다양한 적송잎 추출물의 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성 검증 Verification of Antimicrobial Activities of Various Pine Needle Extracts against Antibiotic Resistant Strains of Staphylococcus aureus원문보기
병원 내 감염의 주된 원인균으로 알려진 황색포도상구균(S. aureus)과 항생제 내성 황색포도상구균(PRSA, MRSA)에 대해 항균활성이 우수한 천연 항균성 물질을 검색하기 위해 적송잎을 대상으로 열수-헥산(HWH), 열수-에탄올(HWE), 헥산, 에탄올 및 열수 등으로 획득된 추출물들로 항균활성을 조사하였다. 헥산, 에탄올, 열수-헥산, 열수-에탄올 추출물들은 그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis), 황색포도상구균 표준균주, 항생제 내성균주인 PRSA 및 MRSA에 대해서 항균활성을 나타내었으며, 특히 MRSA (ATCC 33591) 균주에 대해 다른 균주들 보다 높은 항균활성을 나타냈다. 열수 추출물은 황색포도상구균 표준균주 및 MRSA에서만 항균활성을 나타냈지만, 항균활성은 가장 높아 50 mg/ml의 농도에서 33 mm의 생육저해환을 나타냈다. 각 균주들에 대한 생장의 최소저해 농도(MIC)는 HWH 및 HWE 추출물이 모두 0.05 mg/ml의 농도로 가장 낮았고, 열수추출물이 0.5 mg/ml의 농도였으며, 에탄올 추출물은 5 mg/ml의 가장 높은 농도를 나타냈다. 모든 추출물들은 $121^{\circ}C$에서 20분간의 열처리 후에도 항균활성이 유지되었으므로 열에 대해 안정한 물질임을 알 수 있었다. 본 연구결과로 식품산업에서 솔잎 추출물을 천연 항균제로 사용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
병원 내 감염의 주된 원인균으로 알려진 황색포도상구균(S. aureus)과 항생제 내성 황색포도상구균(PRSA, MRSA)에 대해 항균활성이 우수한 천연 항균성 물질을 검색하기 위해 적송잎을 대상으로 열수-헥산(HWH), 열수-에탄올(HWE), 헥산, 에탄올 및 열수 등으로 획득된 추출물들로 항균활성을 조사하였다. 헥산, 에탄올, 열수-헥산, 열수-에탄올 추출물들은 그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis), 황색포도상구균 표준균주, 항생제 내성균주인 PRSA 및 MRSA에 대해서 항균활성을 나타내었으며, 특히 MRSA (ATCC 33591) 균주에 대해 다른 균주들 보다 높은 항균활성을 나타냈다. 열수 추출물은 황색포도상구균 표준균주 및 MRSA에서만 항균활성을 나타냈지만, 항균활성은 가장 높아 50 mg/ml의 농도에서 33 mm의 생육저해환을 나타냈다. 각 균주들에 대한 생장의 최소저해 농도(MIC)는 HWH 및 HWE 추출물이 모두 0.05 mg/ml의 농도로 가장 낮았고, 열수추출물이 0.5 mg/ml의 농도였으며, 에탄올 추출물은 5 mg/ml의 가장 높은 농도를 나타냈다. 모든 추출물들은 $121^{\circ}C$에서 20분간의 열처리 후에도 항균활성이 유지되었으므로 열에 대해 안정한 물질임을 알 수 있었다. 본 연구결과로 식품산업에서 솔잎 추출물을 천연 항균제로 사용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
We investigated antimicrobial activities of various pine (Pinus densiflora) needle extracts against antibiotic resistant strains of Staphylococcus aureus. Hot water extract showed the highest antimicrobial activity against normal and methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), however, it ex...
We investigated antimicrobial activities of various pine (Pinus densiflora) needle extracts against antibiotic resistant strains of Staphylococcus aureus. Hot water extract showed the highest antimicrobial activity against normal and methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), however, it exhibited no antimicrobial activity against penicillin resistant S. aureus (PRSA). Hot water-hexane (HWH), hot water-ethanol (HWE), hexane, and ethanol extracts showed antimicrobial activity against S. aureus, PRSA and MRSA. Minimum inhibitory concentrations (MIC) of HWH, HWE, hexane, and ethanol extracts were 0.05, 0.05, 0.5 and 5 mg/ml, respectively, and HWH and HWE extracts showed the strongest antimicrobial activity among these extracts. Antimicrobial activities of pine needle extracts were stable after heating at $121^{\circ}C$ for 20 min. These results suggested that pine needle extracts can be used as an effective natural antimicrobial agent for food and medical industries.
