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문제 정의
- 5). 이는 BG가 알도스테론을 감소시켜 미네랄 대사 조절과 전해질 밸런스 유지에 효과가 있음을 입증하는 결과라 하겠다.
- 이에 저자는 黑蔘이 肺性 고혈압 랫트에 미치는 영향을 알아보고자, 고혈압 유발 랫트 모델을 만들어 黑蔘 추출물을 구강투여하고 실험한 결과 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 흑삼(BG)이 고혈압에 미치는 효과를 검증하기 위하여 이를 시료로 고혈압 병태 모델 내 다양한 혈압 관여 인자들의 변화와 고혈압의 발병 기전과 유관한 활성산소 활성에 미치는 영향 등을 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- Sprague-Dawley (SD) rat 을 무작위로 6마리씩 나누어 정상군(Normal), 대조군(Control) 그리고 실험군(BG)으로 설정하였다. 대조군과 BG 투여군은 deoxycorticosterone acetate (DOCA) 25 mg/kg을 피하 주사하였고, 실험군은 DOCA 투여 후 BG를 250 mg/kg/day 농도로 매일 구강투여하였다.
- The control group were injected subcutaneous with Monocrotaline (40 mg/kg) . The treatment group were injected subcutaneous with DOCA and orally administered with BG extract for 4 weeks (once a day. 250 mg/kg/ 500 ㎕). Normal : Normal SD rat.
- The control group were injected subcutaneous with Monocrotaline (40 mg/kg). The treatment group were injected subcutaneous with Monocrotaline and orally administered with BG extract for 4 weeks (once a day. 250 mg/kg/ 500 ㎕). Normal : Normal SD rat.
- The control group were injected subcutaneous with Monocrotaline (40 mg/kg). The treatment group were injected subcutaneous with Monocrotaline and orally administered with BG extract for 4 weeks (once a day. 250 mg/kg/ 500 ㎕). Normal : Normal SD rat.
- 각 대조 군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 p < 0.05일때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 각 실험군별로 적출한 부신, 신장, 간, 심장을 10% 중성 포르말린에 48시간 고정하여 고정이 완료된 각 조직들은 흐르는 수돗물에서 12시간 수세하여 조직 내 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위해 60%에서부터 100%알코올에 이르기까지 농도 상승 순으로 통상의 방법에 따라 탈수하고, xylene에 투명과정을 거친 다음 파라핀 블럭을 제작하였다.
- Sprague-Dawley (SD) rat 을 무작위로 6마리씩 나누어 정상군(Normal), 대조군(Control) 그리고 실험군(BG)으로 설정하였다. 대조군과 BG 투여군은 deoxycorticosterone acetate (DOCA) 25 mg/kg을 피하 주사하였고, 실험군은 DOCA 투여 후 BG를 250 mg/kg/day 농도로 매일 구강투여하였다.
- 혈압과 심박수는 혈압측정기(CODA6, Kent, USA)를 사용하여 측정하였다. 동물들의 안정을 위해 측정 전에 3회 이상 홀더에 적응을 시켰고, 혈압과 심박수는 10회 이상 측정하여 평균을 결과로 사용하였다.
- 몸무게는 실험 종료 하루 전에 전자저울(CAS, Korea)을 이용하여 측정하였다. 심장과 신장은 ether로 마취 후 채혈한 다음에 적출하여 지방과 다른 조직들을 제거하였다.
- 나머지 6 ml의 혈액을 EDTA 첨가 튜브에 넣어 혈장을 분리하였다. 분리한 혈청은 생화학 기기(AU400, Olimpus, U.S.A)를 이용하여 GOT, GPT, BUN, creatinine, uric acid를 측정하였고, Na+, K+, Cl의 측정은 전해질 측정기(NOVA5, Japan)를 이용하였다. 혈장 성분은 감마 카운터기(WIZARD 1470, Finland)를 이용하여 핵의학적 방법으로 aldosterone, dopamine, epinephrine, norepinephrine을 측정하였다.
- 시료 추출 방법은 BG 200 g을 한약 약탕기에 넣고, 정제수 1,500 ml와 같이 혼합하여 3시간 열탕하여 추출한 후 흡입 여과하였다. 이를 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 BG를 분리한 후, 다시 동결건조기에서 24시간 동결 건조하여 분말 31 g을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저온냉동고(-80℃)에서 보관하면서, 실험에 따라 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.
