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문제 정의
- 분배 및 정제 조건이 확립되었으므로 시료 추출용매를 선정하고자 하였다. 추출 용매로는 농약의 잔류분석법에서 널리 사용되고 있는 acetone, acetonitrile, methanol의 적용 성을 검토하였다.
- 따라서 soxhlet 추출, 가열환류장치 사용, 정제과정의 복잡함 등에 의해 prochloraz의 분석이 복잡하고, 시간이 오래 걸리며 회수율도 일정하지 못한 단점이 있다. 하지만, 생산단계 농약잔류허용 기준 설정연구 보고서(2009)등에 soxhlet 추출 대신에 단순 용매 추출을 이용한 보고가 있고4,5), 또한 가열환류장치도 소규모로 만들어 시도한 보고5)가 있어서 본 연구에서는 단순용매추출 방법을 이용하고, 소규모로 가수분해 장치를 활용하며, 정제과정을 최소한으로 줄여 시간과 시약, 용매를 절약한 간편하고 신뢰성 높은 분석법으로 개선하여 대표작물을 선정하여 적용성을 확보함으로써 prochloraz 잔류분석의 범용성과 효율성을 극대화하고자 하였다.
제안 방법
- 0%, 1% 및 5% methanol/ dichloromethane 각각 10 mL로 용리 시킨 후 용리액을 농축시켜 acetone 1 mL로 재정용하고, 1 μL를 GC-ECD로 분석하였다.
- 2 mL를 가하였다. 40℃ 이하의 수욕조에서 감압농축 한 뒤 농축잔사를 5 mL acetone에 재용해하여 GC-ECD로 분석 하였다. 위와 같은 방법으로 dichloromethane 50 mL로 두 번 더 추출하여 같은 방법으로 기기분석을 행하여 분배과정의 용매에 따른 회수율을 계산하였다.
- 2 mL를 가하였다. 40℃이하의 수욕조에서 감압농축 후 농축잔사를 5 mL acetone 에 재용해하여 GC-ECD로 분석 하였다. 위와 같은 방법으로 각각의 분배 용매 50 mL로 두 번 더 추출하여 같은 방법으로 기기분석을 행하여 세 번 분배의 분배효율도 구하여 분배 과정의 용매에 따른 분배추출효율을 계산하였다.
- Dichloromethane 10 mL로 활성화 시킨 NH2 cartridge 에 상기 용액 5 mL 중 1 mL을 가한 다음 1% methanol/ dichloromethane 10 mL로 용리 시킨 후 용리액을 농축시켜 acetone 5 mL 재정용 하였고 1 μL를 GC-ECD로 분석하였다.
- Prochloraz를 TCP로 전환하여 분석하는 prochloraz의 잔류분석방법을 개선 확립하였다. 기존의 분석법 중 soxhlet 추출 부분과 가열환류장치 사용을 배제하고 각각 간편한 용매추출과 소규모 가열분해법으로 대체해서 시험과정을 간편, 신속화 하여 재현성을 높였다.
- TCP 표준용액 0.005 ppm을 연이어 6번 GC-ECD에 2μL씩 주입하여 크로마토그램 상의 머무름 시간(tr), peak의 면적(Area), peak 높이(height)의 변이를 비교 검토하였다.
- TCP 표준용액 0.005~0.1 ppm을 2 μL씩 GC-ECD에 주입하여 크로마토그램의 signal과 noise의 비를 구하여 LOD 및 LOQ를 계산하였다.
- Prochloraz를 TCP로 전환하여 분석하는 prochloraz의 잔류분석방법을 개선 확립하였다. 기존의 분석법 중 soxhlet 추출 부분과 가열환류장치 사용을 배제하고 각각 간편한 용매추출과 소규모 가열분해법으로 대체해서 시험과정을 간편, 신속화 하여 재현성을 높였다. 대표농산물 중 prochloraz의 분석정량한계(MQL)는 0.
