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문제 정의
- 桑白皮의 선천 면역 활성화에 의한 항암 효과를 알아보기 위해 암세포의 전이 억제와 복강 내 macrophage로부터 분비 되는 cytokine의 활성화 및 NK cell 활성화에 대하여 연구하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 桑白皮가 면역계에 미치는 영향을 알아보기 위해 macrophage에 대한 세포독성 효과를 알아본 결과, 250㎍/㎖이하에서 100%에 가까운 세포증식을 나타내었다. 따라서 선천 면역기능 활성화에 의한 항암효과를 알아보기 위해 세포독성의 영향을 받지 않는 250㎍/㎖ 이하의 농도에서 cytokine 분비 변화를 알아보았다.
- 종양 접종 2일 전에 10, 50 및 250㎍의桑白皮 추출물을 각각 1회 정맥 투여한 결과, 10, 50 및 250㎍의 모든 투여군에서 유의성 있는 종양 전이 억제 효과를 보였다. 따라서 세포독성에 의한 종양 억제 효과인지 macrophage나 NK cell의 활성화를 통한 선천 면역계의 강화에 의한 종양 억제 효과인지를 알아보았다.
- 이에 저자는 桑白皮의 선천 면역 활성화에 의한 항암 효과를 알아보기 위해 암세포의 전이 억제와 복강 내 macrophage 로부터 분비되는 cytokine의 활성화 및 NK cell 활성화를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 이로 미루어 볼 때 면역학적으로 암세포 억제에 중요한 역할을 하는 interleukin 과 TNF-α 등의 cytokine 생성에 桑白皮 가 영향을 줄 수 있을 것이라는 가정 하에 연구를 실시하게 되었다.
제안 방법
- 20마리의 BALB/c 마우스를 NK cell 제거군과 비제거군에 각각 10마리씩 무작위 배정 후, NK cell 제거군은 종양 접종 3일전 및 1일전에 50배 희석된 anti-asialo GM1 항체를 마우스당 500㎕ 씩 총 2회 복강 주사하였다. NK cell 제거군과 비제거군 마우스 중 각각 5마리를 무작위로 선택하여 桑白皮 추출물 250㎍을 1일 1회 정맥주사 하고, 나머지는 동일한 용량과 방법으로 생리식염수를 정맥주사 하였다.
- BALB/c 마우스에 1% thioglycollate를 1㎖ 복강주사하고 3일 후에 경추 분리 법으로 희생 시킨 후, 복강에 RPMI-1640배지 10㎖을 주입하여 복강 내 세포 (peritoneal exudative cells: 이하 PEC)를 수집하였다. 수집된 PEC를 24 well culture plate에 1.
- 20마리의 BALB/c 마우스를 NK cell 제거군과 비제거군에 각각 10마리씩 무작위 배정 후, NK cell 제거군은 종양 접종 3일전 및 1일전에 50배 희석된 anti-asialo GM1 항체를 마우스당 500㎕ 씩 총 2회 복강 주사하였다. NK cell 제거군과 비제거군 마우스 중 각각 5마리를 무작위로 선택하여 桑白皮 추출물 250㎍을 1일 1회 정맥주사 하고, 나머지는 동일한 용량과 방법으로 생리식염수를 정맥주사 하였다. 정맥주사 2일 후, 각 마우스 당 2.
- 桑白皮의 암전이 예방효과를 in vivo 에서 확인하기 위하여 5마리의 BALB/c 마우스에 桑白皮 추출물 10, 50 및 250㎍을 1회 정맥주사 하였으며, 대조군은 동일한 용량과 방법으로 생리식염수를 정맥주사 하였다. 정맥주사 2일 후, 각 마우스 당 2.
- 桑白皮의 종양 전이 억제 효과를 알아보기 위하여 colon26-M3.1 carcinoma cell을 이용한 마우스 실험 모델을 통해 종양세포의 군락 수 변화를 측정하였다. 종양 접종 2일 전에 10, 50 및 250㎍의桑白皮 추출물을 각각 1회 정맥 투여한 결과, 10, 50 및 250㎍의 모든 투여군에서 유의성 있는 종양 전이 억제 효과를 보였다.