We investigated antimicrobial activities of various pine (Pinus densiflora) needle extracts against antibiotic resistant strains of Staphylococcus aureus. Hot water extract showed the highest antimicrobial activity against normal and methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), however, it exhibited no antimicrobial activity against penicillin resistant S. aureus (PRSA). Hot water-hexane (HWH), hot water-ethanol (HWE), hexane, and ethanol extracts showed antimicrobial activity against S. aureus, PRSA and MRSA. Minimum inhibitory concentrations (MIC) of HWH, HWE, hexane, and ethanol extracts were 0.05, 0.05, 0.5 and 5 mg/ml, respectively, and HWH and HWE extracts showed the strongest antimicrobial activity among these extracts. Antimicrobial activities of pine needle extracts were stable after heating at $121^{\circ}C$ for 20 min. These results suggested that pine needle extracts can be used as an effective natural antimicrobial agent for food and medical industries.
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문제 정의
본 연구에서는 식품에 합성 보존제를 첨가함에 따른 소비자들의 건강에 대한 우려를 극복하고 문제점을 보완하며 식품의 저장기간 및 상품성을 동시에 확보할 수 있는 천연물 유래의 식품보존제 및 항생제 대체 소재의 개발에 활용할 수 있도록 다양한 추출방법에 의해 확보된 솔잎 추출물들의 황색포도상구균 및 MRSA에 대한 항균활성을 검증하였다.
제안 방법
동결건조한 추출물을 최종 농도가 0.05, 0.5, 5, 50 mg/ml가 되게 dimethlysulfoxide (DMSO)로 녹이고, membrane filter (0.45 μm)로 제균시킨 후에 5 μl씩 disc에 완전히 흡수시킨 후 37℃ incubator에서 24시간 배양시켜 항균작용에 의해 형성된 생육저해환(clear zone)을 비교․관찰하였다.
최소저해농도 측정은 paper disc법을 이용하여 수행하였다. 여과하여 제균시킨 추출물을 0.005 mg/ml에서 50 mg/ml의 범위에서 paper disc에 첨가한 후 건조시키고, 시험균을 도말한 평판배지 위에 놓은 후, 37℃에서 24시간 배양시켜 항균작용에 의해 생육저해환(clear zone)을 형성하는 최소농도를 MIC로 결정하였다.
1). 열수, 헥산, 에탄올 추출물들은 건조시킨 적송잎 분말 3 kg에 각각 물, 헥산, 에탄올 4 l를 첨가하여 80℃에서 12시간 동안 정치하여 추출하는 과정을 총 2번 반복하였다. 열수헥산, 열수에탄올 추출물은 적송잎 분말 3 kg에물 4 l를 첨가하여 80℃에서 12시간 동안 추출한 뒤 남은 잔류물을 수거해 건조시킨 후 여기에 각각 헥산 또는 에탄올 4 l를 첨가하여 60℃에서 12시간 동안 추출하였다.
열수, 헥산, 에탄올 추출물들은 건조시킨 적송잎 분말 3 kg에 각각 물, 헥산, 에탄올 4 l를 첨가하여 80℃에서 12시간 동안 정치하여 추출하는 과정을 총 2번 반복하였다. 열수헥산, 열수에탄올 추출물은 적송잎 분말 3 kg에물 4 l를 첨가하여 80℃에서 12시간 동안 추출한 뒤 남은 잔류물을 수거해 건조시킨 후 여기에 각각 헥산 또는 에탄올 4 l를 첨가하여 60℃에서 12시간 동안 추출하였다. 모든 추출물은 여과지(Whatman No 3, England)로 여과한 다음 rotary evaporator로 60℃에서 농축한 후 동결 건조하였고 항균활성 실험 전까지 -20℃에 보관하였다.
대부분의 가공식품들은 기호성이나 저장성을 높이기 위해 열처리 공정을 거치는 경우가 많기 때문에 열에 안정한 항균성 식품첨가제의 개발이 필요하다. 적송잎 추출물에 함유되어 있는 항균성 물질의 열 안정성을 조사하기 위해 각각의 용매 추출물들을 열처리한 후 고초균, 황색포도상구균 표준균주 및 항생제 내성균주인 PRSA와 MRSA에 대한 생육저해환을 측정한 결과를 Table 3에 나타냈다. 열처리 시료의 피검균에 대한 생육저해환의 크기가 대조군인 비열처리 시료의 생육저해 환의 크기와 비교하여 볼 때 크기 변화가 거의 없는 것으로 보아 적송잎 추출물의 항균물질은 열에 대하여 안정한 물질임을 알 수 있었다.
