P. carageenovora 유래 arylsulfatase 유전자(astA)의 효모표면발현 plasmid pCTAST(7.1 kb)를 구축하여 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였고, 선별된 형질전환체들을 YPDG 배지에서 배양했을 때 4-methylumbelliferyl sulfate를 분해하여 형광을 보였다. 이는 효모에서 arylsulfatase가 활성형으로 생산되었음을 의미하였다. S. cerevisiae EBY100/pCTAST를 플라스크 배양했을 때 arylsulfatase 활성은 galactose가 완전히 소모된 배양 48시간째 최대 활성인 1.2 unit/mL로 나타났으며 배양 상등액에서는 활성이 나타나지 않았다. 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase로 제조된 agarose를 agar와 시판용 agarose와 함께 ${\lambda}DNA$ HindIII marker를 사용하여 DNA 전기영동 성능을 비교 실험한 결과, agar보다는 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose가 이동성이나 분리능에서 우수하였으며, 시판용 agarose와 비교하여 이동성이나 분리능이 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 본 연구의 결과, 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 효소를 이용하여 한천으로부터 전기영동용 고순도 친환경적인 agarose 생물 생산 공정에 적용 가능함을 알 수 있었다.
P. carageenovora 유래 arylsulfatase 유전자(astA)의 효모표면발현 plasmid pCTAST(7.1 kb)를 구축하여 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였고, 선별된 형질전환체들을 YPDG 배지에서 배양했을 때 4-methylumbelliferyl sulfate를 분해하여 형광을 보였다. 이는 효모에서 arylsulfatase가 활성형으로 생산되었음을 의미하였다. S. cerevisiae EBY100/pCTAST를 플라스크 배양했을 때 arylsulfatase 활성은 galactose가 완전히 소모된 배양 48시간째 최대 활성인 1.2 unit/mL로 나타났으며 배양 상등액에서는 활성이 나타나지 않았다. 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase로 제조된 agarose를 agar와 시판용 agarose와 함께 ${\lambda}DNA$ HindIII marker를 사용하여 DNA 전기영동 성능을 비교 실험한 결과, agar보다는 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose가 이동성이나 분리능에서 우수하였으며, 시판용 agarose와 비교하여 이동성이나 분리능이 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 본 연구의 결과, 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 효소를 이용하여 한천으로부터 전기영동용 고순도 친환경적인 agarose 생물 생산 공정에 적용 가능함을 알 수 있었다.
In this study, the arylsulfatase gene (astA, 984 bp ORF) from Pseudoalteromonas carrageenovora genome was expressed on the cell surface of S. cerevisiae by fusing with Aga2p linked to the membrane anchored protein, Aga1p. The constructed plasmid, pCTAST (7.1 kb), was introduced to S. cerevisiae EBY1...
In this study, the arylsulfatase gene (astA, 984 bp ORF) from Pseudoalteromonas carrageenovora genome was expressed on the cell surface of S. cerevisiae by fusing with Aga2p linked to the membrane anchored protein, Aga1p. The constructed plasmid, pCTAST (7.1 kb), was introduced to S. cerevisiae EBY100 cell, and yeast transformants on YPDG plate showed the hydrolyzing activity for 4-methylumbelliferyl-sulfate and p-nitrophenyl-sulfate. When S. cerevisiae EBY100/pCTAST was grown on YPDG medium, the arylsulfatase activity of cell pellet reached about 1.2 unit/mL, whereas no extracellular arylsulfatase activity was detected. The DNA ladder in agarose prepared from agar by this recombinant arylsulfatase showed similar resolution and migration patterns with a commercial agarose. This results revealed that arylsulfatase expressed on the cell surface of S. cerevisiae could be applicable to the economic production of electrophoretic-grade agarose.
In this study, the arylsulfatase gene (astA, 984 bp ORF) from Pseudoalteromonas carrageenovora genome was expressed on the cell surface of S. cerevisiae by fusing with Aga2p linked to the membrane anchored protein, Aga1p. The constructed plasmid, pCTAST (7.1 kb), was introduced to S. cerevisiae EBY100 cell, and yeast transformants on YPDG plate showed the hydrolyzing activity for 4-methylumbelliferyl-sulfate and p-nitrophenyl-sulfate. When S. cerevisiae EBY100/pCTAST was grown on YPDG medium, the arylsulfatase activity of cell pellet reached about 1.2 unit/mL, whereas no extracellular arylsulfatase activity was detected. The DNA ladder in agarose prepared from agar by this recombinant arylsulfatase showed similar resolution and migration patterns with a commercial agarose. This results revealed that arylsulfatase expressed on the cell surface of S. cerevisiae could be applicable to the economic production of electrophoretic-grade agarose.
