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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에서 오남용 빈도가 높은 마약류 분석을 위해 분석 물질로 MA, AR MDMA, MDA, NKT를 선정하였으며 마약 복용 여부를 빠르고 간편하게 확인할 뿐만 아니라 고감도 분석법 개발을 위해 시료 기질로부터 발생되는 방해물질을 효과적으로 차단할 수 있는 추출과정 개선, 시 간과 노동력 이 소요가 많은 모발 세절단계의 자동화 및 미 량분석에 접합한 GC- MS/MS를 이용한 분석 법 개발을 수행하고자 하였다.
제안 방법
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MS/MS fiagmentation을 위해 충돌 기체로 아르곤을 이용하였으며 충돌이 일어나는 collision cell 내의 압력을 2.75±1.0 mTorr로 유지하였다.
- PTFE 재질의 통과가능한 입자의 크기가 0.2 jim 이하인 시 린지 필터를 사용하여 불순물을 제거함으로써 시료 기질 효과의 감소와 재현 성향상에 도움이 되었다.
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각각의 분석물질의 질량스펙드럼(mass spectrum)을얻어 기준이온(base ion) 또는 특성이온을 precursor ion 으로 사용하였으며, collision energy를 가하여 생성된 product ion으로 분석물질을 모니터링하였다.
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검정곡선을 작성하기 위해 모발 중 MDA를 제외한 분석물질의 농도는 0.05, 0.15, 0.2, 0.5, 1, 5, 10, 20 ng/mg이 뇌도록 하고, 내부표준물질은 모두 1.5 ng/mg이 되도록 하였다.
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검정곡선을 작성하기 위해 바탕시료의 농도가 0.0520 ng/mg (MA, AP, MDMA, NKT)과 0.05-5.0 ng/mg (MDA)의 범위가 되도록 표준물질을 첨가하여 확립된 전처리 방법을 거쳐 GC-MS/MS 로 분석하였으며 분석 결고]는 내부표준법을 사용하여 검정곡선을 작성하였다.
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그리고 기준시료를 사용하여 검정곡선을 작성하여 대조시료를 검정곡선에 적용하여 농도를 계산하여 절대 회수율을 구했다.
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단 MDA의 모발 중 농도는 0.05, 0.15, 0.2, 0.5, 1, 5 ng/ mg이 되도록 하였다.
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대조시료는 모발 시료에 표준물질을 첨가하여 시료 전처리 과정을 거친 후 내부표준 물 질을 첨가하여 기기분석을 수행하였다.
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또한 동위원소로 치환된 내부표준물질인 MA-c/n, AP-d8 MDMA-/, MDA-& NKT-d3도 메탄올에 희석하여 0.3 |ig/mL이 뇌도록 내부표준 용액을 제조하였다.
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모발 중에 잔류하는 암페타민 유도체 및 노르케타민 5종을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 고감도 동시 분석법을 확립하였다.
- 방해물질의 영향을 최소화하면서 분석물질 추출 효율이 우수한 용매 선택을 위해 0.25 M methanolic HC1 과 메탄올을 비교.하고자 하였다.
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본 연구에서는 모발의 세절을 위해 24 개 시료를농시에 처리가 가능한 Precellys 24 자농분쇄기를 이용하여 직경이 2.8 mm의 스테인리스 스틸 비드 6 개가 담긴 2 mL 용량의 뉴브에 시료를 담아 5 000 rpm에서 1 분 30초간 세절하였다.
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분리 관은 DB-5MS (30 m>:0.25 mm I.
D., 0.25 jim film thickness, J&W Scientific, USA)를 사용하였으며, 분리관 온도는 90 ℃에서 0.5 분간 유지 시 킨 후 계속하여 25℃/min으로 150℃ 까지승온시키고 1.5 분간 유지 시킨 후, 다시 상승 속도를 leC/min으로 바꿔 210℃까지 승온시켜 1.5 분간 유지한 후 마지막 단계로 40℃/min으로 310℃까지 승온시키고 1.
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실험 방법의 정밀도와 정확도를 평가하기 위해서 모발 중 분석물질의 농도가 AP, MA, MDMA, NKT 는 0.3, 5, 15 ng/mg, MDA는 0.3, 3 ng/mg이 뇌도룩바탕시료에 표준물질을 첨가하였으며 농도 당 여섯 개의 시료를 제조하여 측정하였다.
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실험방법의 회수율(recovery)은 대조시료와 기준시료를 비교하여 실험하였다.
- 앞에서 설정한 전처리 방법에 따라 시료를 처리한 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름 시간을 확인하고, 내부표준물질의 피크 면적에 대한 분석물질의 피크 면적 비를 가지고 검정 곡선을 작성하였다.
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유도체화 과정을 거친 분석물질을 E1 방식의 양이온 모드에서 이온화하여 MRM 방법을 사용하여 분석하였다.
- 최대 감도와 최직의 product ion 생싱 조건을 찾기 위해 collision energy를 5-15 eV 법위까지 변화시켰고 이때 분석물질의 precursor ion으로부터 생성된 특징 직 인 product ion을 선 정 하여 각각을 하나의 쌍으로 모니터링 하였다.
