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문제 정의
- aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis. 등 4종의 세균과 Kocuria rhizophila, Corynebacterium ammoniagenes 등 2종의 소와각질융해증 유발 세균에 대한 항균활성과 인체 피부세포에 대한 세포독성에 대하여 연구하여 그 결과를 보고하는 바이다.
- 오배자의 피부상재균에 대한 항균활성을 측정히.고자 disk diffusion법을 사용하여 Staphylococcus aureus subsp.
제안 방법
- Human dermal Fibroblsts를 5^103 4 cell/ 씩 24 well tissue culture plate에 분주하여 세포를 12시간 이상 배양한 후, PBS로 세척하고 배지를 넣은 다음 200 mg/r의 오배자 추출물 5 成와 10 를 처리하였다. 그 후 COz incubator(37t, 5%)에서 24 시간 동안 배양한 후 1 /의 MTT 용액을 well 당 0.
- Human dermal Foblasts를 cell/ 씩 60 nun wltu龙 dish에 분주하여 세포를 12시간 이상 배양을 한 후, PBS 로 세척하고 200 의 오배자 추출물 5 와 10 틀 처리하였다. 실험조작 후 dish를 CO2 incubator(37sC 5%)에서 24시간 동안 배양한 후, 피부세포에 대한 독성과 형태 변화를 위상차 현미경으로 관찰하였다.
- 멸균된 petri di를 이용하여 각 균주에 해당되는 배지에 각각의 균주를 100씩 도말하고, 멸균된 pap disc(8 Whitman, USA)를 균등하게 올려놓은 다음 각 농도별로 시료를 처리하였다. 이를 배1양하면서 paper disc 주위의 억제대의 크기를 관찰하였다.
- 5 씩 넣고 37℃에서 3시간 배양을 하였다. 반응결과 형성된 formazan 결정을 0.5 isopixpmol토 용해시킨 후 ELISA 로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(coimol 100%)과 비교한 실험군의 세포 생존율을 백분율토 나타내었다,
- 삼우 과학의 SW-029 배양기를 이용하여 disc diffusion 법에 이용된 배지를 3±03T에서 각 균주의 발생시간에 따라 배양하였다.
- 실험조작 후 dish를 CO2 incubator(37sC 5%)에서 24시간 동안 배양한 후, 피부세포에 대한 독성과 형태 변화를 위상차 현미경으로 관찰하였다.
- 이를 배1양하면서 paper disc 주위의 억제대의 크기를 관찰하였다.
대상 데이터
- 0 g, Distilled water 1000 )로는 Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis. Bacillus cereusr Kocuria rhizophila, Corynebacterium ammoniaeenes 를 배양하였다. Trypticase soy agar(Pancreatic digest of casein 17.
- 피부상재균은 Bacillus subtilis (KCCM 11316), Staphylococcus aureus subsp. aureus (KCCM 11335), Staphylococcus epidermidis (KCCM 35494), Bacillus cereus (KCCM 40935) 등 4종을 사용하였다. 소와각질융해증 유발균은 Kocuria rhizophila (KCCM 11236), Corynebacterium ammoniagenes (KCCM 1174) 등 2종을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 균주는 피부상재균과 소와각질융해증 유발균을 사용했다. 피부상재균은 Bacillus subtilis (KCCM 11316), Staphylococcus aureus subsp.
- 본 실험에 사용한 오배자는 상지대학교 한의과대학 본초학 교실의 검수틀 거쳐 사용하였으며, 건조된 오배자 100 g을 증류수 1000에 넣어 전탕 한 후 동결 건조하여 26.1 g(수득률 26.1 %)을 얻었다. 실험에 앞서 필요한 농도로 조정하여 사용하였다.
-
4) 세포주 및 세포배양
세포독성에 사용한 세포는 Human dermal blast토서 Cionetics(San Diego, CA)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양은 Human dermal Fibroblasts 세포를 10% fetal bovine serum(FBS) 이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM medium, Diffico, USA)에 penicillin/stfeptomy£in(sigma) 100 陽 /i做가 첨가된 배지에서 배양하였다.