- 제작된 블록은 박절기(microtome)를 이용하여 3∼4 ㎛ 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 다음 hematoxyline 과 eosin (H&E) 일반 염색을 실시하여 광학현미경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다.
- 각 실험군별로 적출한 부신, 신장, 간, 심장을 10% 중성 포르말린에 48시간 고정하여 고정이 완료된 각 조직들은 흐르는 수돗물에서 12시간 수세하여 조직 내 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위해 60%에서부터 100%알코올에 이르기까지 농도 상승 순으로 통상의 방법에 따라 탈수하고, xylene에 투명과정을 거친 다음 파라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블록은 박절기(microtome)를 이용하여 3∼4 ㎛ 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 다음 hematoxyline 과 eosin (H&E) 일반 염색을 실시하여 광학현미경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다.
- 혈압과 심박수는 혈압측정기(CODA6, Kent, USA)를 사용하여 측정하였다. 동물들의 안정을 위해 측정 전에 3회 이상 홀더에 적응을 시켰고, 혈압과 심박수는 10회 이상 측정하여 평균을 결과로 사용하였다.
- A)를 이용하여 GOT, GPT, BUN, creatinine, uric acid를 측정하였고, Na+, K+, Cl의 측정은 전해질 측정기(NOVA5, Japan)를 이용하였다. 혈장 성분은 감마 카운터기(WIZARD 1470, Finland)를 이용하여 핵의학적 방법으로 aldosterone, dopamine, epinephrine, norepinephrine을 측정하였다.
대상 데이터
- Deoxycorticosterone Acetate (DOCA), Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS-A : Sigma Co, USA), RPMI 1640, DNase type, Penicillin, Streptomycin, Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 3.8% Sodium citrate, Bovine serum albumin (BSA) 등은 Sigma Co (USA) 제품을 사용하였고, Methy ether (Junsei, Japan) 등을 사용하였고, 이 밖에 일반 시약은 특급 시약을 사용 하였다.
- 본 실험에 사용된 실험용 쥐는 7주령, 체중 200-220 g 의 雄性 SD (Sprague-Dawley Rat, 대한바이오링크, 충주, Korea)로 실험 당일까지 고형사료(슈퍼피드, 강원도, Korea)를 자유 식이하면서 물을 충분히 공급하였다. 실온 22±2℃, 상대습도 50±10%, 조명시간 12시간(07 : 00～19 :00), 조도 150～300 Lux로 설정하여 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 쥐만을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 흑삼(Black Ginseng 이하 BG)은 금산인삼시장에서 수삼으로 구입하여, 대전대학교 한의과대학 본초학교실에서 증숙기를 이용하여 9회 증숙 제조하여 정선한 다음 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 기기는 Ice-maker (Vision, Korea), Serum separator (녹십자, Korea), Centrifuge (Beckman Co., USA), Rotary vaccum evaporator (Büchi 461, Switzerland), Deep freezer (Sanyo Co, Japan), Freeze dryer (Eyela Co, Japan), Autoclave (Hirayama, Japan), Ultrasonic cleaner (Branson Ultrasonics Co, USA), Roller Mixer (Gowon scientific technology Co, Korea), 한약유출기(웅진, Korea), Spectrophotometer (Shimazu, Japan), Non invasive blood pressure system (Kent, USA), Balance (Cass, korea), 생화학기기(AU400, Olimpus, Japan), 감마 카운터기(WIZARD 1470, Finland) 등을 사용하였다.
- 실온 22±2℃, 상대습도 50±10%, 조명시간 12시간(07 : 00～19 :00), 조도 150～300 Lux로 설정하여 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 쥐만을 선별하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과를 ANOVA multi t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1)로 분석하여 p값을 구하였다. 각 대조 군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 p < 0.
성능/효과
- 1. BG는 대조군에 비하여 유의성 있게 체중, 심장, 신장 무게의 유지시키는 효과를 나타내었다.
- 2. BG는 대조군에 비하여 혈압 및 심박수에 대하여 유의성 있는 강하 효과를 나타내었다.
- 4. 신장 그리고 폐의 조직화학적 염색 소견에서 BG 투여군은 대조군에 비하여 정상에 근접한 상태의 소견을 나타냈다.
