[논문]섬유성이형성증 유래세포의 특성연구

이찬희; 한인; 서병무

[국내논문] 섬유성이형성증 유래세포의 특성연구
CHARACTERISTICS OF FIBROUS DYSPLASIA DERIVED CELLS 원문보기

大韓口腔顎顔面外科學會誌 = Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons, v.35 no.5, 2009년, pp.304 - 309

이찬희 (서울대학교 치의학대학원) , 한인 (서울대학교 치의학대학원) , 서병무 (서울대학교 치의학대학원 구강악안면외과, 치학연구소, BK21)

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: Fibrous dysplasia (FD) is a fibro-osseous disease associated with activating missense mutations of the gene encoding the $\alpha$-subunit of stimulatory G protein. FD may affect a single bone (called monostotic form) or multiple bones (called polyostotic form). The extent of lesions reflects the onset time of mutation. In this study, cells from monostotic FD in maxilla of a patient were isolated and cultured in vitro for characterization. Materials and Methods: The single cells were released from FD lesion which was surgical specimen from 15 years-old boy. These isolated cells were cultured in vitro and tested their proliferation activity with MTT assay. In osteogenic media, these cells underwent differentiation process comparing with its normal counterpart i.e. bone marrow stromal cells. The proliferated FD cells were detached and transplanted into the dordsal pocket of nude mouse and harvested in 6 weeks and 12 weeks. Results and Summary: FD cells have an increased proliferation rate and poor differentiation. As a result, cells isolated from FD lesion decreased differentiation into osteoblast and increased proliferation capacity. MTT assay presented that proliferation rate of FD cells were higher than control. However, the mineral induction capacity of FD was lesser than that of control. Monostotic FD cells make fewer amounts of bone ossicles and most of them are woven bone rather than lamellar bone in vivo transplantation. In transplanted FD cells, hematopoietic marrow were not seen in the marrow space and filled with the organized fibrous tissue. Therefore, they were recapitulated to the original histological features of FD lesion. Collectively, these results indicated that the FD cells were shown that the increased proliferation and decreased differentiation potential. These in vitro and in vivo system can be useful to test FD cell's fate and possible.

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AI 본문요약
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문제 정의

이렇게 세포의 분화에 따라 몸의 각 기관으로 돌연변이의 영향을 받을 수 있으므로 질병의 양상은 모자이크와 같이 군데군데 흩어져 보일 수도 있다고 한다^10,23,24). 본 연구에서는 섬유성 이형성증 유래 세포를 in vitro상에서 배양하여 조골세포로의 분화능과 세포의 증식능이 어떠한 변화를 보이는지 알아보고, 이 세포를 전달체와 혼합한 후 면역 억제된 쥐의 피하에 이식하여 병소가 생체 내에서 과연 어떠한 양상으로 재현되는지를 관찰해 보고자 하였다.
본 연구에서는 인체의 골조직, 피부 및 내분비 기관에 이환 가능한 양성의 종양성 병소인 섬유성 이형성증 유래의 세포를 in vitro 상에서 배양하여 면역 억제된 실험용 쥐의 피하에 이식함으로써 질환의 생체 내 이식실험에서 형성된 조직의 형태를 관찰하였다. 이전에도 내분비 기관의 증상을 동반하는 McCune-Albright 증후군 유래의 세포를 이식하는 실험을 한 적은 있으나²³⁾, 이번 실험에서는 두개악안면 영역에서 호발하는 형태인 단골성 섬유이형성증 유래의 세포를 이용하였다²⁰⁾.