적송잎 추출물의 열 안정성을 측정하기 위해 50 mg/ml 농도로 희석한 시료를 80℃에서 60분, 100℃ 및 121℃에서 10분 및 20분간 열처리한 후 paper disc법을 이용하여 항균활성을 측정하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 적송잎은 2007년 7월경 지리산에서 채취하여 물로 세척하고 60℃에서 열풍건조한 후 믹서로 분말화하였으며, 체를 이용하여 균질한 분말시료로 만들어 추출용 시료로 사용하였다. 적송잎 추출물은 추출방법에 따라 열수헥산 추출물(Hot water-hexane, HWH), 열수에탄올 추출물(Hot water-ethanol, HWE), 헥산 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물로 준비하였다(Fig.
aureus, ATCC 33591, ATCC 33593)를 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, Korea)로부터 분양받아 사용하였다. 생장배지로는 B. subtilis와 E. coli는 Luria-Bertani 배지(LB 배지, 10 g bacto tryptone, 5 g yeast extract, 50 g NaCl, 증류수 1 l)를 사용하였고 황색포도상구균 표준균주, PRSA 및 MRSA는 nutrient 배지(30 g beef extract, 50 g peptone, 증류수 1 l)를 사용하였다.
본 실험에 사용한 적송잎은 2007년 7월경 지리산에서 채취하여 물로 세척하고 60℃에서 열풍건조한 후 믹서로 분말화하였으며, 체를 이용하여 균질한 분말시료로 만들어 추출용 시료로 사용하였다. 적송잎 추출물은 추출방법에 따라 열수헥산 추출물(Hot water-hexane, HWH), 열수에탄올 추출물(Hot water-ethanol, HWE), 헥산 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물로 준비하였다(Fig. 1). 열수, 헥산, 에탄올 추출물들은 건조시킨 적송잎 분말 3 kg에 각각 물, 헥산, 에탄올 4 l를 첨가하여 80℃에서 12시간 동안 정치하여 추출하는 과정을 총 2번 반복하였다.
항균활성 측정에는 그람양성 대표세균인 B. subtilis (ATCC 6633), 그람음성 대표세균인 E. coli (KCTC 2223), 황색포도상구균(S. aureus) 표준균주(ATCC 33594), penicillin에 대하여 내성을 나타내는 PRSA (penicillin resistant S. aureus, ATCC 13301), methicillin에 대하여 내성을 나타내는 MRSA(methicillin resistant S. aureus, ATCC 33591, ATCC 33593)를 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, Korea)로부터 분양받아 사용하였다. 생장배지로는 B.
이론/모형
최소저해농도 측정은 paper disc법을 이용하여 수행하였다. 여과하여 제균시킨 추출물을 0.
추출물의 항균활성 측정은 paper disc법으로 실시하였다. 각 균주는 4 ml 액체배지에 접종하여 37℃에서 18시간씩 3회계대 배양한 뒤 시험균 농도를 650 nm에서 optical density (O.
성능/효과
Paper disc법을 이용한 항균활성 측정결과를 바탕으로 적 송잎 추출물에 감수성을 나타내었던 고초균, 황색포도상구균 표준균주 및 항생제 내성균주인 PRSA와 MRSA에 대한 최소 저해농도를 측정한 결과를 Table 2에 나타냈다. HWH 추출물과 HWE 추출물의 최소저해농도는 모두 0.05 mg/ml로 추출물 중 가장 낮은 농도에서 세균의 생육을 저해하였고, 헥산 추출물과 열수 추출물은 HWH 및 HWE 추출물보다 10배 높은 농도인 0.5 mg/ml의 농도에서 세균의 생육을 저해하였으며, 에탄올 추출물은 가장 높은 농도인 5 mg/ml의 농도에서 세균의 생육을 저해하였다.
