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문제 정의
- 이에 저자는 實熱火毒에 의한 질환, 즉 각종 염증성 질환 치료에 응용되고 있는 黃連解毒湯이 인간 암세포의 증식에 미치는 영향을 검증하기 위하여 LNCaP,PC-3, DU-145, MCF-7, A549, NCI-H292 K-562세포 등에 黃連解毒湯과 黃連과 黃柏의 주요 성분인 berberine과 黃芩의 주요 성분인 baicalein등의 처리를 한 후 약물이 암세포 증식에 미치는 영향을 sulforhodamine B assay 방법과 direct cell counting 방법으로 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 5) 각 인간 암세포의 증식에 미치는 약물의 영향 검증 K-562 세포를 제외한, 각 인간 암세포를 대상으로 96 well plate의 각 well에 2×104개의 cell을 함유하는 배양액 100㎕를 가하여 37 ℃, 5% CO2 존재 하에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 HDT 추출물을 100 ㎕의 배양액에 0.01%, 0.1%, 1%, 10%의 최종 농도로 각각 희석한 후 배양세포의 well마다 100 ㎕씩 가하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 냉각된 50% trichloroacetic acid (TCA) 50 ㎕를 각 well에 서서히 가해주었다.
- 즉,6 well plate의 각 well에 5×104개의 cell을 함유하는 배양액 1 ㎖를 가하여 37 ℃, 5% CO2 존재 하에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 HDT 추출물을 1㎖의 배양액에 0.01%, 0.1%, 1%, 10%의 최종 농도로 각각 희석한 후 배양세포의 well마다 1㎖씩 가하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각 well에 존재하는 세포의 수를 hemacytometer를 이용하여 직접 계수하였다.
- LNCaP, PC-3 세포는 습도가 충분히 유지되고 95% 공기, 5% CO2를 함유하는 37 ℃ 조건의 배양기 내에서 L-glutamine (2mM), sodium bicarbonate (44mM), penicillin G (100 U/㎖), streptomycin (100㎍/㎖), FBS (10%,V/V )등이 첨가된 RPMI 1640 배양액을, DU-145 세포는 동일한 조건에서 동일한 첨가물을 함유한 DMEM배양액을 이용하여 배양되었으며, 1주에 2회 빈도로 subculture하였다.
- MCF-7 세포는 습도가 충분히 유지되고 95% 공기,5% CO2를 함유하는 37 ℃ 조건의 배양기 내에서 L-glutamine (2mM), sodium bicarbonate (44mM), penicillin G(100 U/㎖), streptomycin (100㎍/㎖), FBS (10%, V/V )등이 첨가된 DMEM 배양액을 이용하여 배양되었으며, 1주에 2회 빈도로 subculture하였다.
- 腫瘍의 원인은 인체의 正氣虧虛 후 外邪가 虛를 틈타 侵入하여 氣滯, 血瘀, 痰飮등의 일련의 병리변화를 일으킨 결과로 인식하였으며, 臟腑陰陽氣血의 虛實에 따라 扶正培本法, 功邪法, 扶正祛邪法으로 치료하는 것을 원칙으로 하였다.6)
- 1%, 1%, 10%의 최종 농도로 각각 희석한 후 배양세포의 well마다 1㎖씩 가하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각 well에 존재하는 세포의 수를 hemacytometer를 이용하여 직접 계수하였다.
- 이제 저자는 黃連解毒湯이 전립선암, 유방암, 폐암, 백혈병의 세포주등 數種의 인간 암세포의 증식에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지를 검증해 보고자, 세포들에 배양액을 가하여 24시간 배양 후 HDT 추출물을 100 μl의 배양액에 0.01%, 0.1%, 1%, 10%의 최종 농도로 각각 희석하여 100 ㎕씩 가하고 72시간 동안 배양하였다.
- 1%, 1%, 10%의 최종 농도로 각각 희석하여 100 ㎕씩 가하고 72시간 동안 배양하였다. 이후 세포들을 고정, 염색시켜 흡광도를 측정하였으며 K-562 세포는 세포 배양용기에 부착된 상태에서 증식하지 않으므로, 배양종료 후 hemacytometer를 이용하여 세포 수를 직접 계수하여 암세포의 증식억제정도를 측정하였다.
