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문제 정의
- 따라서 본 연구는 임상에서 흔히 사용되는 탕약의 복약지도와 향후 한약물의 다양한 제형개발과 표준화의 과정에서 필요한 기초데이터 확보를 위하여, 감초, 지실, 인진의 3가지 약물을 선정하여 함께 전탕한 후 보관조건별 약물 구성성분들의 정성과 정량적 안정성에 대한 연구결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 3가지 약재로 구성된 혼합 한방제재의 탕약에 대해 실온과 냉온의 보관 조건별, 그리고 0 주에서 8 주까지의 보관 기간별 약재 추출성분들의 기본적인 패턴이 어떻게 변하는지를 알아보았다. 예상대로 모든 샘플에서 glycyrrhizin, poncirin 및 6,7-dimethoxycoumarin의 Rf값은 거의 동일한 값을 보였으며, 다른 분리된 HPTLC 밴드의 패턴이 0주 ~ 8주 동안 실온 및 냉온에서 보관한 샘플들 간에 큰 변화는 없었다 (Fig.
- 보관기간 및 온도별 검액 (2 μL)과 각 약재의 표준액 (1 mg/mL glycyrrhizin: 5 μL, 5 mg/mL poncirin: 2 μL, 0.1 mg/mL 6,7-dimethoxycoumarin: 1 μL)을 HPTLC용 Silica Gel 60 F254 plate (20 cm × 10 cm)에 점적하였다 (밴드 길이: 8 mm, 간격: 7.2 mm, 점적 속도: 10 sec/μL).
- 조합된 3가지 한약제의 지표성분으로 사용된 glycyrrhizin, poncirin 그리고 6,7-dimethoxycoumarin을 이용하여 탕약의 보관 기간별 보관 온도별 정량적 변화를 분석하였다. 보관기간 및 온도별 검액들로부터 각 주요성분들의 정량분석을 지표물질과 비교하여 구한 후에, 0 주째의 양과 비교하여 상대값으로 나타내었다 (Fig. 2).
- 초산에칠·물·개미산·빙초산 혼압액 (79:11:5:5, v/v/v/v)을 전개용매로 하여 약 8 cm 전개한 다음 plate를 바람에 말렸다. 이후 자외선 (주파장 366 nm)이나 p-anisaldehyde sulfuricacid로 발색한 후에 백색광하에서의 검액에서 보이는 크로마토그램의 패턴을 0 주째 (보관하기 전)의 크로마토그램과 비교하였다.
- 정량분석은 보관기간 및 온도별 검액들의 크로마토그램에서 얻은 여러 개의 밴드 중, 표준액에서 얻은 밴드의 색상 및 retention factor (Rf, 시료의 전개거리/용매의 이동거리)값과 비교하여 각 약재의 주요성분을 검출하였으며, 확인된 피크면적은 0 주째 (보관하기 전)의 각 성분피크를 100으로 하였을 때 상대적인 값으로 산출하였다.
- 조합된 3가지 한약제의 지표성분으로 사용된 glycyrrhizin, poncirin 그리고 6,7-dimethoxycoumarin을 이용하여 탕약의 보관 기간별 보관 온도별 정량적 변화를 분석하였다. 보관기간 및 온도별 검액들로부터 각 주요성분들의 정량분석을 지표물질과 비교하여 구한 후에, 0 주째의 양과 비교하여 상대값으로 나타내었다 (Fig.
- 을 이용하여 탕약 형태의 한약물에 대한 안정성을 조사하였다. 주요성분을 이용한 정량적 분석을 겸하기 위하여 한국 식약청의 고시와 지표성분들의 검출 조건을 고려하여 감초, 지실, 인진의 3가지 한약물의 탕전 상태에서만 우선 조사하였다. 위의 결과에서 알 수 있듯이 8 주간 동안에 특이한 성분의 소실이나 새로운 성분의 생성과 같은 변화는 없는 것으로 나타났다.
- 초산에칠·물·개미산·빙초산 혼압액 (79:11:5:5, v/v/v/v)을 전개용매로 하여 약 8 cm 전개한 다음 plate를 바람에 말렸다.
- 추출액을 100 mL씩 폴리에칠렌수지의 레토르트 파우치에 진공포장한 뒤, 보관기간 및 보관온도에 따른 성분변화를 알아보기 위해 2주, 4주, 8주 동안 실온 (23 ± 2℃) 및 냉온 (4℃)의 암소에 각각 보관하였다.
- 탕약 내 성분의 패턴 변화 및 정량 분석은 HPTLC system을 이용하였다12,13). 기간 및 온도별로 보관 후 동결 건조된 탕약 200 mg을 1 mL의 90% methanol (w/v)과 혼합하여 잘 섞은 뒤, 초음파발생기에 30분간 방치하여 고형분으로부터 가용성 물질들의 용출을 용이하게 하였다.