제안 방법

그후 70 μm 크기의 격자를 갖고 있는 cell strainer (Falcon, BD labware, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 단일 세포를 얻고, 5분간 원심 분리하여 세포침전을 얻었다.
200 μl의 dimethyl sulfoxide solution을 각 well에 처리하여 formazan crystal을 용해시킨 후 multiwell 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 540 nm 에서의 흡광도를 측정하였다.
각각의 병소에서 일차 배양 과정을 거친 일차배양세포를 60 mm 배양접시에 3×104개씩 분주하여 무기질 유도배지(α-MEM 배지에 10% FBS, 50 μg/ml ascorbic acid, 5 mM βglycerophosphate, 10 nM dexamethasone 첨가)를 이용하여 일주일에 3회 교체해가며 배양하였다.
조직을 염색하기 위해 70%에서 100%까지 순차적으로 에탄올 탈수하고 클로로포름 처리한 후에 파라핀으로 블록을 만들고 5 μm 두께로 슬라이드 섹션을 만들어 hematoxylin과 eosin (H&E staining)으로 염색한후 광학현미경을 이용하여 절편을 관찰하였다.
인체의 골수 유래 세포와 섬유성 이형성증 유래 세포를 in vitro 상으로 배양한 뒤 각각 5×106개의 세포를 50 mg의 전달체인 hydroxyapatite/tricalcium phosphate (HA/TCP) 세라믹 입자(Zimmer, Warsaw, IN)와 함께 1시간 반 동안 혼합 시키고, 면역 억제된 쥐(Hsd:NIHS-LystbgFoxn1nuBtkxid, Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN)의 등쪽 피하에 이식 했다.
각각의 병소에서 일차 배양 과정을 거친 일차배양세포를 60 mm 배양접시에 3×104개씩 분주하여 무기질 유도배지(α-MEM 배지에 10% FBS, 50 μg/ml ascorbic acid, 5 mM βglycerophosphate, 10 nM dexamethasone 첨가)를 이용하여 일주일에 3회 교체해가며 배양하였다. 섬유성 이형성증 병소와 인체 골수 유래의 중간엽 줄기세포에서 무기질이 축적된 정도를 파악하기 위하여 40 mM alizarin red S staining을 이용하여 1주 간격으로 총 3주간 관찰하였다.
병적인 섬유성 이형성증 유래의 세포와 정상적인 골수 유래 세포 간에는 무기질 침착 유도능력에 차이를 보였다. 대조군인 정상적인 골수 유래 세포와 실험군인 섬유성 이 형성증 유래 세포를 무기질 유도 배지로 배양한 뒤 alizarin red S로 1, 2, 3주간 염색하였다(Fig. 4). Alizarin red S로 염색하였더니 섬유성 이형성증 유래의 세포에서는 3주가 지나도 뚜렷한 변화를 보이지 않고 일부에서만 무기질 결절이 생성되어 산발적으로 붉은 염색상이 보이나 골수 유래 세포에서와 같은 높은 무기질 침착 유도능을 보여주지는 못하고 있다(Fig.
본 연구에서는 인체의 골조직, 피부 및 내분비 기관에 이환 가능한 양성의 종양성 병소인 섬유성 이형성증 유래의 세포를 in vitro 상에서 배양하여 면역 억제된 실험용 쥐의 피하에 이식함으로써 질환의 생체 내 이식실험에서 형성된 조직의 형태를 관찰하였다. 이전에도 내분비 기관의 증상을 동반하는 McCune-Albright 증후군 유래의 세포를 이식하는 실험을 한 적은 있으나²³⁾, 이번 실험에서는 두개악안면 영역에서 호발하는 형태인 단골성 섬유이형성증 유래의 세포를 이용하였다²⁰⁾. McCune-Albright 증후군 유래의 세포에서와 유사하게 단골성 섬유이형성증 유래 세포에서의 실험에서, 정상 골수 유래 이식에서 보이는 조직화된 층 판골(lamellar bone)의 형태는 보이지 않고 전달체인 HA/TCP 주위를 감싸고 있는 형태로 골이 관찰되었다.

