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문제 정의
- 그러나, 대부분의 실험이 세포주가 아니면 동물 실험 위주였던 것과, 메탄올, 에틸 아세테이트 등을 용매로 하거나 전탕액 이었으므로 보다 효과적인 임상적 유용성을 위해 동물 생체 실험에 비만 세포주 실험을 추가하였으며, 에탄올을 용매로 사용하였다. 또한 기존의 염증연구에서는 보통 기본적인 cytoM에 대한 변화만을 보는데 비해, 여기에서는 NFkB의 변화와 전사인자인 NFkB를 상부에서 조절하는 MAPKs 기전을 밝히고자 하였다.
- 본 연구에서는 동물실험인 PCA 반응 시험과 쥐 비만세포의 히스타민 분비를 통한 苦蔘추출물의 억제 효과와 비만세포주인 HMG1 세포에 PM认와 calcium ionophore A23187 로 자극하여 분비하는 염증성 물질에 대한 苦蔘 抽出物의 억제효과를 보여줌으로서, 苦蔘 抽出物이 type 1 인 즉시형 과민증에 나타나는 알레르기성 염증반응을 조절하는 효과가 있음을 규명하려 하였고 苦蔘(SFA) 抽出물의 알레르기성 염증에 미치는 효과를 분자생물학적으로 확인해 보고자 하였다.
- 이에 저자는 苦蔘의 에탄올 추출물이 생체 내 국소성 즉시형 알레르기반응에 미치는 영향, 히스타민 분비에 미치는 영향, 사람 비만 세포에서 세포증식 효과, 염증매개 사이토카인인 TNF-a, Hr6, E-8 억제효과와 MAPKs 활성에 미치는 영향, NFkB 전사활성에 미치는 영향을 통해 항염증 효과를 살펴보고자한다.
가설 설정
- 3. A. Effect of SFA on PMA plus A23187-stimulated TNF-a expression levels. The HMC-1 cells (1*106cell/ml) incubated with various cmcentrations (0.
제안 방법
- HMG1 세포에 苦蔘(SFA) 추출물을 농도별로 처리했을 때 생존율을 MIS (Promega, Nfadison, LEA) assay로 조사하였다.
- Vortexing하여 세포를 섞은 다음 12, 000 rpm, 4℃, 3분간 원심분리하여 상층액을 얻었다 얻은 상층액은 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다 Iinferase assay를 위해 보관 중인 세포용해된 상층액 100㎕ 를 상온에서 Luciferase substrate 20㎕씩 불투명한 96well 에 넣어 luminometer (1420 luminescence counter, Perkin Elmer)로 측정하였다. Luciferase aEvity는 측정값을 총 단백질량으로 나누어 수치를 구한 뒤 (relative light units per milligram of protein), transfection된 정 상세 포를 기준으로 fo너값을 구하였다.
- 苦蔘의 알레르기성 염증 억제 효과를 알아보기 위해, 쥐의 생체 실험을 통하여 생체 내 국소성 즉시형 알레르기 반응, 쥐의 복강 내 비민세포에서 히스타민 분비에 미치는 영향을 알아보았으며, 80% ethanol로 추출한 苦蔘 抽出物 (SFA)이 사람 비만세포에서의 세포증식 효과, PMA와 A23187로 유도한 TNFq, IL-6, IL-8등 염증매개물질 생성 억제효과와 MAPKs 활성에 미치는 영향, NFkB 전사활성에 미치는 영향 등을 통해 항염증 효과를 살펴 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 苦蔘추출물을 0.05, 0.1, 0.2mgW의 농도로 HMC-1 세포에 1시간 전 처 리한 후 PMA(25 ng/ml) 와 A23187 (1破로 4시간 동안 처리하여 결과를 얻었다. 그 결과 苦蔘 추출물에 농도 의존적으로 TSF-a의 단백질 발현량과 분비량이 현저히 감소되어 있었다.
- 그 후 약재를 1시간 전 처리한 후 25nM M와 IpM A23187을 24 시간동안 반응시켰다. 세포를 차가운 PBS로 세척 한 후 lysis bufer (Luciferase Reporter Assay System; Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 세포를 용해시켰다.