coli)에 대한 항균활성은 나타내지 않았고, 열수 추출물은 황색포도상구균 표준균주와 methicillin 내성균주인 MRSA에 대해서만 항균활성을 보였다. HWH, HWE, 헥산 및 에탄올 추출물들은 그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis), 황색포도상구균 표준균주 및 항생제 내성균주인 PRSA와 MRSA 모두에 대해 항균활성을 나타냈다. 적송잎 추출물 처리농도가 증가함에 따라 항균활성을 나타내는 생육저해환의 크기가 비례적으로 증가하는 것으로 보아 농도 의존적으로 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
aureus, MRSA)이 보고되었다[10]. 그 이후 MRSA의 출현빈도는 계속 증가하고 있으며, MRSA 감염증으로 인한 사망자의 비율 또한 1993년에 12%에서 2002년에 66%로 급증하였다. MRSA 는 일반 황색포도상구균과 달리 methicillin에 내성을 지닐 뿐만 아니라 cephalosporin, ampicillin, nafcillin 등과 같은 β-lactam 계열 항생제를 비롯하여 aminoglycoside 및 macrolides 계열의 항생제에 대해서도 내성을 지니고 있어 MRSA 감염증 치료에 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다[15].
9%로 가장 낮은 수율을 나타냈다(Table 1). 또한, 헥산 추출물은 12.6%, HWE 추출물은 14.6%로 비슷한 수율을 보였으며, 열수 추출물의 경우 6.1%로 다소 낮은 수율을 보였다(Table 1). 본 연구진의 이전 연구에서도 에탄올 추출물이 가장 높은 수율을 나타냈으며, HWH 추출물이 가장 낮은 수율을 나타냈다[18].
본 연구팀의 이전 연구에서 적송잎에는 폴리페놀 화합물인 proanthocyanidin이 다량 함유되어 있으며, HWH 추출물이 가장 높은 항산화 활성을 보인다고 보고하였다[18]. 본 연구결과로 적송잎에 함유된 항균활성 성분이 황색포도상구균 및 항생제 내성균주인 PRSA와 MRSA에 대하여 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
5 mm의 생육저해환을 나타내었으며, 비파 잎 열수 추출물은 5 mg/disk의 농도에서 15 mm의 생육저해환을 나타냈다[22]. 본 연구에서의 disc당 열수추출물의 양과 생육저해환의 크기로 환산하면 0.25 mg/disc에서 33 mm, 0.025 mg/disc에서 21 mm로 로즈마리[9]와 비파추출물[22]에 비해 최소 20배, 최대 200배 이상의 높은 항균활성을 보였다. 한약재 8종의 황색포도상구균에 대한 항균활성에 관한 연구 결과, 소목 및 오배자의 메탄올 추출물은 50 mg/ml의 농도에서 21 mm의 생육 저해환을 보였고, 황금의 메탄올 추출물은 50 mg/ml 농도에서 16 mm의 생육저해환을 나타냈다[8].
2에 나타냈다. 사용한 모든 추출물들은 공통적으로 그람음성 장내세균인 대장균(E. coli)에 대한 항균활성은 나타내지 않았고, 열수 추출물은 황색포도상구균 표준균주와 methicillin 내성균주인 MRSA에 대해서만 항균활성을 보였다. HWH, HWE, 헥산 및 에탄올 추출물들은 그람양성 대표세균인 고초균(B.
열수 추출물을 제외한 추출물들 중에는 HWH와 HWE가 비교적 높은 항균활성을 보였다. HWH와 HWE 추출물은 50 mg/ml의 농도에서는 모두 약 13 mm의 생육저해환을 나타냈으며, 5 mg/ml의 농도에서는 모두 약 11 mm의 생육저해환을 나타냈다.
열수 추출물의 경우는 비록 고초균과 PRSA에 대한 항균활성은 나타내지 않았지만, 황색포도상구균 표준균주와 MRSA에 대해서는 50 mg/ml의 농도에서 약 33 mm, 5 mg/ml의 농도에서 약 21 mm의 생육저해환을 보여 가장 높은 항균활성을 나타냈다(Table 2). 천연물질의 황색포도상구균 및 MRSA에 대한 항균활성의 연구에 따르면 로즈마리의 메탄올 추출물은 5 mg/disc의 농도에서 17.
적송잎 추출물에 함유되어 있는 항균성 물질의 열 안정성을 조사하기 위해 각각의 용매 추출물들을 열처리한 후 고초균, 황색포도상구균 표준균주 및 항생제 내성균주인 PRSA와 MRSA에 대한 생육저해환을 측정한 결과를 Table 3에 나타냈다. 열처리 시료의 피검균에 대한 생육저해환의 크기가 대조군인 비열처리 시료의 생육저해 환의 크기와 비교하여 볼 때 크기 변화가 거의 없는 것으로 보아 적송잎 추출물의 항균물질은 열에 대하여 안정한 물질임을 알 수 있었다. Kim [17] 등의 보고에 의하면 손바닥 선인장 분말을 121℃에서 15분 처리하여도 항균활성의 변화가 없었다고 하였으며, Park [31] 등은 돌산갓의 열수 추출물을 121℃에서 30분 처리하여도 항균활성에 변화가 없다고 보고하였다.