- 인간 암세포의 증식에 黃連解毒湯과 黃連 및 黃柏의 주요 성분인 berberine 및 黃芩의 주요 성분인 baicalein등이 어떠한 영향을 미치는 지 검증하기 위하여 전립선암 (LNCaP, PC-3, DU-145), 유방암 (MCF-7), 폐암(A549, NCI-H292) 만성 골수성 백혈병 (K-562) 등의 세포주에 약물처리를 한 후 약물이 암세포 증식에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- A549, NCI-H292 세포는 습도가 충분히 유지되고 95% 공기, 5% CO2를 함유하는 37 ℃ 조건의 배양기 내에서 HEPES (25mM), penicillin G (100 U/㎖), streptomycin (100㎍/㎖ ), FBS (10%, V/V )등이 첨가된 RPMI1640 배양액을 이용하여 배양되었으며, 1주에 2회 빈도로 subculture하였다.
- K-562 세포는 습도가 충분히 유지되고 95% 공기,5% CO2를 함유하는 37 ℃ 조건의 배양기 내에서 L-glutamine (2mM), sodium bicarbonate (44 mM), penicillin G (100 U/㎖), streptomycin (100 ㎍/㎖), FBS (10%, V/V)등이 첨가된 RPMI 1640 배양액을 이용하여 배양되었으며, 1주에 2회 빈도로 subculture하였다.5) 각 인간 암세포의 증식에 미치는 약물의 영향 검증 K-562 세포를 제외한, 각 인간 암세포를 대상으로 96 well plate의 각 well에 2×104개의 cell을 함유하는 배양액 100㎕를 가하여 37 ℃, 5% CO2 존재 하에서 24시간 배양하였다.
- Sulforhodamine B (SRB), trypsin-EDTA, trizma base,trichloroacetic acid (TCA), baicalein, berberine hydrochloride, dimethyl sulfoxide (DMSO) 등은 Sigma사 (St. Louis, Mo., U.S.A.)에서, Penicillin-G, Streptomycin, Fetal bovine serum (FBS), Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), L-glutamine, RPMI 1640은 GIBCO-BRL사(Grand Island, New York, USA.)에서, 기타 시약들은 일급시약 등급 이상의 것들을 사용하였으며, 실험에 사용된 물은 탈이온 2차 증류수였다.
- 黃連解毒湯의 약재는 동국대학교 부속 한방병원에서 공급받았으며, 각 방제 한 첩 분량에 800 ㎖의 탈이 온 2차 증류수를 가하고 100 ℃로 가온된 상태에서 3시간 동안 전탕하여, 최종 80 ㎖의 탕액을 수거하였다. 탕액을 실온 정도로 냉각시킨 후, 멸균 청정 후드 내에서 0.
- 남성 호르몬 의존성 전립선암 세포주인 LNCaP 세포, 호르몬 비의존성 전립선암 세포주인 PC-3 및 DU-145 세포, 유방암 세포주인 MCF-7 세포, 폐암 세포주인 A549 세포, NCI-H292 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주인 K-562 세포 등은 모두 American Type Culture Collection사 (Manassas, VA, U.S.A.)에서 구입하였다.
데이터처리
- 통계처리는 unpaired Student's t-test로 하였으며,p<0.05인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 각 well 당 100 ㎕의 10 mM unbuffered Tris용액으로 SRB를 잘 녹여낸 후, 흡광분석 측정장치 (microplate reader)로 540㎚에서 각 well의 흡광도를 측정하였다. K-562 세포의 경우에는 여타 암세포들과는 달리 세포 배양용기에 부착된 상태에서 증식하지 않으므로, 상기의 방법을 사용하지 않고 direct cell counting 방법을 적용하였다. 즉,6 well plate의 각 well에 5×104개의 cell을 함유하는 배양액 1 ㎖를 가하여 37 ℃, 5% CO2 존재 하에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
- 1. 黃連解毒湯은 전립선암 (LNCaP, PC-3, DU-145), 유방암 (MCF-7), 폐암 (A549, NCI-H292) 만성 골수성 백혈병 (K-562) 등의 세포주에서 농도 의존적으로 유의성 있는 세포증식억제작용을 나타내었다.
- 2. 전립선암 및 유방암 세포주에 대한 baicalein 및 berberine 처리 결과, 두 물질 각각에 의해 黃連解毒湯 방제수준의 암세포 증식억제작용이 나타났다.