- 등이 있다. 그러나, 대부분의 실험이 세포주가 아니면 동물 실험 위주였던 것과, 메탄올, 에틸 아세테이트 등을 용매로 하거나 전탕액 이었으므로 보다 효과적인 임상적 유용성을 위해 동물 생체 실험에 비만 세포주 실험을 추가하였으며, 에탄올을 용매로 사용하였다. 또한 기존의 염증연구에서는 보통 기본적인 cytoM에 대한 변화만을 보는데 비해, 여기에서는 NFkB의 변화와 전사인자인 NFkB를 상부에서 조절하는 MAPKs 기전을 밝히고자 하였다.
- 하였다. 반응액 중 qde 별로 각각 5 ul를 취해서 2.0% 한천 겔에 전기 영동하고 ethidium bromide로 염색하여 PCR 산물을 확인하였다.
- 하고 있다. 본 실험에서는 A23187과 PMA로 자극된 HMG1 세포에서 염증 반응 조절 효과를 관찰하기 위해 EUSA 방법으로 苦蔘의 1시간 전 처리한 비만세포의 배양액으로부터 TNF-a, IL-6, 그리고 Ⅱ.-8 을 분비량을 측정하였다 그 결과 TN&i의 경우 苦蔘 추출물 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 특히, 0.
- 이용하여 실험하였다. 사이토카인 측정을 위해 Kim and Lee20의 EJJSA방법을 변형하여 사용하였다.
- 세포에 유전자 도입을 위해 transfection을 수행하였다 6시간 후 혈청이 있는 배지로 갈아주고 24 시간을 배양하였다. 그 후 약재를 1시간 전 처리한 후 25nM M와 IpM A23187을 24 시간동안 반응시켰다.
- 이것을 nitrocellulose membtane(Schleicher8&hudl Bios- denoe, Dassd, Germany) 에 transfei하여 FEST에 1% skim milk 와 1% BSA가 든 blo&ing 용액에서 1시간 동안 Hoddiig한후 PBST로 5분간 2회 세척하였다 Anti-NFKB, amiplKB, anti-lKB antibodies(Santa Guz, Califormia)를 이용하여 1 차 항체반응을 4℃에서 16 시간 반응 시킨 다음 PBST로 2차 항체반응을 상온에서 1시간 동안 반응시켰다 PBST 로 10분, 15분, 30분간 세척한 후 ECL(Amersham Bios- dences, EQ로 발광하여 X-ray film에 노출시켜 단백질 발현 분석을 실시하였다.
- 흰쥐의 복강 내 비만세포를 분리하기 위해 복강 내 Tyrode buffer A (10 mM HEPES, 136 mM NaCl, 5 mM KC1, 2 mM G1C12, 2.75 mM NaH2PO4, 그리고 0.1% bovine setg를 10 요 주입하고, 약 90 초간 복막을 부드럽게 맛사지 해 준 후 복막을 열어 파스테르파이펫으로 세포를 모았다. 모든 복강 내 세포들은 150xg에서 10 분간 원심분리하고 난 후 모아진 세포를 Tyrode Mferjc.
대상 데이터
- Anti-human IL-6/IL-8 항체, biotinylated anti-human H-6/IL-8 항체, 재조합 human DL-6/IL-8 단백질은 BD Biosciences(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- Anti-human TNF-a 항체, biotinylated anti-human TNF-ct항체, 재조합 human TNF-a는 R&D Systems(Min- neapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- Confound 48/80, anti-DNP IgE, DNP-human serum albumin (HAS), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), A23187, evans blue는 Sigma aldrich(St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였으며, MIS는 promega (Madison, UI, USA) 에서 구입하였다.
- 苦蔘(Sopbora flauescens Aiton, 옴니 허브 경북, Korea) 100g을 정량 후 80% 에탄올 2ℓ를 가하여 30분 동안 2회에 걸쳐 초음파진동을 이용하여 추출액을 획득하였다. 감압 여과한 후 감압 농축기를 사용하여 농축한다으 동결 건조기로 동결 건조하였다 얻어진 분말 14.