대상 데이터

15세 남자 환자의 우측 상악골에서 발생한 단골성 섬유성 이형성증 병소조직과 대조군으로 인체의 정상 상악골 표본을 서울대학교 치과병원의 구강악안면외과로부터 제공받았다. 제공받은 샘플을 멸균된 phosphate-buffer saline (PBS)로 수세하고, 3 mg/ml 농도의 collagenase type 1(Gibco BRL, Carlsbad, CA)과 4 mg/ml 농도의dispase (Gibco BRL, Carlsbad, CA)를 이용하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 1시간 30분 동안 배양한 후 조직을 단일 세포들로 분리시킨다.
Louis, MO), 1% antibiotics (100 U/ml penicillin G sodium, Gibco BRL, Carlsbad, CA)가 첨가된 α-modified Eagle's medium (α-MEM, Gibco BRL, Carlsbad, CA)을 배양배지로 이용하여 배양하였다. 본 실험에 사용된 일차배양세포는 패세지 4~5사이의 세포들을 사용하였다.
섬유성 골이형성증 유래 세포들과 정상적인 골수 유래 세포들의 생존능과 증식력을 관찰하기 위하여 MTT assay 를 시행하였다. 96-well 배양접시에 실험군과 대조군의 세포들을 하나의 well당 10,000개씩 분주하였다. 실험의 재현 성을 위하여 각각의 세포는 4개의 well에 반복되어 동시에 배양하였다.

데이터처리

실험 결과의 통계적인 분석을 위해 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA)으로 p<0.05를 기준으로 삼아 유의성 검정을 시행하였다.

이론/모형

섬유성 골이형성증 유래 세포들과 정상적인 골수 유래 세포들의 생존능과 증식력을 관찰하기 위하여 MTT assay 를 시행하였다. 96-well 배양접시에 실험군과 대조군의 세포들을 하나의 well당 10,000개씩 분주하였다.

성능/효과

2). 섬유성 이형성증 유래 세포와 정상 골수 유래 세포의 증식 능력을 비교하기 위하여 MTT assay를 실행한 결과, 24, 48, 72 시간마다 흡광도를 측정하였을 때, 양측의 세포군은 모두 시간이 지날수록 흡광도가 증가하는 양상을 보였다(Fig. 3).
또한 각 시간대별로 증식양상을 비교한 결과에 따르면, 24시간째에 섬유성 이형성증 유래 세포의 증식능이 대조군인 정상 골수 세포에 비해 통계적으로 유의하게 크다는 것을 보여주고 있다(Table 1). 하지만 48시간, 72시간째에는 통계적으로는 유의한 결과를 보이지는 않으나 평균값이 모두 섬유성 이형성증 유래 세포가 조금 더 높게 나타났다.
. 본 실험의 증식능을 관찰하기 위한 MTT assay 결과에서는 섬유성 이형성증 유래 세포가 정상 골수 유래 세포에 비해 관찰 기간 내내 흡광도가 더 높았고, 시간이 흐를 수록 두 세포군 모두에서 점차적으로 흡광도가 증가하는 모습을 보여줌으로써 세포의 증식능은 증가된다는 사실을 확인하였다. 또한 무기질 침착의 유도능 실험에서는 섬유성 이형성증 유래 세포는 3주가 되어도 대조군인 정상적 골수 유래 세포에 비해 매우 적은 양의 무기질 침착을 보이고 있다.
Ⅴ. 결 론