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문제 정의
이 단백질은 Aga1과 Aga2의 소단위체로 구성되어 있으며 Aga1 단백질이 β-glucan 결합으로 세포벽에 고정되고 69개의 amino acid로 이루어진 Aga2가 disulfide 결합을 하고 있다. 따라서 본 연구에서는 Aga2 단백질의 C 말단에 P. carageenovora 유래 arylsulfatase를 유전적으로 subcloning하여 효모 S. cerevisiae의 세포표면에 arylsulfatase 효소가 고정부착된 새로운 생체촉매제(biocatalyst)로부터 agarose를 생산함으로서, 유용 산업효소를 S. cerevisiae 세포표면에 발현하는 표면 발현 시스템을 구축하고자 한다. 또한 효모 S.
또한 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 효소를 이용하여 저렴한 agar로부터 고순도·친환경적인 agarose 생산에 적용하고자 한다.
제안 방법
cerevisiae EBY100에 형질전환시켜 uracil 결핍 최소배지(SD)에서 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주는 50 mM의 4-methylumbelliferyl sulfate(MUFS)가 함유된 YPDG 고체배지 상에서 arylsulfatase의 활성을 확인하였다. 확인 결과 host에서는 형광을 띄지 않는 반면, EBY100/pCTAST는 기질인 MUFS의 sulfate를 가수분해하여 형광을 띄는 4-methylumbelliferone을 생산하였다.
cerevisiae EBY100을 최적 배양 조건인 YPDG 배지, 30℃, 48시간 배양한 배양액을 원심분리 한 후 얻은 균체로 aryslulfatase 활성을 측정하였다. Arylsulfatase의 효소 활성은 p-nitrophenyl sulfate(pNPS)로부터 분리된 p-nitrophenol의 양으로 측정하였다. 반응액 700 µL(200 mM Tris-HCl buffer(pH 8.
P. carrageenovora 유래의 arylsulfatase 유전자(astA)를 galactose로 유도되는 표면발현 vector인 pCTcon(GAL1 promoter)에 subcloning하여 pCTAST(7.1kb)를 구축하였다(Fig. 1). 구축된 plasmid는 우선 E.
28 g-DCW/l). Plasmid 안정성은 배양액을 적당히 희석하여 YPD 평판배지에 도말한 후 자란 100개의 colony를 SD 선별배지로 toothpicking한 다음 형성된 colony 수의 비(백분율)로 측정하였다.
cerevisiae shuttle vector인 pCTcon(각각 NheI/BamHI으로 미리 절단)에 재조합하여 E. coli DH5α를 숙주세포로 CaCl2법으로 형질전환하여 재조합 plasmid pCTAST(7.1 kb)을 구축하였다.
구축된 plasmid는 우선 E. coli DH5α에 형질전환하여 증폭, 추출한 후 LiCl법을 사용하여 S. cerevisiae EBY100에 형질전환시켜 uracil 결핍 최소배지(SD)에서 1차 선별하였다.
67% Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, 2% dextrose)를 사용하였고, 50 mM의 4-methylumbelliferyl sulfate(MUFS)를 첨가한 YPDG(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose) 고체배지 상에서 arylsulfatase의 활성을 확인하였다. 또한 재조합 arylsulfatase의 표면발현을 위해 재조합 효모의 발효조 배양은 유도적 promoter인 GAL1 promoter를 가진 pCTcon vector와 재조합된 유전자의 발현를 위해 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose)를 사용하여 배양하였다. 재조합 효모 균주의 전배양은 SD 배지로 하였으며 flask 배양 시 접종양은 5~6.
이때 agar(Junsei Co., Japan)와 시판용 agarose(Cambrex Co., USA)로 0.6% 겔을 만들어 같은 DNA marker로 전기영동하여 DNA 해상도와 이동도의 성능을 비교·분석하였다.