- 분배 추출액을 무수 sodium sulfate에 통과 시켜 수분을 제거하고 40℃ 이하에서 감압농축 하였다. 농축잔사를 5 mL acetone에 재용해하여 GC-ECD로 분석하여 회수율을 구하였다. 위와 같은 방법으로 각각의 분배 용매 50 mL로 두 번 더 추출하여 동일한 방법으로 기기분석을 통해 세 번 분배의 분배효율을 구하여 분배과정의 용매에 따른 분배 추출효율을 계산하였다.
- 특히 기존의 soxhlet 법을 사용하지 않고 단순용매 추출로 대체하기 때문에 정확한 추출법을 마련해야한다. 따라서 다음과 같이 prochloraz의 정제조건(SPE cartridge)과 분배 조건을 확립한 다음 추출용매를 선정해서 prochloraz 의 전체적 추출법을 확립하였다.
- 또한 사과시료에 prchloraz 표준용액(1mg/L) 1 mL을 가하고 1% methanol/dichloromethane 10 mL 로 용리 시킨 후 용리액을 농축시켜 acetone 1 mL로 재정용, 1 μL를 GC-ECD로 분석하였다.
- 마쇄한 농산물 시료 25 g 에 10 MQL(0.1 mg/kg)과 50 MQL(0.5 mg/kg)에 해당하는 prochloraz 표준용액을 가한 다음 100 mL의 acetonitrile을 가하여 30분 동안 진탕추출하였다. 추출물을 흡입여과하고, 50 mL acetonitrile으로 잔사 및 용기를 씻어내어 앞의 여액과 합하였다.
- 40℃ 이하의 수욕조에서 감압농축 한 뒤 농축잔사를 5 mL acetone에 재용해하여 GC-ECD로 분석 하였다. 위와 같은 방법으로 dichloromethane 50 mL로 두 번 더 추출하여 같은 방법으로 기기분석을 행하여 분배과정의 용매에 따른 회수율을 계산하였다.
- 40℃이하의 수욕조에서 감압농축 후 농축잔사를 5 mL acetone 에 재용해하여 GC-ECD로 분석 하였다. 위와 같은 방법으로 각각의 분배 용매 50 mL로 두 번 더 추출하여 같은 방법으로 기기분석을 행하여 세 번 분배의 분배효율도 구하여 분배 과정의 용매에 따른 분배추출효율을 계산하였다.
- 농축잔사를 5 mL acetone에 재용해하여 GC-ECD로 분석하여 회수율을 구하였다. 위와 같은 방법으로 각각의 분배 용매 50 mL로 두 번 더 추출하여 동일한 방법으로 기기분석을 통해 세 번 분배의 분배효율을 구하여 분배과정의 용매에 따른 분배 추출효율을 계산하였다.
- 이를 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 mg/L의 농도가 되도록 차례로 희석하고, TCP는 2 μL, prochloraz는1 μL를 GC-ECD에 주입하여 peak의 면적을 기준으로 표준 검량선을 작성하였다.
- 잔류물에5 mL acetone로 재용해하여 2 μL을 GC-ECD로 분석 하였다.
- 분배 및 정제 조건이 확립되었으므로 시료 추출용매를 선정하고자 하였다. 추출 용매로는 농약의 잔류분석법에서 널리 사용되고 있는 acetone, acetonitrile, methanol의 적용 성을 검토하였다. 사과 시료에 표준용액을 첨가하고 각 용매의 추출효율을 비교한 결과 acetonitrile과 acetone에서 우수한 결과를 나타내었으며 그 중 간섭물질의 방해가 적은 acetonitrile으로 선정하였다(Table 6.
- 5 mg/kg 수준이 되게 첨가하여 1시간 방치하였다. 추출용매인 acetone, acetonitrile, methanol 각각 100 mL을 가하고, 1시간 동안 진탕추출 한 다음 감압여과 하였다. 잔사를 500 mL 분액여두에 옮긴 후, 포화식염수 50 mL, 증류수 100 mL, dichloromethane 50 mL로 두 번 분배하여 합하였다.
대상 데이터
- Acetone, dichloromethane, methanol은 HPLC급(B&J ACS)을, acetonitrile, dichloromethane, ethyl acetate, hexane은 EP급(Samchun chemical)을 사용하였다.
