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문제 정의
- Table 1에서 보는 것과 같이 사과껍질 효소 추출액은 pH 3.60±0.21로 두 효소의 적정 pH 범위에 근접하므로 본 실험에서는 특히 효소농도와 반응온도의 영향을 알아보았다
- 본 연구에서는 cellulase와 pectinase 활성을 가진 Viscozyme과 Pectinex를 이용하여 사과껍질로부터 폴리페놀을 추출하고 추출액의 항산화활성 정도를 알아보았다. 건조하지 않은 사과껍질과 증류수를 1:1(w/v)로 혼합하여 마쇄한후 Viscozyme과 Pectinex를 0.
- 우리나라에서의 사과 총생산량은 2006년 기준 약 40만 톤이며(15) 가공은 주로 음료 및 잼 등 과육을 이용하는데 가공 중 발생하는 과피의 폴리페놀 성분은 합성소재를 대신할 기능성 물질과 천연 항산화제로써 이용가치가 대단히 크다. 본 연구에서는 cellulase와 pectinase 활성이 있는 효소로 각각 Novozymes사의 Viscozyme 과 Pectinex를 사용하여 사과껍질을 분해하고 총 폴리페놀 추출수율을 증가시키는 효소농도, 반응온도, 반응시간 및 추출액의 항산화 활성정도를 알아보았다.
제안 방법
- ABTS radical 소거활성은 Arnao 등(18)과 Obon 등(19) 의 방법을 응용하여 측정하였다. 즉, 2 mM ABTS, 0.
- DPPH radical 소거활성은, 건조 고형분 함유량이 5～25 mg 되도록 희석한 시료액 0.5 mL을 0.2 mM DPPH 에탄올 용액 1 mL와 혼합하고 30분간 상온에서 방치한 후 515 nm에서 흡광도(VERSAmax microplate reader, Molecular Devices, USA)를 측정하여 알아보았다(17).
- RAP 측정법은 Fe3+을 Fe2+로 환원하는 능력을 측정하는 방법으로 Fe2+을 표준물질로 하여 항산화활성을 나타내었으며 0.5 mM의 vitamin C 및 trolox의 환원능과 비교하였다. 시료량 1, 2, 3, 4, 5 mg에서 0.
- Viscozyme과 Pectinex를 각각 2% 농도로 혼합처리하고 50℃에서 12시간 반응시킨 사과껍질 효소 추출액의 항산화 활성을 DPPH 및 ABTS radical 소거활성과 FRAP 측정법으로 알아보았다.
- 본 연구에서는 cellulase와 pectinase 활성을 가진 Viscozyme과 Pectinex를 이용하여 사과껍질로부터 폴리페놀을 추출하고 추출액의 항산화활성 정도를 알아보았다. 건조하지 않은 사과껍질과 증류수를 1:1(w/v)로 혼합하여 마쇄한후 Viscozyme과 Pectinex를 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1% 및 2% (v/v)로 개별 또는 혼합처리하고 30oC～50oC에서 12시간과 24시간 반응시킨 후 총 페놀 함량을 측정하였다. 총 페놀 함량은 효소농도와 반응온도에 따라 증가하였으며, 2% 농도로 12시간 처리한 추출액의 총 페놀 함량(mg/mL)을 온도 별로 비교하면 30oC에서는 Viscozyme, Pectinex 및 Viscozyme＋Pectinex 처리구가 각각 0.
- 본 연구에서는 cellulase와 pectinase 활성을 가진 Viscozyme과 Pectinex를 이용하여 사과껍질로부터 폴리페놀을 추출하고 추출액의 항산화활성 정도를 알아보았다. 건조하지 않은 사과껍질과 증류수를 1:1(w/v)로 혼합하여 마쇄한후 Viscozyme과 Pectinex를 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1% 및 2% (v/v)로 개별 또는 혼합처리하고 30℃～50℃에서 12시간과 24시간 반응시킨 후 총 페놀 함량을 측정하였다. 총 페놀 함량은 효소농도와 반응온도에 따라 증가하였으며, 2% 농도로 12시간 처리한 추출액의 총 페놀 함량(mg/mL)을 온도 별로 비교하면 30℃에서는 Viscozyme, Pectinex 및 Viscozyme＋Pectinex 처리구가 각각 0.
- 반응액은 2,322×g(Union 32R, Hanil, Korea)로 20분 원심분리한 후 상등액을 취하여 0.45 mm syringe filter (ADVANTEC, Japan)로 여과하고 여액을 총 페놀 함량 및 항산화 활성 측정의 시료로 사용하였다.