대상 데이터
- HPTLC 분석을 위한 용매로는 분석용 99.9% methanol (Merck, Germany), 99.0% ethyl acetate (Junsei Chemical Co., Ltd., Japan), 98% formic acid (Kanto chemical Co., Inc., Japan), 99.5% acetic acid (DC Chemical Co., Ltd., Puerto Rico)를 사용하였으며 p-anisaldehyde (Sigma, USA)와 95% sulfuric acid (Daejung Chemicals & Metals co., Ltd., Korea)는 발색제로 사용하였다.
- Linomat IV automated sample applicator, Automated Multiple Development 2, Reprostar 3 with Digital Camera, winCATS 4 software, VideoScan으로 구성되어 있는 HPTLC application system (CAMAG, Switzerland)을 이용하였고, Silica Gel 60 F254 HPTLC plate (20 cm × 10 cm)는 Merck (Germany)로부터 구입하였다.
- 따라서 본 연구에서는, 동일한 HPTLC 조건에서 정성분석이 가능한 감초 (Broiled root of Glycyrrhiza uralensis Fischer), 지실 (Unripe fruits of Poncirus trifoliata Rafinesqui), 인진 (Herba of Artemisia capillaris Thunberg)과 그들의 지표성분으로 각각 glycyrrhizin, poncirin과 6,7-dimethoxycoumarin을 선정하였다. 대한약전 및 대한약전의 한약규격주해8)에 근거하여 약재 및 그 주요성분을 선정하였다.
- 대한약전의 가이드와 선행 연구자들의 결과에 근거하여 감초, 지실, 인진의 지표물질로 사용하기 위해서 glycyrrhizin (Sigma, USA), 6,7-dimethoxycoumarin (Fluka, USA), poncirin (Fluka, USA)을 구입하였다9-11). HPTLC 분석을 위한 용매로는 분석용 99.
- 따라서 본 연구에서는, 동일한 HPTLC 조건에서 정성분석이 가능한 감초 (Broiled root of Glycyrrhiza uralensis Fischer), 지실 (Unripe fruits of Poncirus trifoliata Rafinesqui), 인진 (Herba of Artemisia capillaris Thunberg)과 그들의 지표성분으로 각각 glycyrrhizin, poncirin과 6,7-dimethoxycoumarin을 선정하였다. 대한약전 및 대한약전의 한약규격주해8)에 근거하여 약재 및 그 주요성분을 선정하였다.
- 5 mL eppendolf tube로 옮겨 담아 검액으로 사용하였다. 지표성분인 glycyrrhizin, poncirin 및 6,7-dimethoxycoumarin은 methanol에 녹여 표준액으로 사용하였다.
- 혜화건재도매약업사(대전)로부터 구입한 감초, 지실, 인진 각각 50 그램씩을 혼합 후 3리터의 정제수에 넣고 100℃에서 2 시간 동안 가여한 후 무압력상태로 추출하였다. 추출액을 100 mL씩 폴리에칠렌수지의 레토르트 파우치에 진공포장한 뒤, 보관기간 및 보관온도에 따른 성분변화를 알아보기 위해 2주, 4주, 8주 동안 실온 (23 ± 2℃) 및 냉온 (4℃)의 암소에 각각 보관하였다.
이론/모형
- 따라서 우리들은 한약물과 같은 복합약물들의 성분별 변이를 추적하기에 적당한 HPTLC법20)을 이용하여 탕약 형태의 한약물에 대한 안정성을 조사하였다. 주요성분을 이용한 정량적 분석을 겸하기 위하여 한국 식약청의 고시와 지표성분들의 검출 조건을 고려하여 감초, 지실, 인진의 3가지 한약물의 탕전 상태에서만 우선 조사하였다.
성능/효과
- 0%의 함량이 검출되었다. 6,7-Dimethoxycoumarin의 경우, 실온 보관했을 경우 0 주째에 비해 2, 4, 8 주간의 보관 기간 동안 97.6%, 92.7%, 99.7%의 함량이 검출되었으며, 냉온 보관의 경우에는 94.8%, 95.0%, 89.8%의 함량이 검출되었다. Glycyrrhizin의 경우, 다른 두 물질에 비하여 실온, 냉온 보관에서 기간별 변화의 차이가 더 크게 나타나며, 냉온 보관의 경우 실온 보관보다 보관 기간이 길어질수록 함량이 감소하는 것으로 확인되었다.
- Glycyrrhizin은 실온 보관의 경우, 0 주째에 비해 2, 4, 8 주간의 보관 기간 동안 98.3%, 82.5%, 90.0%의 함량이 검출되었으며, 냉온 보관의 경우에는 마찬가지로 0 주째에 비해 77.5%, 88.7%, 76.5%의 함량이 검출되었다. Poncirin은 실온 보관의 경우, 0 주째에 비해 2, 4, 8 주간의 보관 기간 동안 93.
- 8%의 함량이 검출되었다. Glycyrrhizin의 경우, 다른 두 물질에 비하여 실온, 냉온 보관에서 기간별 변화의 차이가 더 크게 나타나며, 냉온 보관의 경우 실온 보관보다 보관 기간이 길어질수록 함량이 감소하는 것으로 확인되었다.