Anti-c-myc(1차항체)와 FITC(2차항체)로 labeling 후 Immunofluorescence microscopy로 관찰한 결과, EBY100/pCTAST는 뚜렷한 형광을 나타낸 반면, EBY100(control)은 그렇지 않았다. 이러한 결과를 통하여 표층발현유무를 확인하였다(Fig. 3).
이렇게 제조된 agarose를 0.6% 농도로 겔을 만든 다음, λDNA HindIII marker(Takara Co. Japan)를 사용하여 DNA 전기영동을 하였다.
재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pCTAST를 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose)에서 flask 배양하여 균체증식과 arylsulfatase 발현 양상을 조사하였다. 그 결과 배양 30시간까지 균체증식은 활발하였으며, galactose가 완전히 소모되어지는 배양 42시간에 정지기에 들어갔다.
4-nitrophenyl sulfate(pNPS)를 기질로 하였다. 재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pCTAST와 대조구인 S. cerevisiae EBY100을 최적 배양 조건인 YPDG 배지, 30℃, 48시간 배양한 배양액을 원심분리 한 후 얻은 균체로 aryslulfatase 활성을 측정하였다. Arylsulfatase의 효소 활성은 p-nitrophenyl sulfate(pNPS)로부터 분리된 p-nitrophenol의 양으로 측정하였다.
또한 재조합 arylsulfatase의 표면발현을 위해 재조합 효모의 발효조 배양은 유도적 promoter인 GAL1 promoter를 가진 pCTcon vector와 재조합된 유전자의 발현를 위해 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose)를 사용하여 배양하였다. 재조합 효모 균주의 전배양은 SD 배지로 하였으며 flask 배양 시 접종양은 5~6.5%(v/v)로 하였다. Flask 배양에서는 500 mL baffled-flask(working volume; 100 mL)로 30℃, 190 rpm에서 수행하였다.
sense primer 부위에는 NheI 서열을 가지며, anti-sense primer에는 BamHI 서열을 가지고 있다. 주형 DNA로 P. carrageenovora의 arylsulfatase 유전자를 함유한 pHCEAST을 사용하여 Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400(USA)에서 1kb의 성숙 단백질 유전자 단편(astA)만을 대량 증폭하였다. 증폭된 astA 단편은 pCTcon에 NheI/BamHI으로 연결하여 E.
증폭된 astA 단편은 pCTcon에 NheI/BamHI으로 연결하여 E. coli DH5α를 숙주세포로 CaCl2법으로 형질전환하여 astA 단편을 확보하였다.
효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 효소를 이용하여 저렴한 agar로부터 고순도·친환경적인 agarose 생산에 적용 가능성을 확인하기 위하여 재조합 arylsulfatase로 제조된 agarose를 agar와 시판용 agarose와 함께 λDNA HindIII marker를 사용하여 DNA 전기영동 성능을 비교 실험하였다.
효모 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 SD 배지(0.67% Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, 2% dextrose)를 사용하였고, 50 mM의 4-methylumbelliferyl sulfate(MUFS)를 첨가한 YPDG(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose) 고체배지 상에서 arylsulfatase의 활성을 확인하였다. 또한 재조합 arylsulfatase의 표면발현을 위해 재조합 효모의 발효조 배양은 유도적 promoter인 GAL1 promoter를 가진 pCTcon vector와 재조합된 유전자의 발현를 위해 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose)를 사용하여 배양하였다.
효모에서의 표면발현을 위한 재조합 plasmid의 구축은 PCR를 통해 확보된 P. carageenovora의 astA 유전자와 pCTcon를 각각 NheI/BamHI으로 처리하여 Gel extraction kit(Bioprogen Co., USA)로 정제하였다. 얻어진 astA 단편을 GAL1 promoter와 AGA2 gene를 함유한 E.
대상 데이터
한천을 탈황시켜 agarose를 제조하기 위해 YPDG 배지를 사용하여 30℃에서 48시간 배양 후 원심분리로 균체만 모아서 arylsulfatase 조효소액을 얻었다. 0.6% 한천(Junsei, Japan) 용액에 20 unit/mL arylsulfatase 조효소로 40℃에서3시간 반응 시킨 후 300 mL의 acetone으로 침전시키고 3배양의 증류수로 세척한 다음 동결견조하여 분말상태로 만들었다. 이렇게 제조된 agarose를 0.
