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문제 정의
- 그럼에도 불구하고 FA에 의한 이들 단백질들의 조절 기전은 아직까지 알려져 있지 않고 있다. 따라서 본 실험에서는 사람 간세포주를 이용하여 새집증후군의 후보물질인 FA가 간세포 사멸에 미치는 효과와 이와 관련된 신호전달계중 산화성 스트레스 및 관련 단백질 발현 관련성에 대해 알아보았다.
제안 방법
- FA의 간세포 사멸 효과를 측정하기 위하여 LDH 방출측정 kit를 이용하여 실시하였다. HepG2 세포주를 1 × 105 cells/mL로 맞춘 후, 100 μL씩 96 well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
- FA의 간세포 사멸 효과를 측정하기 위하여 MTT 환원 실험을 실시하였다. 세포주를 96-well plate에 1 × 105 cells/mL의 농도로 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 FA를 처리하여 24시간 배양하였다.
- 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 각각을 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포 독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조구와 비교한 값을 나타내었다.
- 간세포 사멸에 대한 FA의 농도별 효과를 알아보기 위하여, FA를 농도별(0 - 1 mM)로 처리한 MTT assay를 실시하였다. 실험 결과 Fig.
- 그 후, membrane을 0.1% Tween-20/1×TBS에 10분 간격으로 3번 세척 하였고, membrane을 1% skim milk에 5,000배 희석된 horseradish-peroxidase labeled 2차 항체에 1시간 동안 배양한 후, 3번 세척을 거쳐서 Enhanced Chemiluminoscent (ECL) 시약을 1분간 처리한 다음 X-ray 필름에 30초간 노출시켜 현상하였다.
- 포름알데히드는 새집 증후군 유발 및 농약 노출 시에 나타나는 중요한 물질로 호흡기에 대한 효과는 많이 알려져 있지만 간세포에서의 세포 자멸사에 대한 연구는 전혀 알려져 있지 않고 있다. 그래서 사람 간세포주인 HepG2 세포를 이용하여 포름알데히드에 의한 세포 자멸사 연구를 실시하였다. 실험 결과 포름알데히드는 세포 생존율을 감소 시켰으며, 이러한 반응은 항산화제인 vitamin E 및 NAC 처리시 차단되었다.
- 반응 후 well 바닥 에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 μL 첨가하여 ELISA reader(Model 680, BioRad, Hercules, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구 세포수를 100%로 하여 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 배지를 제거한 HepG2세포를 phosphate buffered saline (PBS)로 2번씩 세척한 후, 각기 150 μL의 lysis buffer (10× PBS, 1% NP-40, 20% SDS, 0.5 M EDTA, 0.01 M PMSF, 10 mg/ml Leupeptin, 1 mg/ml pepstatin A)를 처리하여 균질화를 시켰다.
- 산화성 스트레스와의 관련성을 알아보기 위하여 lipid peroxide (LPO) 형성을 측정하였다. FA는 산화성 스트레스를 증가 시켰으며 이러한 작용은 항산화제인 vitamin E (1 mM) 및 NAC (100 μM)에 의해 차단되는 것으로 나타났다 (Fig.
- 이들 세포들은 5% Fetal bovine Serum (FBS)를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Life Technologies, Grand Island, NY)에 배양하였다. 이들 세포들이 70% confluence되었을 때 세포성장을 정지시키기 위해 무혈청 배지에서 이틀을 배양하여 세포의 성장을 동기화 시켜서 실험에 이용하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Bax, Bcl-2, caspase-3, 및 beta actin 항체는 Cell Signaling technology (Herts, UK)에서 구입하였다.
- Dulbecco's Modified Eagle's Medium(D-MEM)-nutrient mixture F-12(D-MEM/F-12) 와 Class IV collagenase은 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다.
- HepG2세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 이들 세포들은 5% Fetal bovine Serum (FBS)를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Life Technologies, Grand Island, NY)에 배양하였다.
- Dulbecco's Modified Eagle's Medium(D-MEM)-nutrient mixture F-12(D-MEM/F-12) 와 Class IV collagenase은 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. MTT assay kit, penicillin 및 streptomycin는 Sigma Chemical Company(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Bax, Bcl-2, caspase-3, 및 beta actin 항체는 Cell Signaling technology (Herts, UK)에서 구입하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 통계적 처리는 Student's t test 및 Analysis of Variance (ANOVA)로 하였으며, P 값 <0.05 을 유의한차이의 한계로 하였고, 실험결과의 표현은 means±S.E. 로 하였다.
이론/모형
- 균질화된 세포를 tube에 옮긴 후, 15,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 새로운 tube에 저장하였다. Bradford 단백질 정량법 (Bradford, 1976)을 이용하여 각각 60 ㎍의 sample들을 8% SDS-PAGE 전기영동을 시킨 후, polyvinylidine difluoride membrane에 transfer하였다. Membrane은 5% skim milk에 1시간 동안 차단을 시켰고, 각각의 항체 (Bcl-2, Bax, caspase-3, beta actin)를 1% skim milk에 1,000배 희석하여 4℃에서 18시간 이상 배양하였다.
- 단백질의 thiol group은 Albano 등10)의 방법에 의거 Ellman 시약을 이용하여 측정하였다. 세포를 수확한 후에 원심분리를 한 후 PBS로 세척하였다.