- 배양 상등액에 유도 분비된 interleukin (이하 IL)-6, IL-10, IL-12및 TNF-α의 측정은 각 cytokine에 대한 ELISA kit (Pharmingen, San Jose, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 각 cytokines의 양은 각각에 대한 표준곡선에 대입하여 계산하였다.
- 2㎍/㎖까지 희석한 桑白皮 검액 100㎕를 각각 첨가하고 2일간 배양하였다. 배양 완료 2-4시간 전에 cell counting kit (Wako, Japan) 용액을 well당 10㎍/㎖ 첨가 후, 생존세포가 생산한 수용성 formazan의 양을 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성 효과는 시료를 첨가하지 않는 대조군에 대한 백분율(%)로 표시하였다.
- 2㎍/㎖까지 희석한 桑白皮 검액 100㎕를 각각 첨가하고 2일간 배양하였다. 배양 완료 2-4시간 전에 cell counting kit (Wako, Japan) 용액을 well당 10㎍/㎖ 첨가 후, 생존세포가 생산한 수용성 formazan의 양을 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성 효과는 시료를 첨가하지 않는 대조군에 대한 백분율(%)로 표시하였다.
- 접종 14일 후 경추분리법으로 마우스를 희생 시킨 후 폐를 적출하여 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정하고 종양의 군집 수를 측정하였다.
- 정맥주사 2일 후, 각 마우스 당 2.7×104 cells의 colon26-M3.1 carcinoma 세포주를 꼬리정맥에 정맥주사로 접종하였다.
- 생후 6-8주령의 雌性 BALB/c 마우스를 (주)중앙실험동물 (Seoul, Korea)에서 분양 받아 사육조에 각 군별로 5마리씩 배정하였다. 정수된 물과 사료 (Samyang Co. Ltd., Incheon, Korea)를 자유 공급 하였고, 온도 22℃, 습도 50% 및 12시간 간격으로 자동 조명되는 상태에서 스트레스를 받지 않도록 주의하여 무균상태로 사육하였다.
대상 데이터
- Colon26-M3.1 carcinoma cell의 배양은 7.5% FBS, vitamin, sodium pyruvate, non-essential amino acid 및 L-glutamine 이 함유된 EMEM 배지를, L5178Y-R lymphoma cells, HeLa cells 및 macrophage의 배양은 7.5% FBS가 함유된 RPMI-1640 배지를 각각 이용하였으며 5% CO2, 95% 습도 및 37℃의 배양기 (Thermo, MA, USA)에서 배양하였다.
- 생후 6-8주령의 雌性 BALB/c 마우스를 (주)중앙실험동물 (Seoul, Korea)에서 분양 받아 사육조에 각 군별로 5마리씩 배정하였다. 정수된 물과 사료 (Samyang Co.
- 종양세포의 배양을 위한 RPMI-1640과 Eagle's minimal essential medium (이하 EMEM) 배지, fetal bovine serum (이하 FBS), vitamin, non-essential amino acid, L-glutamic acid 및 thioglycollate 등은 Gibco사 (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 한국식물추출물은행에서 桑科 (뽕나무과 : Moraceae)에 속한 落葉喬木인 뽕나무 Morus alba L. 및 同屬 近緣植物의 건조된 根皮를 HPLC (Methanol. 50〬C) 로 추출하여 tube에 분주 후 45℃에서 감압 농축법으로 제조한 추출물 (CW02-057) 을 구매하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험군과 대조군의 비교는 Student’s t-test 로 분석하였고, p<0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 하였다.
성능/효과
- 1. Colon 26-M3.1 carcinoma cell에 대한桑白皮 투여 시 모든 투여군에서 유의성 있는 종양 전이 억제 효과를 보였다.
- 2. Colon 26-M3.1 carcinoma cell, L5178Y-R lymphoma cell 및 HeLa cell에 대하여 桑白皮 투여 시 각각 222.2㎍/㎖, 156.3㎍/㎖ 및 222.2㎍/㎖ 이하의 농도에서 100%에 가까운 세포증식 효과를 보였다.