5)에서 수행하였다. 4-nitrophenyl sulfate(pNPS)를 기질로 하였다. 재조합 균주 S.
coli 숙주세포는 DH5α를 사용하였다. Arylsulfatase 유전자 공여 plasmid는 P. carageenovora의 arylsulfatase 유전자를 cloning한 pHCEAST를 사용하였다[23]. 효모 S.
primers의 제작은 5'-AACTGAGAATTCATGAGAAGATGGCT TTCG-3'(sense primer)와 5'-GCCTCGAGGTCGACGTTC TGCCAATCCACTAT-3'(anti-sense primer)로 제작하였다.
또한 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 DH5α를 사용하였다.
본 연구에 사용된 단백질은 효모세포벽에 N말단이 공유결합된 형태로 존재하는 α-agglutinin을 사용하였다.
본 연구에 사용한 arylsulfatase 발현용 S. cerevisiae 균주는 모두 uracil 영양요구성 변이주이며 haploid로 S. cerevisiae EBY100(MATα ura3-52 trp1 leu2-∆1 his3∆200 pep4::HIS3 prb1∆1.6R can1 GAL1)을 사용하였다.
한천을 탈황시켜 agarose를 제조하기 위해 YPDG 배지를 사용하여 30℃에서 48시간 배양 후 원심분리로 균체만 모아서 arylsulfatase 조효소액을 얻었다. 0.
이론/모형
구축된 재조합 plasmid는 E. coli DH5α로부터 증폭, 추출하여 LiCl법으로 효모 숙주세포 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였다.
, USA)를 2차 항체(1:100)로 4℃, 1시간 반응 후 세척하였다. 면역항체 염색한 균체의 형광 분석은 confocal laser scanning microscope(Carl Zeiss, LSM 510 META, Germany)를 이용하였다.
성능/효과
면역항체 염색한 균체의 형광 분석은 confocal laser scanning microscope(Carl Zeiss, LSM 510 META, Germany)를 이용하였다. Anti-c-myc(1차항체)와 FITC(2차항체)로 labeling 후 Immunofluorescence microscopy로 관찰한 결과, EBY100/pCTAST는 뚜렷한 형광을 나타낸 반면, EBY100(control)은 그렇지 않았다. 이러한 결과를 통하여 표층발현유무를 확인하였다(Fig.
cerevisiae EBY100/pCTAST를 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose)에서 flask 배양하여 균체증식과 arylsulfatase 발현 양상을 조사하였다. 그 결과 배양 30시간까지 균체증식은 활발하였으며, galactose가 완전히 소모되어지는 배양 42시간에 정지기에 들어갔다. Arylsulfatase 활성은 galactose가 소모되는 배양 6시간부터 증가하기 시작하여 galactose가 완전히 소모된 직후인 배양 48시간째에 최대 활성에 도달하였다.
Arylsulfatase 활성은 galactose가 소모되는 배양 6시간부터 증가하기 시작하여 galactose가 완전히 소모된 직후인 배양 48시간째에 최대 활성에 도달하였다. 또한 plasmid 안정성은 배양말기에서도 90% 이상 안정하게 유지되었다. Arylsulfatase의 최대 활성은 1.
cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose가 이동성이나 분리능에서 우수하였다. 또한 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose는 시판용 agarose와 비교하였을 때 이동성이나 분리능이 유사한 결과를 확인할 수 있었다(Fig. 5). 최근 연구 결과에 따르면 E.
cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 효소를 이용하여 저렴한 agar로부터 고순도·친환경적인 agarose 생산에 적용 가능성을 확인하기 위하여 재조합 arylsulfatase로 제조된 agarose를 agar와 시판용 agarose와 함께 λDNA HindIII marker를 사용하여 DNA 전기영동 성능을 비교 실험하였다. 실험 결과 agar와 비교하여 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose가 이동성이나 분리능에서 우수하였다. 또한 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose는 시판용 agarose와 비교하였을 때 이동성이나 분리능이 유사한 결과를 확인할 수 있었다(Fig.
4). 이러한 결과를 통하여 발현된 arylsulfatase는 대부분 효모 표면발현됨을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 바탕으로 본 연구에서 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase는 한천으로부터 고순도·친환경적인 agarose를 직접 생산하는 생물 생산 공정에 효율적으로 적용가능하며, 기존 agarose의 정제 공정에 비교하여 유기용매와 계면활성제의 사용을 획기적으로 감소시킴으로써 공정비용 절감에도 크게 기여할 수 있음을 확인하였다.