- 사과껍질 효소 추출액의 pH는 pH meter(420A, Orion Research, USA)를 이용하여 측정하였으며, 총 산도는 2배로 희석한 시료 10 mL을 취하여 0.1 N NaOH로 적정하고 citric acid 함량(%)으로 환산하여 표시하였다. oBrix는 hand refractometer(Atago, Japan)로 측정하였다.
- 사과껍질 효소 추출액의 색도는 색차계(Color JS555, Color Techno System Co., Japan)를 이용하여 L(lightness), a(redness), b(yellowness) 값을 측정하여 알아보았다.
- FRAP(Ferric reducing antioxidant power) 측정은 Benzie와 Strain(20)의 방법으로 하였다. 즉 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ 및 20 mM FeCl3ㆍ6H2O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다. 이어서 고형분 함유량이 1～5 mg 되도록 희석한 시료액 0.
- 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약 원액을 시료와 혼합하여 페놀 화합물을 발색시키고 760 nm에서 분광광도계로 측정하였다(16). 표준물질로 gallic acid를 사용하였으며 mg/mL로 표시하였다.
대상 데이터
- Viscozyme(ViscozymeⓇ L, 100 FBG/g)과 Pectinex (PectinexⓇ 100L, 5,000 FDU/mL)는 Novozymes A/S (Bagsvaerd, Denmark), 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), microperoxidase-8(MP-8), 2,4,6-tripyridyls-triazine(TPTZ), FeSO4ㆍ7H2O 및 ascorbic acid(vitamin C)는 Sigma(St. Louis, USA), 6-hydroxy- 2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(trolox) 및 FeCl3ㆍ6H2O는 Aldrich(Steinheim, Germany)로부터 구입하였으며, 기타 시약은 일반 특급시약을 사용하였다.
- 사과껍질은 공장(예산농산, 충남)에서 사과(Fuji)로부터 기계적으로 제거된 것을 사용하였으며, 사과껍질 : 증류수를 1:1(w/v)의 비율로 혼합하고 blender(Waring Co., USA)로 마쇄한 후 Viscozyme와 Pectinex를 단독 또는 혼합하여 마쇄액에 대하여 0.1%～2%(v/v)가 되도록 첨가하고 진탕배 양기(SJ808H, Sejong, Korea)를 이용하여 온도 30℃～50℃, 회전속도 80 rpm의 조건에서 12시간 또는 24시간 반응시켰다. 반응액은 2,322×g(Union 32R, Hanil, Korea)로 20분 원심분리한 후 상등액을 취하여 0.
데이터처리
- 결과는 평균±SD로 표시하였으며, 유의성은 ANOVA와 Tuckey test로 알아보았다.
이론/모형
- FRAP(Ferric reducing antioxidant power) 측정은 Benzie와 Strain(20)의 방법으로 하였다. 즉 300 mM acetate buffer(pH 3.
- 사과껍질 효소 추출액의 수분, 조지방, 조단백질 및 조회 분은 식품공전(21) 일반성분시험법에 준하여 측정하였다.
성능/효과
- 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1% 및 2%(v/v)의 효소 처리에 따라 총 페놀 함량이 증가하였으며, 2% 농도로 12시간 처리한 반응액의 총 페놀 함량(mg/mL)을 비교하면 Viscozyme, Pectinex 및 Viscozyme＋Pectinex가 각각 0.30±0.02, 0.16±0.01 및 0.33±0.02이다.
- 2% 농도로 12시간 처리한 반응액의 총 페놀 함량 (mg/mL)이 Viscozyme, Pectinex 또는 Viscozyme＋Pectinex가 각각 0.34±0.01, 0.22±0.01 및 0.38±0.02로 Viscozyme 또는 Viscozyme＋Pectinex가 Pectinex 처리와 비교하여 높게 나타났으며(p<0.01), Viscozyme＋Pectinex는 Viscozyme 단독처리보다 효과적인 것으로 나타났다 (p<0.05).
- 30℃에서 반응시킨 결과와 유사한 양상이었으며 2% 농도로 12시간 처리한 반응액의 총 페놀 함량(mg/mL)을 비교하면 Viscozyme, Pectinex 또는 Viscozyme＋Pectinex가 각각 0.34±0.01, 0.19±0.01 및 0.35±0.02로 Viscozyme 또는 Viscozyme＋Pectinex가 Pectinex 처리와 비교하여 높게 나타났다(p<0.01).
