에 비해 상대적으로 빨라 배 양 24 및 30시간 이후에는 사멸기에 도달하였다.
- Calcium lactate 또한 biofilm 생성을 증가시키나 실험에 사용한 다른 calcium ion 보다는 낮은 편이였다. 그 이외의 물질이 첨가된 배지에서는 대조 구에 비해 약간 상승 내지는 감소하는 경향을 나타내었는데 이는 이들 물질 첨가에 의해 균증식이 대조구에 비해 약간 상승 내지는 억제된 결과이거나 biofilm 생성을 유도하지 못한 결과라고 사료된다. 이상의 결과는 calcium chloride, calcium nitrate 및 calcium sulfate 등의 calcium ione 장염비브리오의 biofilm 생성을 유도하는 activator로서 작용하기 때문에 이들 물질이 풍부한 생물 또는 그 표면으로 균이 이동한 후 부착하여 biofilm을 형성할 가능성이 높다고 사료된다.
- 염류 중에서는 ferric chloride, potassium chloride, potassium phosphate 및 sodium phosphate를 첨가한 배지에서는 대조구와비교하여 biofilm 생성량이 상당히 저조하였는데 이는 이들물질첨가에 의해 균 증식이 느려졌거나 repressor로써 작용한결과라 사료된다. 또한, 포도당을 0.5% 첨가한 배지에서는 biofilm 생성이 배양 36시간까지 거의 일어나지 않아 포도당이 biofilm 생성을 억제하는 repressor로서 작용한 결과라고 사료되며 lactose 및 sucrose가 첨가된 배지에서도 biofilm 생성량은저조하여 이들 당도 포도당처럼 biofilm 생성을 억제하는 repressor로서 작용한다고 사료된다. 1% pepton broth에 0.
- 또한 BH1 broth의 경우. 배양 18시간 후에 최고점에 도달한 후 점점 감소하는 양상을 보이며, LB broth의 경우는 배양 36시간에도 증가추세를 보였다. Enos-Berlage 등에 의하면 장염비브리오의 biofilm 형성은 대수 증식기에서 가장 높게 나타났다가 정지기 이후에는 점점 감소하는 경향을 보인다고 보고하고 있다.
- 사료된다. 배양시간에 따른 biofilm 형성은 균 증식속도가 느린 편인 marine broth에서 가장 빨라 배양 30시간 후에는 최고점에 도달한 후 감소추세를 보인데 비해 nutrient broth 및 1% peptone broth에서 biofilm 형성은 배양 36시간 후에도 미약하게 형성되었다. 이 결과는 이들 배지에는 biofilm 형성을 유도하는 물질이 포함되어 있지 않거나 biofilm 형성에 관여하는 유전자의 발현이 거의 일어나지 않아 궁극적으로 biofilm의형성이 미약한 것으로 사료된다.
- 5%가 되도록 첨가하여 배양시간 경과에 따른 biofilm 형성능을 검토하였으며 결과는 Table 1에 나타내었다. 배지 이외에 다른 성분을 첨가하지 않은 대조구에 비해 biofilm 생성을 크게 증가시키는 물질에는 calcium chloride, calcium nitrate 및 calcium sulf淇e이였다. Calcium chloride를 첨가한 배지의 경우는 배양 24시간 후에 최대생성량을 나타내었으며, calcium nitrate와 calcium sulfate를 첨가한 배지에서는 배양 36시간 후에 최대치를 나타내었다.
- 배 양 24시간 후 각 시험관에생성된 biofilm 생성량은 대조구에 비해 현저하게 낮았다. 이결과는 activator로 작용하는 물질이 존재하더라도 repressor로작용하는 물질이 공존하는 환경에서 장염비브리오는 biofilm 을 생성할 수 없거나 극히 적은양만 생성함을 시사하는 결과이며, 이 결과를 유전학적 측면에서 고찰해 본다면 repressor를인식하는 signal (또는 분자)이 activator를 인식하는 signal (또는 분자)보다 upstream에 있기 때문에 양 물질이 공존하는환경에서는 먼저 repressor signal의 작동으로 biofilm을 생성하는 조건이 off 상태로 유지되 기 때문에 궁극적으로 activator의 signal이 작동할 수 없어 biofilm 생성은 되지 않거나 미약한것으로 사료된다.
- 따라서 배지는 다르지만 본 연구에 사용된 5종의 배지에서 장염비브리오의 biofilm 형성은 Enos-Berlage 등의 연구결과와 유사하였다. 이상의 결과를 종합해 보면 장염 비브리오의 biofilm 형성능은 균 증식보다는 배지 중에 포함되어있는 어떤 성분 (인자)에 의해 크게 영향을 받는다고 사료된다.
후속연구
- 해수의 온도가 저하하게 되면 장염비브리오는 생존을 위한 첫 번째 수단으로 biofilm을 생성하기 위하여 칼슘이 온 이 많은 패류 및 갑각류에 부착할 것이다. 이때 이동수단은 극 편모를 이용하여 표층보다는 수온이 조금이라도 높은 저층에 있는 calcium 이온이 많은 생물로 이동할 것이다. 생물에 부착하면 생물에 있는 calcium 이온이 biofilm형성 activator signal 로 작용하기 때문에 biofilm을 형성하여 월동기간을 보내게 된다.
- 그 이외의 물질이 첨가된 배지에서는 대조 구에 비해 약간 상승 내지는 감소하는 경향을 나타내었는데 이는 이들 물질 첨가에 의해 균증식이 대조구에 비해 약간 상승 내지는 억제된 결과이거나 biofilm 생성을 유도하지 못한 결과라고 사료된다. 이상의 결과는 calcium chloride, calcium nitrate 및 calcium sulfate 등의 calcium ione 장염비브리오의 biofilm 생성을 유도하는 activator로서 작용하기 때문에 이들 물질이 풍부한 생물 또는 그 표면으로 균이 이동한 후 부착하여 biofilm을 형성할 가능성이 높다고 사료된다.
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