1차 선별된 균주는 50 mM의 4-methylumbelliferyl sulfate(MUFS)가 함유된 YPDG 고체배지 상에서 arylsulfatase의 활성을 확인하였다. 확인 결과 host에서는 형광을 띄지 않는 반면, EBY100/pCTAST는 기질인 MUFS의 sulfate를 가수분해하여 형광을 띄는 4-methylumbelliferone을 생산하였다. 이는 형질전환체 EBY100/pCTAST가 desulfatase 활성을 보임을 의미하였고, 이는 효모에서 P.
후속연구
따라서 agaropectin에서 sulfate를 제거할 수 있는 arylsulfatase를 대량생산하는 생물학적 생산 공정을 도입·적용하여 한천으로부터 고순도 agarose를 직접 생산할 수 있다면 유기용매와 계면활성제의 사용을 획기적으로 감소시킴으로써 공정비용을 절약할 수 있을 것으로 사료된다[11, 23, 26].
뿐만 아니라 polyethlene glycol(PEG) 또는 cetylpyridium chloride(CPC)를 이용한 다양한 agarose의 고순도 정제 방법들이 연구·보고되었다[8]. 본 연구에서 효모 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose 역시 황산기 함량과 gel 강도에 있어서 상업적 agarose와 비슷한 수치를 보일 것으로 예상이 된다. 이상의 결과를 바탕으로 본 연구에서 효모 S.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
표면발현 시스템은 어떻게 이용되는가?
세포 표면은 내부와 외부사이의 상호작용으로 인해 기능을 하게 되는데 어떤 표면 단백질들은 plasma membrane을 지나서 기능을 하며, 또 다른 것들은 공유결합이나 비공유결합에 의한 세포표면 구성요소에 의해 결합한다[24]. 이러한 표면발현기술은 초기에는 미생물의 표면에 다양한 항원성 또는 항체성의 polypeptide를 노출시켜 항원 항체의 스크리닝에 목적을 두고 개발되었으며 각종 peptide 항원 library의 제조, 다양한 생백신(live vaccine)의 제조에 이용되고 있다[4, 10, 34]. 뿐만 아니라 세포표면에 다양한 생리활성효소나 금속이온 결합단백질의 고정화를 통하여 고부가 가치의 물질생산을 위한 전세포 생물촉매(whole cell biocatalyst)의 개발 등 그 이용성이 매우 다양하다[13, 28, 33]. 최근에는 원핵세포를 이용한 표면발현의 단점을 보완하기 위하여 진핵세포인 효모 S.
한천이란?
한천(agar)은 갈조류나 홍조류 등의 해조류에 다량으로 함유되어 있는 점질성의 화합물(다당류)이며, galactose 중합체로 구성된 약 70%의 agarose와 이들에 황산기가 부착된 상태인 약 30%의 agaropectin으로 구성되어 있다[2, 7, 9, 14, 25, 30, 32, 35]. 한천에 결합되어 있는 황산기는 실질적으로 음전하를 띠고 있으므로 전기장 하에서 물질의 이동에 영향을 줄 뿐만 아니라 겔 강도를 약화시킨다[29].
한천에 결합한 황산기는 어떤 영향을 주는가?
한천(agar)은 갈조류나 홍조류 등의 해조류에 다량으로 함유되어 있는 점질성의 화합물(다당류)이며, galactose 중합체로 구성된 약 70%의 agarose와 이들에 황산기가 부착된 상태인 약 30%의 agaropectin으로 구성되어 있다[2, 7, 9, 14, 25, 30, 32, 35]. 한천에 결합되어 있는 황산기는 실질적으로 음전하를 띠고 있으므로 전기장 하에서 물질의 이동에 영향을 줄 뿐만 아니라 겔 강도를 약화시킨다[29]. 따라서 전기영동으로 사용되는 한천의 제조법은 여러 단계의 유기 용매 분획을 통하여 한천중의 황산기가 부착된 agaropectin을 제거함으로써 agarose 순도를 높여 의학과 생명공학 분야에 광범위하게 사용되고 있다[11, 12, 14, 15, 17].
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