- 3. Macrophage는 桑白皮 추출물 250㎍/㎖농도 이하에서 100%에 가까운 세포증식을 나타내었다.
- 4. Macrophage로부터의 IL-6, IL-10 및 IL-12의 분비는 桑白皮 추출물 250㎍/㎖, TNF-α의 분비는 62.5㎍/㎖까지 농도의존적인 증가를 보였다.
- 5. NK cell을 제거하지 않은 군에서 桑白皮 추출물 투여군은 대조군에 비해 종양의 억제가 유의하게 나타났다.
- Macrophage에서의 IL-6, 10, 12 및 TNF-α 분비는 桑白皮 투여 농도가 증가함에 따라 분비량이 증가하는 것을 분수 있었다.
- 桑白皮 추출물과 종양세포를 동시에 배양시켜 48시간 후 cell counting을 한결과 colon26-M3.1 carcinoma cell, L5178T-R lymphoma cell 및 HeLa cell 이 각각 222.2㎍/㎖, 156.3㎍/㎖ 및 222.2㎍/㎖이 하의 농도에서 100%에 가까운 세포증식 효과를 보였다. 이는 종양 전이 억제 실험에서 유의한 효과를 나타낸 농도보다 고농도에서 세포독성을 나타내므로 桑白皮 추출물 자체의 세포독성에 의한 효과가 아님을 알 수 있다.
- 桑白皮 추출물을 10,000㎍/㎖부터 4배 희석법으로 0.6㎍/㎖까지 처리한 후, L5178Y-R lymphoma cell의 증식을 관찰한 결과 2,500㎍/㎖부터 증가되어 156.3㎍/㎖이하에서 100%에 가까운 세포증식을 나타내었으며, IC50은 2,100㎍/㎖이었다(Fig. 3).
- 桑白皮 추출물을 2,000㎍/㎖부터 3배 희석법으로 8.2㎍/㎖까지 처리한 후, HeLa cell의 증식을 관찰한 결과 2,000㎍/㎖부터 증가되어 222.2㎍/㎖이하에서 100%에 가까운 세포증식을 나타내었으며, IC50은 900㎍/㎖이었다(Fig. 4).
- 桑白皮 추출물을 2,000㎍/㎖부터 3배 희석법으로 8.2㎍/㎖까지 처리한 후, colon26-M3.1 carcinoma cell의 증식을 관찰한 결과 2,000㎍/㎖부터 증가되어 222.2㎍/㎖이하에서 100%에 가까운 세포증식을 나타내었으며, IC50은 1,100㎍/㎖이었다(Fig. 2).
- 桑白皮 추출물을 250㎍/㎖부터 4배 희석법으로 0.98㎍/㎖까지 처리한 후 macrophage 의 IL-10의 분비를 관찰한 결과, 250㎍/㎖부터 0.98㎍/㎖까지 농도 의존적인 분비 감소가 관찰되었다. 이 때, 양성대조군으로 사용한 2㎍/㎖의 LPS의 경우 520.
- 桑白皮 추출물을 250㎍/㎖부터 4배 희석법으로 0.98㎍/㎖까지 처리한 후 macrophage 의 IL-12의 분비를 관찰한 결과, 250㎍/㎖부터 0.98㎍/㎖까지 농도 의존적인 분비 감소가 관찰되었다. 이 때, 양성대조군으로 사용한 2㎍/㎖의 LPS의 경우 177.
- 桑白皮 추출물을 250㎍/㎖부터 4배 희석법으로 0.98㎍/㎖까지 처리한 후 macrophage 의 IL-6의 분비를 관찰한 결과, 250㎍/㎖부터 0.98㎍/㎖까지 농도 의존적인 분비 감소가 관찰되었다. 이 때, 양성대조군으로 사용한 2㎍/㎖의 LPS의 경우 8,637.
- 桑白皮 추출물을 250㎍/㎖부터 4배 희석법으로 0.98㎍/㎖까지 처리한 후 macrophage 의 TNF-α의 분비를 관찰한 결과, 62.5㎍/㎖부터 0.98㎍/㎖까지 농도 의존적인 분비 감소가 관찰되었다.