성능/효과
- 세포사멸 실행 단백질인 casapse-3의 활성형 역시 증가하였으며, 항산화제 처리시 차단되었다. 따라서 포름알데히드는 사람 간세포에서 산화성 스트레스 증가를 통해 세포 자멸사를 일으키는 것으로 나타났다.
- GSH (Glutathione)는 hydrogen peroxidase를 H2O로 환원시켜서 산화성 스트레스에 대하여 세포를 보호하는 내인성 효소이다13). 본 실험에서 FA 처리시 산화성 스트레스는 증가를 하였으며, GSH 수치는 감소하였다. 본 연구결과는 Teng 등14)에 의해서 보고된 분리된 쥐 간세포에 포름알데히드 처리시 산화성 스트레스의 증가가 유도되었으며 GSH수치의 감소가 야기되었다는 보고와 일맥상통 하였다.
- 본 실험에서는 FA에 의한 산화성 스트레스 발생이 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2 발현 및 Bax 활성에 직접적으로 미치는 영향을 조사하지 않았지만 포름알데히드에 의한 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3의 활성형 증가 작용이 항산화제인 vitamin E 및 NAC에 의해서 차단되는 것으로 보아 이들의 활성이 Bcl-2를 억제하고 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 활성을 증가 할 것으로 추측된다. 이러한 결과는 산화성 스트레스가 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3 발현을 조절함으로써 세포 사멸에 깊숙이 관여하는 것으로 판단된다.
- 본 실험에서는 NAC 및 Vitamin E 처리 시 FA에 의한 Bcl-2 억제 및 Bax 증가 및 caspase-3의 증가가 차단되었다. 이는 FA에 의한 산화성 스트레스 유발이 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 활성을 증가시키고 Bcl-2 단백질 발현을 억제하는 것으로 추측된다.
- 특히 Bax는 세포 자멸사를 촉진하고 Bcl-2는 세포 자멸사를 억제하는 것으로 알려져 있다19). 본 실험에서도 포름알데히드 처리 시 간세포 사멸 억제를 담당하는 Bcl-2의 발현은 감소하였고, 세포사멸 촉진을 담당하는 Bax의 발현이 증가하여 Bax/Bcl-2의 비율은 증가하였다. 포름알데히드에 노출된 폐 조직에서는 자멸사 유전자들의 발현이 증가하였다고 보고되었다20).
- 실험 결과 Fig. 1A에서 보이듯이 100 μM FA 처리 시에는 세포 생존률에는 영향을 미치지 않았지만 500 μM 이상에서 간세포 사멸을 유발하는 것으로 나타났으며 1 mM 이상에서 이러한 현상은 더욱 현저하게 나타났다.
- 그래서 사람 간세포주인 HepG2 세포를 이용하여 포름알데히드에 의한 세포 자멸사 연구를 실시하였다. 실험 결과 포름알데히드는 세포 생존율을 감소 시켰으며, 이러한 반응은 항산화제인 vitamin E 및 NAC 처리시 차단되었다. 실제로 포름알데히드 처리시 산화성 스트레스 지표인 lipid peroxide 형성이 증가하였으며 내인성 항산화제인 GSH 함량이 감소하였다.
- 본 실험에서는 FA에 의한 산화성 스트레스 발생이 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2 발현 및 Bax 활성에 직접적으로 미치는 영향을 조사하지 않았지만 포름알데히드에 의한 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3의 활성형 증가 작용이 항산화제인 vitamin E 및 NAC에 의해서 차단되는 것으로 보아 이들의 활성이 Bcl-2를 억제하고 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 활성을 증가 할 것으로 추측된다. 이러한 결과는 산화성 스트레스가 Bax, Bcl-2 발현 및 caspase-3 발현을 조절함으로써 세포 사멸에 깊숙이 관여하는 것으로 판단된다.
- 이러한 결과는 FA에 의한 산화성 스트레스의 발생이 세포 사멸에 관여되는 다양한 단백질 조절을 유도함으로써 작용한다고 할 수 있다. 이상의 연구결과들을 종합해보면 FA 처리 시 산화성 스트레스 증가가 발생하며 Bcl-2 발현 감소, Bax 발현 증가 및 caspase-3 유도를 통해 간세포 사멸을 유도하는 것으로 관찰되었다. 이러한 변화에 따른 간세포의 세포 사멸에 따라 생체내의 내인성 항산화 효소 기전이 약화되어 다양한 간 관련 질병이 유도되는 것으로 사료된다.
- 실제로 포름알데히드 처리시 산화성 스트레스 지표인 lipid peroxide 형성이 증가하였으며 내인성 항산화제인 GSH 함량이 감소하였다. 한편 포름알데히드 처리시 세포 사멸 촉진 단백질인 Bax 발현은 증가하였으며 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현은 억제 되었으며 이러한 반응은 항산화제 (Vitamin E 및 NAC) 처리시 차단되었다. 세포사멸 실행 단백질인 casapse-3의 활성형 역시 증가하였으며, 항산화제 처리시 차단되었다.
후속연구
- 이 연구 결과는 간세포에서 포름알데히드에 의한 자멸사 연구에 관한 첫 보고일 것이다. 이에 대한 임상 실험은 향후 연구에서 더 구체적으로 밝혀져야 할 것이다.
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