- 효과적인 시료 전처리를 위해서 모발 기질로부터 발생하는 방해물질을 효과적으로 차단하고 분석물질의 추출 효율이 우수한 메탄올을 추출과정 에 도입하였으며 시간과 노동력이 소요가 많은 모발 세절단계를 자동화함으로써 분석시간을 단축하여 신속한 분석이 수행되도록 분석법을 개선하였다.
대상 데이터
- 따라서 모발과 약물의 결합 위치에서 약물의 확산을 증진시키는 성질인 팽윤성 (swelling property)0] 뛰어난 용매로 보고된 메탄올을 추출 용매로 선정하였다.23
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메탄올, 아세톤 등의 용매는 미구 J.
T. Baker사의 HPLC 등급 시약을 사용하였고 증류수는 Milli-Q water purification system을 통과한 3차 증류수를 이용하였다.
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모발 세절과정에 사용한 분쇄기는 프랑스 Bertin Technologies사의 Precellys 24 자농분쇄기를 사용하였고 세절에 사용된 용기는 6 개의 스테인리스 스틸 구슬(2.8 mm diameter)이 담긴 2 mL 용량의 뉴브를 사용하였다.
- 모발 시료는 2009년 3월 12일부터 3월 26일까지 본 기관에 의뢰되었던 마약 복용 용의자의 모발이며 검량선 작성 및 QC 시료 제조에 사용된 바탕시료 (blank hair)는 약물을 복용하지 않은 사람의 모발로 하였다.
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본 실험에서 사용된 분석기기는 미국 Agilent Technologies4]- 6890 Gas Chromatograph에 연결된 n] 구 Waters 사 Quattro micro GC tandem mass spectro- meter를 사용하였다.
- 분석에 사용된 분석물질의 표준품은 1 mg/mL 농도로 제조된 MA, AP, MDMA, MDA, NKT를 메탄올에 녹여 순차직으로 100, 10, 1, 0.1 |.ig/mL 농도로 희석하여 표준용액을 제조하였다.
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유도체화 시약으로 사용된 heptafluorobutj-Tic anhydride (HFBA)는 벨 기 에 Acres Organics사로부터 구입하였다.
- 추출용매의 정제를 위해 영구 Wh atman 사의 PTFE (polytetrafluoroethylene) 시 린지 필 터(13 mm diameter, 0그 jim pore size)를 사용하였고, 시료의 농축을 위해 미구 Caliper Lifescience4]-의 TurboVap LV 증발기를 사용하였다.
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표준물질과 내부표준물질은 각각 1 mL 용량의 유리병 (vial)에 Img/mL 농도로 제조된 MA, AP, MDMA, MDA, NKT와 1 mL 용량의 유리 병 에 100 |ig/mL 농도로 제조된 MA-d11, AP-& MDMA-d& MDA-</5, NKTM를 미구 Cerilliant사에서 구입 하였다(77g. 1).
이론/모형
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질량분석 기의 이온화 소스(source) 의 온도는 200%? 로 설정되었고 이온화 방식은 El (electron impact)이었으며 MRM (multiple reaction monitoring) 방범 을 사용하여 정 량하였다.
성능/효과
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GC-MS/MS를 사용한 MRM 방법을 이용하여 분석물질의 선택성(selectivity)이 개선되었으며, 0.007 ng/ mg 이하의 우수한 검출한계를 나타내었다.
- 검출한계는 동일 농도의 시료 6 개를 분석한 결과 값의 시그널과 6 개의 바탕시료로부터 얻은 노이즈의 표준편차를 이용하여 S/N 비가 3 이상인 농도를 검출한계, 정 량한계는 10 이상으로 정의하였고 검출한계는 0.001-0.007 ng/mg의 법위를 나타냄으로써 극미량 수준까지 검 출이 가능했다(Table 2).
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본 연구에서 검토한 분석방법으로 표준용액을 첨가한 시료를 분석한 결과 암페타민 유도체 및 노르케타민 5 종의 성분을 동시에 분리 및 확인하고 정량할 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 세 농도(0.3, 3, 15 ng/mg)에서 측정된 AR MA, MDMA, NKT와 누 농도(0.3, 3 ng/mg)에서 측정된 MDA의 회수율은 75.9-100.9%이었다(Table 3).
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세절된 모발 입자의 크기는 분쇄용 튜브의 손상을 최소화하고 방해물질의추출이 적고 분석 대상물질의 회수율이 극대화될 수 있도록 설정하였으며 이때 입자의 크기는 Cilas 1064 Particle Size Analyzer를 이용하여 측정한 결과 평균 123 |im이었다.
- 암페타민 유도체 및 노르케타민 5 종에 대한 검정 곡선의 결정계수는 모두 r=0.998 이상으로 정 량법위 내에서 우수한 직선성을 나타내었다.
- 정 량범위내에서 검정곡선을 구한 결과 결정계수가 0.998 이상으로 직선성 이 매우 우수하였고 중수소로 치환된 내부표준물질을 사용함으로써 정확도 및 정밀도를 개선한 분석법으로 볼 수 있다.
후속연구
- 따라서 개발된 분석방법은 마약 복용 여부를 빠르고 간편하게 확인할 뿐만 아니라 동시에 미 량분석이가능한 분석법으로 지속적으로 증가하는 마약사범 적발에 유용한 모발 감정기법이 될 것으로 판단된다.
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