- Prochloraz와 2,4,6-trichlorophenol (TCP) 표준품은 순도 95% 이상의 분석용 표준품을 Chem Service로부터 구입하여 사용하였다. Acetone, dichloromethane, methanol은 HPLC급(B&J ACS)을, acetonitrile, dichloromethane, ethyl acetate, hexane은 EP급(Samchun chemical)을 사용하였다.
- 또한 sodium chloride, 무수 sodium sulfate, acetic acid는 GR급을 사용하였다. Pyridine hydrochloride는 tokyo chemical industry의 제품을, diethylene glycol은 duksan pharmaceutical 제품을 사용하였다. Solid phase extraction (SPE) cartridge는 waters사의 NH2 (6cc, 1g) cartridge을 사용하였다.
- Pyridine hydrochloride는 tokyo chemical industry의 제품을, diethylene glycol은 duksan pharmaceutical 제품을 사용하였다. Solid phase extraction (SPE) cartridge는 waters사의 NH2 (6cc, 1g) cartridge을 사용하였다. 농축기는 Buchi rotavapor R-114 (Switzerland)를 사용하였고, 농산물 시료는 믹서기(한일, HMF-1000A)를 이용하여 마쇄하였다.
- Acetone, dichloromethane, methanol은 HPLC급(B&J ACS)을, acetonitrile, dichloromethane, ethyl acetate, hexane은 EP급(Samchun chemical)을 사용하였다. 또한 sodium chloride, 무수 sodium sulfate, acetic acid는 GR급을 사용하였다. Pyridine hydrochloride는 tokyo chemical industry의 제품을, diethylene glycol은 duksan pharmaceutical 제품을 사용하였다.
- 추출 용매로는 농약의 잔류분석법에서 널리 사용되고 있는 acetone, acetonitrile, methanol의 적용 성을 검토하였다. 사과 시료에 표준용액을 첨가하고 각 용매의 추출효율을 비교한 결과 acetonitrile과 acetone에서 우수한 결과를 나타내었으며 그 중 간섭물질의 방해가 적은 acetonitrile으로 선정하였다(Table 6.). 이상의 과정으로서 soxhlet을 사용하지 않고 용매만 사용하여 농작물 시료에서 prochloraz를 효율적으로 추출할 수 있는 방법이 확립되었다.
- ) 중 채소에서 배추, 고추를, 과일에서 사과, 감귤을 곡류에서 현미를 대표 작물로 선정하였다. 선정한 농산물의 무농약 시료는 무농약 재배가 확인된 유기농 수확물을 농가에서 직접 구매하거나 할인매장에서 구입하였다.
- 한국보건산업진흥원의 식품의 농약 잔류허용기준(2009)에 Prochloraz를 대상성분으로 등록되어있는 농산물(Table 2.) 중 채소에서 배추, 고추를, 과일에서 사과, 감귤을 곡류에서 현미를 대표 작물로 선정하였다. 선정한 농산물의 무농약 시료는 무농약 재배가 확인된 유기농 수확물을 농가에서 직접 구매하거나 할인매장에서 구입하였다.
이론/모형
- 작물 중 TCP의 분석은 GC는 HP6890(Hewlett packard) 모델을 사용하였고, 컬럼은 DB-5, 검출기는 ECD를 이용하여 등온조건으로 분석하였다(Table 1).
성능/효과
- TCP 표준용액(0.005~1 ppm)을 분석하여 얻은 검량선의 회귀방정식은 y=21988x-157.54 (R2=0.9996)로 직선성이 우수하였고, prochloraz 표준용액(0.005~1 ppm)을 분석하여 얻은 검량선의 회귀방정식도 y=4147x + 35.89 (R2=0.9998)로 직선성이 우수하였다.
- TCP의 분석정량한계는 0.005 mg/kg으로 계산되었고 여기에 prochloraz로 환산하는 환산계수 1.906을 곱하여 prochloraz의 분석정량한계는 0.01 mg/kg로서 잔류분석법 기준에 적합하였다.