한약재 8종의 황색포도상구균에 대한 항균활성에 관한 연구 결과, 소목 및 오배자의 메탄올 추출물은 50 mg/ml의 농도에서 21 mm의 생육 저해환을 보였고, 황금의 메탄올 추출물은 50 mg/ml 농도에서 16 mm의 생육저해환을 나타냈다[8]. 이들의 연구결과는 모두 본 연구에서 사용한 열수 추출물보다 유사하거나 낮은 항균활성을 보였으며, 메탄올 추출물은 식품이나 의약품 소재 및 첨가물로의 사용이 엄격히 금지되어 있다.
subtilis), 황색포도상구균 표준균주 및 항생제 내성균주인 PRSA와 MRSA 모두에 대해 항균활성을 나타냈다. 적송잎 추출물 처리농도가 증가함에 따라 항균활성을 나타내는 생육저해환의 크기가 비례적으로 증가하는 것으로 보아 농도 의존적으로 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
추출공정에 따른 적송잎 추출물의 수율 적송잎 건조분말 시료 3 kg을 추출공정에 따라 열수헥산 (HWH), 열수에탄올(HWE), 헥산, 에탄올, 열수 추출물로 제조한 결과, 에탄올 추출물이 17.6%로 가장 높은 수율을 보였고, HWH 추출물이 3.9%로 가장 낮은 수율을 나타냈다(Table 1). 또한, 헥산 추출물은 12.
후속연구
본 연구결과로 적송잎 추출물에 함유되어 있는 항균물질을 이용하여 열 안정성이 있는 항균성 식품첨가제의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
식품의 변질을 방지하기 위한 방법의 종류는?
식품의 변질을 방지하기 위한 방법으로 가열처리나 레토르트(retort) 등의 살균기술을 이용한 물리적인 방법과 식품의 저장 및 유통과정 중에 부패 및 변질을 일으키는 미생물을 사멸시키거나 증식을 억제시키는 식품보존제를 첨가하는 방법이 널리 사용되고 있으나, 이러한 방법들은 식품의 영양성분 파괴 및 품질저하 등을 유발하는 단점을 가지고 있다. 식품 보존제는 화학합성 보존제와 천연물로부터 항균성 물질을 분리하여 이용하는 천연 보존제로 나눌 수 있으며, 이 중 화학합성 보존제는 장기간 섭취할 경우 이들이 체내에 축적되면서 돌연변이나 기형을 유발하는 등의 안전성 문제가 있기 때문에 인체에 해가 적은 천연물로부터 항균성 물질을 검색하는 연구가 활발히 진행되고 있다[27,32].
식품의 변질을 방지하기 위한 방법의 단점은?
식품의 변질을 방지하기 위한 방법으로 가열처리나 레토르트(retort) 등의 살균기술을 이용한 물리적인 방법과 식품의 저장 및 유통과정 중에 부패 및 변질을 일으키는 미생물을 사멸시키거나 증식을 억제시키는 식품보존제를 첨가하는 방법이 널리 사용되고 있으나, 이러한 방법들은 식품의 영양성분 파괴 및 품질저하 등을 유발하는 단점을 가지고 있다. 식품 보존제는 화학합성 보존제와 천연물로부터 항균성 물질을 분리하여 이용하는 천연 보존제로 나눌 수 있으며, 이 중 화학합성 보존제는 장기간 섭취할 경우 이들이 체내에 축적되면서 돌연변이나 기형을 유발하는 등의 안전성 문제가 있기 때문에 인체에 해가 적은 천연물로부터 항균성 물질을 검색하는 연구가 활발히 진행되고 있다[27,32].
methicillin 내성 황색포도상구균 감염증 치료에 큰 어려움이 있는 이유는?
그 이후 MRSA의 출현빈도는 계속 증가하고 있으며, MRSA 감염증으로 인한 사망자의 비율 또한 1993년에 12%에서 2002년에 66%로 급증하였다. MRSA 는 일반 황색포도상구균과 달리 methicillin에 내성을 지닐 뿐만 아니라 cephalosporin, ampicillin, nafcillin 등과 같은 β-lactam 계열 항생제를 비롯하여 aminoglycoside 및 macrolides 계열의 항생제에 대해서도 내성을 지니고 있어 MRSA 감염증 치료에 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다[15].
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