- Baicalein은 10 μM, 100 μM의 투여 농도에서 전립선암 세포인 LNCaP, PC-3, DU-145 및 유방암 세포인 MCF-7세포의 증식을 공히 유의하게 억제하였다 (Fig. 5).
- Berberine 역시 10 μM, 100 μM의 투여 농도에서 전립선암 세포인 LNCaP, PC-3, DU-145 및 유방암 세포인 MCF-7 세포의 증식을 공히 유의하게 억제하였다(Fig. 6).
- 가 보고되었다. LNCaP, PC-3, DU-145 세포에 농도별로 HDT를 투여한 결과 1%,10% 투여 시 LNCaP, PC-3, DU-145 세포들의 증식이 유의하게 억제된 것을 확인할 수 있었으며 (Fig. 1), 이는 전립선암의 치료에 있어 HDT의 활용이 의미가 있을 뿐 아니라, 호르몬 의존성 전립선암 세포인 LNCaP 세포보다 호르몬 비의존성인 PC-3와 DU-145세포의 성장이 근소하게 더 억제된 것으로 보아 (Fig. 1) HDT는 호르몬 비의존성 전립선암에 더 효과적임을 유추해볼 수 있다.
- 黃連解毒湯은 최종 추출물 0.1%, 1%, 10%의 투여농도에서 인간의 만성 골수성 백혈병 세포인 K-562 세포의 증식을 유의하게 억제하였다 (Fig. 4).
- 黃連解毒湯은 최종 추출물 1%, 10%의 투여 농도에서 남성 호르몬 의존성 전립선암 세포인 LNCaP 및 호르몬 비의존성 전립선암 세포인 PC-3, DU-145 세포의 증식을 유의하게 억제하였다 (Fig. 1).
- 黃連解毒湯은 최종 추출물 1%, 10%의 투여 농도에서 폐암 세포인 A549 및 NCI-H292 세포의 증식을 유의하게 억제하였다 (Fig. 2).
- 4). 따라서 HDT는 모든 암종에 효과를 보이나 특히 만성 골수성 백혈병 세포의 성장억제에 효과가 좋은 경향성을 나타내었다.
- 또한 동시에 전립선암 세포주 및 유방암 세포주에 대해 黃芩에 함유된 주요 성분인 baicalein 및 黃連 및黃柏에 함유된 주요 성분인 berberine을 처리한 결과, 두 물질 각각에 의해 黃連解毒湯의 방제수준에서와 유사한 암세포 증식억제작용이 발현되었다 (Fig. 5, 6). 이는 黃芩, 黃連, 黃柏의 주요 성분에 해당하는 baicalein,berberine의 단일 本草나 성분수준에서 뿐만 아니라 黃連解毒湯 자체, 즉 방제수준에서도 단일 성분들이 나타내는 항염증작용을 경유한 항암작용이 나타날 가능성을 시사함으로써, 黃連解毒湯이 기존의 임상적 응용대상질환인 급만성 염증성질환의 치료 뿐만 아니라 인체의 악성종양치료 및 예방목적으로도 응용될 가능성을 제시하고 있다.
- NCI-H292 세포도 폐암세포주로써 인간 기관지 상피에서 유래하여 뮤신분비에 관여하며 仙方敗毒湯의 투여가 세포의 유전자 발현과 뮤신생성을 억제하는 연구가 보고되었다54). 이러한 두 종류의 폐암세포주에 대한 HDT의 투여에서는 1%, 10% 농도의 투여에서 유의한 성장억제 효과를 나타내었고, 두 폐암세포 중에서는 A-549세포에서 NCI-H292보다 뚜렷한 세포성장 억제를 나타내었다 (Fig. 3). 그러므로 HDT의 투여가 폐암세포의 성장을 유효하게 억제하나 암종의 종류에 따라 반응도는 다르게 나타날 수 있음을 알 수 있다.
후속연구
- 따라서 이러한 연구결과를 바탕으로 향후 癌의 예방 및 치료와 관련된 다양한 in vivo수준의 연구가 이뤄지고, 黃連解毒湯 자체의 투여용량 및 투여기간의 조절 등을 통해 黃連解毒湯의 항암 혹은 발암예방작용을 객관적으로 증명하기 위한 심층적 후속연구가 필요할 것으로 생각된다.
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