- n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate의 세 용매로 각각 50 mL씩 세 번(50 mL × 3) 분배한 결과(Table 5.), dichloromethane으로 1차, 2차에 걸쳐 추출한 회수율이 108.9% 로 대상성분의 전량회수가 가능하였다.
- 정량한계는 기기 상으로 신뢰성 있게 정량할 수 있는 한계로서, 크로마토그램 상에서 signal과 noise의 비가 10배 이상(LOD의 3-5배 이상)을 나타내는 농약의 양을 의미 한다10,11). 다양한 농도의 표준 용액을 분석하여 S/N비를 구한 결과, TCP의 정량한계는 0.01 ng이었다.
- 이미 언급했듯이, prochloraz를 TCP로 분해해서 분석하기 때문에 분해반응액 중 TCP의 추출이 제대로 이루어져야 전체적인 회수율을 확보할 수 있다. 따라서 분해반응액 중 TCP의 분배 추출 조건을 확립하기 위해 우선 증류수에 TCP를 첨가한 다음 n-hexane, dichloromethane 및 ethyl acetate의 적용성을 검정한 결과 dichloromethane으로 2회 추출함으로써 70%이상의 회수가 가능하였다(Table 7).
- ). 따라서 이상의 결과에서 확립된 전체 개선 분석법은 잔류허용기준이 설정된 31 종의 농산물 에 충분히 적용이 가능함을 알 수 있었다.
- ). 또한 이상의 결과를 토대로 사과 추출액에 표준용액을 첨가하고 1% methanol/dichloromethane으로 정제한 결과 108.4% 회수율을 보였다.
- 마쇄한 무처리 시료에 prochloraz 표준용액을 10 MQL 50 MQL이 되도록 첨가하고, 전체적으로 확립한 방법으로 3회 반복하여 분석한 결과(Table 8.), 10 MQL수준에서는 105-113%, 50 MQL 수준에서는 82-87%의 양호한 회수율을 보였고, 정밀성도 양호하여(CV<7%) 분석성분, 처리수준 및 농산물 시료 종류에 관계없이 회수율 및 분석오차는 잔류 분석기준인 70 -120% 범위와 분석오차 10 % 이내를 만족하였다(Table 8.).
- 분석의 재현성을 알아보기 위해 본 연구에서 설정한 정량 한계 양(0.01 ng)을 연속으로 6번 분석한 결과 머무름 시간 (tr), peak의 면적(Area), peak 높이(Height)간의 오차가 작아 매우 기기가 안정적이고 정밀한 분석을 수행할 수 있음을 확인하였다(Table 3.).
- 위의 결과를 이용해서 실제 가수분해 반응액에서의 TCP 추출효율을 보기 위해 가수분해반응 최종액에 TCP 표준용액을 처리하고 위에서 선정한 dichloromethane 50 mL로 2회 분배한 결과 회수율은 85.1%로 양호하였다. 또한 이러한 TCP로의 분해과정 중에서 일반적으로 크기가 크고 설치가 복잡한 환류장치를 배제하고 작은 vial(Fig.
- ). 이상의 과정으로서 soxhlet을 사용하지 않고 용매만 사용하여 농작물 시료에서 prochloraz를 효율적으로 추출할 수 있는 방법이 확립되었다.
- 정제과정에서의 prochloraz의 회수율을 확인하기 위하여 NH2 cartridge에 표준용액을 첨가하여 회수율을 확인하였으며 0%, 1%, 및 5% methanol/dichloromethane 혼합액으로 용리한 결과 0-1% 혼합액에서 좋은 회수율을 얻을 수 있었다(Table 4.). 또한 이상의 결과를 토대로 사과 추출액에 표준용액을 첨가하고 1% methanol/dichloromethane으로 정제한 결과 108.
- 01 mg/kg이었다. 회수율은 82-113%로 처리수준 및 농산물 시료 종류에 관계없이 회수율 및 분석오차는 잔류분석기준인 70 - 120% 범위와 분석오차 10%이내를 만족하였다.
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