- 세포배양액인 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (INDM)은 QBGOBRUGrandIshnd, NY, USE)의 제품을 사용하였다.
- 실험동물로는 흰쥐를 오리엔트 바이오 (경기도 성남) 에서 구입하여 실험에 사용하였다 동물은 4마리당 한 cage에 사육하였으며, 온도 22±2℃, 상대습도 55±5℃의 환경을 유지하였다.
- 히스타민 즉정을 위해 histamine kit을 Oxford Biomedical Research (Oxford, MI, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 결과는 측정값의 평균 土 표준편차 값을 기준으로 통계분석하였다 실험 결과값의 통계적 분석을 위해 independent t-tests 을 사용하여 각 실험군 간의 유의성을 분석하였고 그 유의수준은 P<0.05로 하였다.
이론/모형
- 2mg/ml) of SFA for 1h and then treated with PMA plus A23187 for 4h. The IL-6 secreted protein levels in the supermatant were measured with the ELISA assay.
- 2mg/ml) of SFA for 1h and then treated with PMA plus A23187 for 4h. The IL-8 secreted protein levels in the supernatant were measured with the ELISA assay.
- 2mg/ml) for 1h and then stimulated with PMA plus A23187 for 24h. The NFkB activity was examined with a luciferase assay.
- 배양된 HMC-1 세포의 배지내에서 TNF-ct, IL-6, 그리고 IL-8 을 EIISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 이용하여 실험하였다. 사이토카인 측정을 위해 Kim and Lee20의 EJJSA방법을 변형하여 사용하였다.
-
7) 핵 및 세포질 단백질 분리
분리하여 얻은 세포질과 핵 단백질은 Brad-ford as- say방법21을 이용하여 정량하여 사용하였다.
- 생체 내 국소성 즉시형 알레르기 반응을 보기 위해 Braga & Mota'*1의 방법을 이용하여 실험동물 모델로 사용하였다.
- 얻어진 상층 액으로 히스타민 분비 억제율을 구하기 위해 히스타민 키트를 이용하여 enzyme immunoassay 방법으로 450 nm에서 측정하였다. 히스타민 분비 억제율은 히스타민 분비 억제율 (%)=(A-B)xl00/A 같은 식으로 계산하여 구하였다.
- 얻은 총 단백 질을 Brad-ford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Cakfbmia)방법을 이용하여 정량한 다음 4%g의 단백질을 15%acrylamide gel에 전기영동 하였다. 이것을 nitrocellulose membtane(Schleicher8&hudl Bios- denoe, Dassd, Germany) 에 transfei하여 FEST에 1% skim milk 와 1% BSA가 든 blo&ing 용액에서 1시간 동안 Hoddiig한후 PBST로 5분간 2회 세척하였다 Anti-NFKB, amiplKB, anti-lKB antibodies(Santa Guz, Califormia)를 이용하여 1 차 항체반응을 4℃에서 16 시간 반응 시킨 다음 PBST로 2차 항체반응을 상온에서 1시간 동안 반응시켰다 PBST 로 10분, 15분, 30분간 세척한 후 ECL(Amersham Bios- dences, EQ로 발광하여 X-ray film에 노출시켜 단백질 발현 분석을 실시하였다.
성능/효과
- "의 mRNA 수준을 조사하기 위해 RT-PCR 을 수행하였다. RT-PCR 결과 苦蔘 추출물 0.1 mg/ml 농도에서 약간 감소하였으며, 0.2 mg/ml의 농도에서는 "의 mRNA 발현이 아무것도 처리하지 않은 정상 세포 수준과 비슷하게 감소되어 나타났다.
- 그 결과 苦蔘 주줄물 0.2 mg/ml에서 PMA plus A23187로 유도된 "의 생성량이 70% 정도 현저하게감소됨을 알 수 있었다(Fig. 6: p<0.05). IL-6의 mRNA 발현율에서도 0.