결론적으로 섬유성 이형성증 유래 세포를 배양하여 생체 내에 이식하면 원래 병소의 형태와 유사한 발현 양상을 보이게 된다. 즉, 조골세포의 분화능은 감소하여 정상 골수 유래 세포에 비하여 조혈세포, 적혈구세포 등의 발현은 줄어들고, 증식능은 증가하여 전달체 사이의 대부분의 공간을 섬유성 조직으로 채우고 있는 것이다.
섬유성 이형성증 유래 세포들을 배양하여 면역 억제된 쥐의 등쪽 피하에 이식한 뒤 6주(Fig. 5 A, C)뒤와 12주(Fig. 5 B, D) 뒤에 조직 슬라이드를 만들어 H&E 염색을 한 결과, 6주일 때는 HA/TCP 전달체 주변으로 별다른 골의 생성이 뚜렷이 관찰되지 않고 주변이 섬유성 조직으로만 둘러싸인 모습을 보이고 있다.
이전에도 내분비 기관의 증상을 동반하는 McCune-Albright 증후군 유래의 세포를 이식하는 실험을 한 적은 있으나²³⁾, 이번 실험에서는 두개악안면 영역에서 호발하는 형태인 단골성 섬유이형성증 유래의 세포를 이용하였다²⁰⁾. McCune-Albright 증후군 유래의 세포에서와 유사하게 단골성 섬유이형성증 유래 세포에서의 실험에서, 정상 골수 유래 이식에서 보이는 조직화된 층 판골(lamellar bone)의 형태는 보이지 않고 전달체인 HA/TCP 주위를 감싸고 있는 형태로 골이 관찰되었다. 이는 섬유성 이형성증이 인체 내에서 발현될 때 나타나는 편골(woven bone)과 유사한 형태를 보이고 있는 것이다.

후속연구

즉, 조골세포의 분화능은 감소하여 정상 골수 유래 세포에 비하여 조혈세포, 적혈구세포 등의 발현은 줄어들고, 증식능은 증가하여 전달체 사이의 대부분의 공간을 섬유성 조직으로 채우고 있는 것이다. 따라서 본 연구에서 적용된 in vivo 실험 방법은 환자의 병소 상태를 실험적으로 재현할 수 있어 이에 대한 치료법의 개발 시 이를 토대로 치료 방법의 유용성을 검증하기 위한 도구로 사용되어 질 수 있으며 이와 함께 표준화된 치료를 사용함에 있어 예후를 판단하는 방법으로도 이용될 수 있으리라 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	단골성 섬유성 이형성증이란?	섬유성 이형성증은 질환이 이환되는 범위에 따라 임상적으로 크게 세 가지 형태를 보이는데18), 단골성 섬유성 이형성증(monostotic fibrous dysplasia)은 하나의 골에서만 발생 되고 간혹 피부 착색병소를 보이는 것 외에는 다른 골격이상을 보이지 않는 경우이다19). 가장 흔히 발생되는 부위는 대퇴골, 경골, 장골 등이며 단골성 병소의 25% 정도를 두개 악안면 영역에서 차지하고 있는데5) 그 중에서 하악골과 상악골에서 84% 정도의 이환율을 보이고 있고20), 하악골이나 전두골보다 상악골에서 두 배 이상 많이 발생하며 주로 편측성으로 나타난다고 한다21).
	섬유성 이형성증이란?	섬유성 이형성증(Fibrous dysplasia)은 1938년 Lichtenstein 과 1942년 Lichtenstein과 Jaffe에 의해 기술된 골수 내에서 발견되는 양성의 섬유성 골 병소이다1,2). 이는 골에 발생되는 양성 병소 중에서 약 5~7% 빈도로 발견되는데 비록 발병 빈도는 낮은 편이지만 골의 통증, 변형, 파절, 두개골 신경마비, 청각장애, 두개골의 변형 등을 일으킬 수 있다고 보고되었다3-7).
	섬유성 이형성증으로 인한 발생할 수 있는 문제는?	섬유성 이형성증(Fibrous dysplasia)은 1938년 Lichtenstein 과 1942년 Lichtenstein과 Jaffe에 의해 기술된 골수 내에서 발견되는 양성의 섬유성 골 병소이다1,2). 이는 골에 발생되는 양성 병소 중에서 약 5~7% 빈도로 발견되는데 비록 발병 빈도는 낮은 편이지만 골의 통증, 변형, 파절, 두개골 신경마비, 청각장애, 두개골의 변형 등을 일으킬 수 있다고 보고되었다3-7).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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