- 桑白皮 추출물을 4,000㎍/㎖부터 4배 희석법으로 1.0㎍/㎖까지 처리한 후, macrophage의 증식을 관찰한 결과 4,000㎍/㎖부터 증가되어 250㎍/㎖이하에서 100%에 가까운 세포증식을 나타내었으며, IC50은 3,100㎍/㎖이었다(Fig. 5).
- 桑白皮가 면역계에 미치는 영향을 알아보기 위해 macrophage에 대한 세포독성 효과를 알아본 결과, 250㎍/㎖이하에서 100%에 가까운 세포증식을 나타내었다. 따라서 선천 면역기능 활성화에 의한 항암효과를 알아보기 위해 세포독성의 영향을 받지 않는 250㎍/㎖ 이하의 농도에서 cytokine 분비 변화를 알아보았다.
- 桑白皮의 NK cell 활성화를 통한 종양 전이 억제 효과를 알아보기 위하여 NK cell을 제거하지 않은 군과 제거군으로 나누고, 각 군마다 대조군, 桑白皮 투여 군을 두어 실험한 결과, NK cell을 제거 하지 않은 군에서 유의성 (p<0.01) 있는 종양 전이 억제 효과가 나타났다.
- 마우스 모델에서 colon26-M3.1 carcinoma cell 전이 억제에 대한 효과를 알아보기 위해 10, 50 및 250㎍의 桑白皮 추출물을 정맥 투여한 결과, 전이된 종양의 개수는 10㎍, 50㎍ 및 250㎍에서 각각 28.0±8.9개, 12.6±4.6개 및 13.8±7.1개로 대조군 85.0±11.5개에 비해 모두 통계적으로 유의한(p<0.01) 종양 억제 효과를 보였다 (Fig. 1).
- 연구를 통해 桑白皮가 종양 세포에 대한 전이 억제 효과가 유의하게 나타나는 기전이 세포독성에 의한 것보다는 macrophage 에서의 cytokine 분비 증가와 NK cell을 통한 선천 면역계의 기능 활성화를 통한 것임을 볼 때, 桑白皮가 선택적으로 종양 세포를 억제시킬 수 있는 물질임을 유추해 볼 수 있었다. 선천 면역을 활성화시킬 수 있는 다른 한약재와의 조합을 통한 한약처방 연구가 지속적으로 이루어진다면 한의학 연구를 통한 새로운 항암제의 개발이 가능하리라 본다.
- 항체 생산세포의 분화, NK cell의 활성화, 항염증작용의 증가, 종양 괴사 효과 등의 역할을 하는 이러한 cytokine 방출 증가는 곧 인체 스스로 암을 이겨낼 수 있는 선천 면역계를 활성화시킨다는 것을 의미한다. 이에 따라桑白皮가 macrophage에서의 cytokine 분비 증가를 통해 선천 면역계를 활성화시키는 능력이 우수함을 알 수 있었다.
- 1 carcinoma cell을 이용한 마우스 실험 모델을 통해 종양세포의 군락 수 변화를 측정하였다. 종양 접종 2일 전에 10, 50 및 250㎍의桑白皮 추출물을 각각 1회 정맥 투여한 결과, 10, 50 및 250㎍의 모든 투여군에서 유의성 있는 종양 전이 억제 효과를 보였다. 따라서 세포독성에 의한 종양 억제 효과인지 macrophage나 NK cell의 활성화를 통한 선천 면역계의 강화에 의한 종양 억제 효과인지를 알아보았다.
후속연구
- 연구를 통해 桑白皮가 종양 세포에 대한 전이 억제 효과가 유의하게 나타나는 기전이 세포독성에 의한 것보다는 macrophage 에서의 cytokine 분비 증가와 NK cell을 통한 선천 면역계의 기능 활성화를 통한 것임을 볼 때, 桑白皮가 선택적으로 종양 세포를 억제시킬 수 있는 물질임을 유추해 볼 수 있었다. 선천 면역을 활성화시킬 수 있는 다른 한약재와의 조합을 통한 한약처방 연구가 지속적으로 이루어진다면 한의학 연구를 통한 새로운 항암제의 개발이 가능하리라 본다.
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