- 5%의 함량이 검출되었다. Poncirin은 실온 보관의 경우, 0 주째에 비해 2, 4, 8 주간의 보관 기간 동안 93.5%, 93.6%, 93.3%의 함량이 검출되었으며, 냉온 보관의 경우에는 88.9%, 88.3%, 84.0%의 함량이 검출되었다. 6,7-Dimethoxycoumarin의 경우, 실온 보관했을 경우 0 주째에 비해 2, 4, 8 주간의 보관 기간 동안 97.
- 다만, 추출된 상태에서 3가지 지표 성분들을 이용한 정량적 변화에서는 열수 추출한 직후에 비하여 시간이 지남에 따라서 약간씩 양이 감소하고 있는 것으로 나타났는데, 대략 5% ~ 20%까지의 변화량이 보였다. 또한, 이러한 변화가 약간의 기간 의존적으로 증가하였으며 실온보다 냉온 보관의 경우, 변화량이 크게 나타났다.
- 다만, 추출된 상태에서 3가지 지표 성분들을 이용한 정량적 변화에서는 열수 추출한 직후에 비하여 시간이 지남에 따라서 약간씩 양이 감소하고 있는 것으로 나타났는데, 대략 5% ~ 20%까지의 변화량이 보였다. 또한, 이러한 변화가 약간의 기간 의존적으로 증가하였으며 실온보다 냉온 보관의 경우, 변화량이 크게 나타났다. 이러한 데이터는 기존의 한약이 무균상태라면 실온 보관이 냉장 보관보다 더욱 안정하다는 것을 의미하여, 2 주 이상 보관기간이 경과하면 어느 정도의 약효의 손실이 있을 수 있음을 말한다고 하겠다.
- 3가지 약재로 구성된 혼합 한방제재의 탕약에 대해 실온과 냉온의 보관 조건별, 그리고 0 주에서 8 주까지의 보관 기간별 약재 추출성분들의 기본적인 패턴이 어떻게 변하는지를 알아보았다. 예상대로 모든 샘플에서 glycyrrhizin, poncirin 및 6,7-dimethoxycoumarin의 Rf값은 거의 동일한 값을 보였으며, 다른 분리된 HPTLC 밴드의 패턴이 0주 ~ 8주 동안 실온 및 냉온에서 보관한 샘플들 간에 큰 변화는 없었다 (Fig. 1). 주파장이 366 nm인 자외선을 조사하였을 경우 보이는 밴드들의 패턴이 거의 일정하였고 (Fig 1A), 발색 후 백색광을 쪼였을 때 나타나는 여러 밴드의 패턴 또한 큰 차이가 없었다 (Fig.
- 주요성분을 이용한 정량적 분석을 겸하기 위하여 한국 식약청의 고시와 지표성분들의 검출 조건을 고려하여 감초, 지실, 인진의 3가지 한약물의 탕전 상태에서만 우선 조사하였다. 위의 결과에서 알 수 있듯이 8 주간 동안에 특이한 성분의 소실이나 새로운 성분의 생성과 같은 변화는 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 또한 실온과 냉온의 저장온도 차이에도 불구하고 동일하였다.
후속연구
- 본 연구에서 우리는 탕제형태의 한약물의 안정성에 대한 결과를 보았는데, 향후는 더 오랜 기간과 다양한 조건 및 더 많은 한약물이 포함된 실험이 필요하며, 더불어 효능의 변화도 함께 평가되어야 하겠다. 우리의 연구결과가 향후 한약물의 과학화와 세계화의 과정에서 일부나마 기여하길 기대한다.
- 본 연구에서 우리는 탕제형태의 한약물의 안정성에 대한 결과를 보았는데, 향후는 더 오랜 기간과 다양한 조건 및 더 많은 한약물이 포함된 실험이 필요하며, 더불어 효능의 변화도 함께 평가되어야 하겠다. 우리의 연구결과가 향후 한약물의 과학화와 세계화의 과정에서 일부나마 기여하길 기대한다.
- 그러나 만약 탕전된 상태에서 오랫동안 보관하면서 장기간 복용을 하는 경우라면 탕전의 형태보다도 안정성이 확보된 새로운 제형의 한약을 고려해야 할 것이다. 이것은 향후 전 세계를 대상으로 하는 한약의 제품화시에는 오랜 유통기간과 다양한 형태의 이동 및 보관을 염두에 두고 한약의 안정성을 확보할 방안의 필요성이 대두 된다고 하겠다.
- 한가지, 의 복합처방에 따른 유효성분 추출율의 변화에 대한 연구만이 있을 뿐이다19). 이러한 한약물의 안정성에 대한 데이터의 확보는 한약에 대한 복약지도와 국민의 신뢰도 향상뿐만이 아니라 향후 한약의 표준화나 제형의 다변화 및 한국 한약의 세계화에 기초적인 자료로서 매우 필요할 것이다.
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