- 본 실험에서는 A23187과 PMA로 자극된 HMG1 세포에서 염증 반응 조절 효과를 관찰하기 위해 EUSA 방법으로 苦蔘의 1시간 전 처리한 비만세포의 배양액으로부터 TNF-a, IL-6, 그리고 Ⅱ.-8 을 분비량을 측정하였다 그 결과 TN&i의 경우 苦蔘 추출물 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 특히, 0.2 闸ml의 농도에서 50% 이상의 높은 저해율을 보였다(Fig. 3, 4). IL*의 경우도 마찬가지로 농도 의존적으로 그 분비량이 억제되는 것이 보였으며, A23187과 PMA 단독으로 유도된 HMC-1 세포 배양액의 IL-6 생성 량과 0.
- 1. 생체 내 국소성 즉시형 알레르기 반응에서 30% 이상의 억제율을 보였다.
- 2. 쥐의 복강내 비만세포에서 고삼추출물은 히스타민 분비를 억제하였다.
- 3. HMC-1 세포에서의 苦蔘(SFA)추출물에 의한 세포증식 효과는 유의성 있는 변화가 없었다.
- 4. HMG1 세포에서 苦蔘 추출물에 의해 농도 의존적으로 TNF-a 의 단백질 발현량과 분비 량이 현저히 감소하였다.
- 5. HMC-1세포에서 苦蔘 추출물 Q2 mg/ml 농도에서 麋의 단백질생성량이 70% 정도 현저하게 감소됨을 알 수 있었다.
- 6. HMGI세포에서 苦蔘 추출물에 의해 농도 의존적으로 IL-8 의 분비 량이 감소되는 것을 알 수 있었다.
- 7. HMG1 세포에서 苦蔘 추출물 0.2 mg/ml의 농도에서 인산화된 p38, JNK의 감소를 확인할 수 있었지만, 인산화된 ERK에서 감소현상을 관찰할 수 없었다.
- 8. HMC-1 세포에서 苦蔘 추출물에 의해 0.lmg/ml 과 0.2 mg/ml의 농도에서 NFkB 단백질이 뚜렷하게감소되었으며, 또한 세포질 내에서 苦蔘 추출물 0.2 mg/ml의 농도에서는 인산화된 IkB가 감소되어 나타났고 苦蔘 추출물 0.2 mg/ml의 농도로 처리한 trans- ffection된 세포에서는 NFkB의 프로모터 활성이 현저히 감소되어 나타났다.
- 3, 4). IL*의 경우도 마찬가지로 농도 의존적으로 그 분비량이 억제되는 것이 보였으며, A23187과 PMA 단독으로 유도된 HMC-1 세포 배양액의 IL-6 생성 량과 0.2 mg/ml의 농도에서의 HMG4세포배양액의 IL-6 생성량을 비교하였을 때 70%의 높은 저해율을 나타내었다(Fig. 5). 또한 瞄의 경우에도 0.
- NFkB의 프로모터 활성에 대해 알아보기 위해 luciferase assay를 수행한 결과, transfection만 된 세포에 비해 PMA와 A23187로 유도된 transfection세포에서는 NFkB의 프로모터 활성이 3배 이상 증가한 반면, 苦蔘 추출물 0.2 mg/ml의 농도로 처리한 transfection된 세포에서는 현저히 감소되어 나타났다(Fig. 10: p<0.05)
- compound 48/80 단독으로 처리한 세포에서의 히스타민 분비량 10.92±2.147 ug/ml에 비해 苦蔘 0.2 mg/ ml의 농도에서 분비된 히스타민량이 7.089±0.151 ug/ ml로 억제되어 나타났다(Fig 2, p<0.05).
- 苦蔘의 MAPKs의 활성을 측정하기 위해 苦蔘 0.05 mg/ml부터 0.2 mg/ml의 농도로 PMA와 A23187 로 유도하기 1시간 전에 처리한 후 PMA와 A23187로 30 분 동안 반응시켰다 苦蔘 0.2 mg/ml의 농도에서 인산화된 p38, JNK의 감소를 확인할 수 있었지만, 인산화된 ERK 에서는 감소현상을 관찰할 수 없었다.