- 세포배양은 Human dermal Fibroblasts 세포를 10% fetal bovine serum(FBS) 이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM medium, Diffico, USA)에 penicillin/stfeptomy£in(sigma) 100 陽 /i做가 첨가된 배지에서 배양하였다.
- aureus (KCCM 11335), Staphylococcus epidermidis (KCCM 35494), Bacillus cereus (KCCM 40935) 등 4종을 사용하였다. 소와각질융해증 유발균은 Kocuria rhizophila (KCCM 11236), Corynebacterium ammoniagenes (KCCM 1174) 등 2종을 사용하였다. 해당 균주는 모두 한국종균협회에서 분양 받아 고체배지에서 배양 후 실험하였다.
- 실험에 사용한 배지는 2종류를 사용하였다. Nutrient 연fxtrct 3.
- 소와각질융해증 유발균은 Kocuria rhizophila (KCCM 11236), Corynebacterium ammoniagenes (KCCM 1174) 등 2종을 사용하였다. 해당 균주는 모두 한국종균협회에서 분양 받아 고체배지에서 배양 후 실험하였다.
데이터처리
- Inc. USA)를 이용하여 independent-sample t-tes훌로 검정하였다. 그 결과가 p<0.
성능/효과
- aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidemics에 대하여 2 mg/m 이상의 농도에서 모두 항균활성을 나타내었다. 오배자는 소와각질융해증의 유발균인 Kocuria rhizophila, Corynebacterium ammoniagenes 에 대하여 200 mg/nC의 농도에서 항균활성을 나타내었다.
- 본 실험의 경우 Staphylococcus aureus subsp. aureus, Bacillus cereusr Bacillus subtilis, Staphylococcus idermidis 등 4종의 세균에 대하여 항균활성을 측정한 결과 대부분 200 20 2 /에서 항균 억제대가 관찰되었다(Fig. 1).
- 2 mg/의 농도별로 오배자 시료를 처리하였다. 그 결과 2종의 세균에 대한 활성을 200 mg/에서 확인 할 수 있었다(Fig. 2).
- 0004%에서는 음성대조군에 비해 세포생존율을 유의하게 증가시켰다고 보고했다. 본 실험의 경우 200 tng/의 농도에서 5 成 와 10 를 피부세포에 처리하여 세포독성을 본 결과 5 必에서 95% 이상의 세포생존율을 , 10 에서 80% 이하의 세포생존율을 보였다. 또한 현미경 관찰에서 대조군의 경우 세포들이 잘 부착되어 배양되었고, 오배자 5 nA 처리시 대조군과 비슷하게 성장하였으나, 10 의 경우 세포독성이 관찰되었다(Fig.
- 본 실험의 경우 Kocuria rhizophila, Corynebacterium ammoniagenes 등 2종의 세균에 대한 항균활성을 측정한 결과 200 mg/의 농도에서 항균 억제대가 관찰되었다(Fig. 2).
- 피부세포에 대한 오배자의 독성을 측정한 결과 오배자 200 昭/襯의 농도 5 를 처리한 군에서는 대조군에 비하여 95% 이상세포생존율로 나타났으며' 10 로 처리한 군에서는 80% 이하의 세포생존율을 보여주었다(Fig. 3).
후속연구
- 따라서 피부세포에서 본 실험에 시용한 시료추출물의 농도는 추출물 200 mg/M의 농도 10 이하에서 사용하고 세포독성을 일으키는 메카니즘은 향후 연구를 더 진행되어야 할 것이라 사료된다.
- 이상의 결과로 오배자의 항균활성을 확인하였으나 높은 농도에서는 세포독성이 있는 것으로 보이며, 향후 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 오배자의 항균활성을 확인하였으며, 높은 농도에서는 세포독성이 있는 것으로 보이므로 향후 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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