- 28 vit. C eq mM 및 0.08, 0.14, 0.19, 0.24, 0.24 trolox eq mM로 건조고형분 농도가 증가함에 따라 활성도가 증가하였으며 4 mg 의 시료농도에서 100% 활성을 나타내었다(Fig. 5). ABTS radical은 metmyoglovin/H2O2 또는 potassium persulfate에의해서도 생성되며(31) 일명 TEAC(trolox equivalent antioxidant capacity) 측정법으로 불리는데 horseradish peroxidase/H2O2 방법은 반응시간이 대단히 빠른 장점이 있으며 다양한 물질의 항산화활성 측정에 사용되었다(19,32).
- 40 vit. C eq mM 및 0.11, 0.25, 0.35, 0.41, 0.47 trolox eq mM로 사과껍질 효소추출액의 건조 고형분 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 소거활성도 비례적으로 증가하였다(Fig. 4).
- 그러나 12시간과 24시간에서의 유의적 함량차이는 없어 효소반응이 12시간 전에 최대를 이룬 것으로 사료된다. Viscozyme ＋Pectinex를 2% 농도로 혼합처리하고 50℃에서 12시간 반응시킨 사과껍질 효소추출액의 항산화활성을 DPPH, ABTS(TEAC) 및 FRAP법으로 측정한 결과 시료농도가 증가함에 따라 항산화활성도 비례적으로 증가하는 것으로 확인되었다.
- 05 vs Viscozyme)로 12시간 처리와 유사한 결과를 보였다. 결론적으로 50℃에서 Viscozyme＋Pectinex 처리가 총 페놀 함량 증가에 가장 효과적인 것으로 나타났다. 12시간과 24시간의 차이는 없어 효소반응이 12시간 전에 최대를 이룬 것으로 사료된다.
- 모든 온도에서 Viscozyme이 Pectinex보다 월등히 효과적이며(p<0.01), 50oC에서 처리한 경우 Viscozyme ＋Pectinex가 Viscozyme보다 효과적이었다(p<0.05).
- 모든 온도에서 Viscozyme이 Pectinex보다 월등히 효과적이며(p<0.01), 50℃에서 처리한 경우 Viscozyme＋Pectinex가 Viscozyme보다 효과적이었다(p<0.05).
- 본 연구에서 ABTS radical(ABTS․+)은 horseradish peroxidase와 H2O2작용에 의해 ABTS를 산화시키는 방법으로 생성하였으며, Viscozyme과 Pectinex를 각각 2% 농도로 혼합처리하고 50℃에서 12시간 반응시킨 사과껍질 효소 추출액은 ABTS radical에 대해서도 소거활성을 보였다. 시료량 1, 2, 3, 4, 5 mg에서 0.
- 5 mM의 vitamin C 및 trolox의 환원능과 비교하였다. 시료량 1, 2, 3, 4, 5 mg에서 0.06, 0.37, 0.95, 1.41 및 1.85 FeSO4 eq mM로 시료농도에 따라 Fe2+의 생성이 증가하였으며, 0.5 mM의 vitamin C 및 trolox의 환원능력이 각각 1.21및 1.01로 3～4 mg의 시료와 유사하거나 작은 것으로 나타났다(Fig. 6). FRAP 결과는 사과껍질 추출액 성분이 전자공여체로 작용하여 항산화활성을 나타내고 있음을 암시한다.
- 즉, Viscozyme 또는 Viscozyme＋Pectinex가 Pectinex보다 약 2배 가까운 증가를 보이고 있으며(p<0.01), Viscozyme＋Pectinex의 혼합처리가 Viscozyme 단독처리보다 효과적인 경향을 보이나 통계적 유의성은 없는 것으로 나타났다.
- 총 페놀 함량은 효소농도와 반응온도에 따라 증가하였으며, 2% 농도로 12시간 처리한 추출액의 총 페놀 함량(mg/mL)을 온도 별로 비교하면 30oC에서는 Viscozyme, Pectinex 및 Viscozyme＋Pectinex 처리구가 각각 0.30±0.02, 0.16±0.01 및 0.33±0.02, 40℃에서는 각각 0.34±0.01, 0.19±0.01 및 0.35±0.02, 50℃에서는 각각 0.34±0.01, 0.22±0.01 및 0.38±0.02로 나타났다.
- 총 페놀 함량은 효소농도와 반응온도에 따라 증가하였으며, 2% 농도로 12시간 처리한 추출액의 총 페놀 함량(mg/mL)을 온도 별로 비교하면 30℃에서는 Viscozyme, Pectinex 및 Viscozyme＋Pectinex 처리구가 각각 0.30±0.02, 0.16±0.01 및 0.33±0.02, 40℃에서는 각각 0.34±0.01, 0.19±0.01 및 0.35±0.02, 50℃에서는 각각 0.34±0.01, 0.22±0.01 및 0.38±0.02로 나타났다.
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