- 조절된다. 苦蔘이 I-kB의 인산화를 억제함으로써 NFkB의 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 9). 또한 NFkB의프로모터 부위의 활성을 苦蔘의 억제 효과를 관찰할 수 있었다(Fig.
- 2mgW의 농도로 HMC-1 세포에 1시간 전 처 리한 후 PMA(25 ng/ml) 와 A23187 (1破로 4시간 동안 처리하여 결과를 얻었다. 그 결과 苦蔘 추출물에 농도 의존적으로 TSF-a의 단백질 발현량과 분비량이 현저히 감소되어 있었다. 특히 苦蔘 0.
- Azzolin의보고끄에 의하면 TNF-a, IL-6, IL-8은 NFkB에 조절 받는다고 한다. 그래서 본 실험에서는 비만세포에 苦蔘 추출물 처리 후 NFkB 및 NFkB 억제자인 IkB의 단백질 발현정도를 관찰한 결과 핵 안에 존재하는 NFkB는 PMA와 A23187로 유도하였을 때 현저히 증가한 반면, 苦蔘 추출물을 0.05mg/ml부터 0.2mg/ml까지의 농도로 처리 하였을 때 O.lmgAnl과 0.2 mg/ml의 농도에서 NFkB 단백질이 뚜렷하게 감소되어 있음을 확인하였다. 또한 세포질 내에서 NmlB와 결합하여 존재하다가 외부자극을 받으면 IkB는 인산화되어 나타난다.
- 9). 또한 NFkB의프로모터 부위의 활성을 苦蔘의 억제 효과를 관찰할 수 있었다(Fig. 10).
- 필요하다. 본 실험에서 苦蔘추출물이 0.1 mg/i쇼과 0.2 mg/ml에서 NFkB 및 인산화된 MAPKs를 억제함을 관찰할 수 있었다(Fig. 9, 10).
- 본실험에서는 苦蔘의 즉시형 알레르기 반응의 억제 효과를 보기 위해 동일한 조건의 실험동물인 흰쥐에 생리식염수를 사용하여 대조군으로 사용하였다 정량한 결과 생리식염수를 경구투여한 후 DNP-HSA를 정맥주사한 대조군과 비교해 보았을 때 그 부위의 색깔이감소되어 나타났으며 파란색 색소의 용출량에서도 30%이상의 억제율을 나타내며 의미있게 감소되었다 (Fig.l, p<0.05).
- 그 결과 苦蔘 추출물에 농도 의존적으로 TSF-a의 단백질 발현량과 분비량이 현저히 감소되어 있었다. 특히 苦蔘 0.2mg/㎕의 농도에서는 PMA(25ng/ml)와 A23187(1uM) 로만 유도된 TSEa의 생성율과 비교하였을 때 50% 이상의 억제효를 보였으며(Fig. 3, Fig 4: p<0.05), mRNA의 발현도 PMA(25ng/ml)와 A23187(luM)로만유도된 n/의 발현량보다 높은 억제효과를 보여주었다(Fig. 5).
- 한다. 하지만, PMA 단독으로는 비만세포의 탈과립이 나타나지 않으므로 A23187과 PMA를 모두 사용하였다 먼저 苦蔘의 농도를 다르게 하여 세포를 처리한 후 A23187과 PMA로 세포의 활성을 유도하여 세포 생존율을 비교한 실험에서, 苦蔘은 0.4 国ml 의 농도까지만 세포증식에 별다른 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다.
후속연구
- 5, 7, 8). 이러한 결과로 미루어보아 苦蔘추출물이 염증매개물질인 TNF-u, 11-6, JL-8 의 생성을 억제함으로써 염증치료에 효능이 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 연구 결과에서, 苦蓼의 알레르기성 염증 억제작용을 생체 실험과 분자생물학적 차원에서 확인할 수 있었으며 이러한 결과를 통해 苦蔘이 탈과립된 비만세포에서 I-kB/NFkB 및 MAPKs 경로의 발현을 조절함으로써 이에 수반되는 염증매개물질인 TNF-O, IL-6, IL-8의 생성을 억제하는 효과가 있어, 苦蔘을 이용한 알레르기성 염증 치료에 중요한 단서로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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