- Monocrotaline 고혈압 쥐의 몸무게에 미치는 영향을 측정한 결과, 정상군은 481±21 g, 대조군은 446±22.5 g으로 나타나, 정상군에 비해 대조군의 체중이 유의성 있게 감소되었다(* : p < 0.05).
- Monocrotaline 고혈압 쥐의 심박수에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 419±36.3 times/min, 정상군은 336.1±7.1 times/min로 나타나 정상군에 비하여 대조군이 유의성 있는 증가를 나타내었다(** : p < 0.01).
- Monocrotaline 고혈압 쥐의 혈압에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 175.2±5.4 mmHg, 정상군은 129.1±1.2 mmHg로 나타나 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있는 증가를 나타내었다(*** : p < 0.001).
- 고혈압 쥐의 plasma aldosterone에 미치는 영향을 측정한 결과, 정상군은 131.8±25.7 pg/ml, 대조군은 200.6±37.2 pg/㎖로 나타나 정상군에 비해 대조군이 유의성 있게 증가되었다(** : p < 0.01).
- 3). 또한 대조군에 비하여 BG 투여군에서 심박수도 낮추는 효과를 나타내었다(Fig. 4).
- 반면 BG의 투여군에서는 정상군과 유사한 몸무게의 유지를 보임으로써 신체 상태를 통한 간접적인 효과를 증명 하였다. 또한 몸무게에 대한 심장과 신장의 무게는 정상군에 비하여 대조군에서 증가하였으며, BG의 투여를 통해 정상군에 가깝게 유지하는 것으로 나타났다 (Fig. 2).
- 알도스테론의 분비를 자극하는 인자로서는 부신피질호르몬, 칼륨, 앤지오텐신Ⅱ 등이 있는데29), 레닌-앤지오텐신계가 활성화되면 알도스테론의 혈중 농도가 상승하여 체내에 나트륨 농도가 증가하여 전해질 농도의 균형을 깨뜨리게 되며 혈압 상승의 원인이 되기도 한다30,31). 본 연구에서 plasma 내 알도스테론 농도는 BG 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하는 효과를 나타내었다(Fig. 5). 이는 BG가 알도스테론을 감소시켜 미네랄 대사 조절과 전해질 밸런스 유지에 효과가 있음을 입증하는 결과라 하겠다.
- 신장은 대조군에서 신세동맥의 비후가 관찰 되었으나 BG 투여군에서는 비후 정도가 완화된 것을 볼 수 있었고(Fig. 8), 부신은 대조군에서 토리층 피막의 모세혈관 확장된 모세혈관을 관찰되었고 전해질 코르티코이드를 분비하는 세포들의 수가 정상과 비교하여 상대적으로 적게 관찰되었으나 BG 투여군에서는 정상군과 유사하게 모세혈관의 확장이 관찰되지 않았다(Fig. 8).
- 신장은 사구체, 근위세뇨관, 원위세뇨관의 조직학적 배열 상태는 모두 정상이고, 정상군에서는 신세동맥(renal arteriole) 벽의 비후가 보이지 않으나 대조군에서는 비후에 의한 혈관 협착이 많이 일어나 있으며, BG 투여군에서는 정상군에 가깝게 협착이 완화된 것으로 나타났다 (Fig. 8).
- 심장은 좌심실의 가로로 배열된 심근 세포들을 중심으로 관찰한 결과 대조군에서 윤반을 단위로 세포질에 강한 호산성 염색 소견인 eosinophilic band (E.P)가 특징 적으로 나타났다. 반면 BG 투여군에서는 세포질이 호산성으로 염색되는 심근세포의 수가 현저하게 줄어들었다 (Fig.
- 심장은 좌심실의 가로로 배열된 심근 세포들을 중심으로 관찰한 결과 대조군에서 윤반을 단위로 세포질에 강한 호산성 염색 소견인 eosinophilic band (E.P)가 특징 적으로 나타났다. 반면 BG 투여군에서는 세포질이 호산성으로 염색되는 심근세포의 수가 현저하게 줄어들었다 (Fig.
- 정상군의 심장 무게는 2.6±0.06/body weight mg/g, 대조군은 3.5±0.22/BW mg/g로 나타나 유의성 있게(** : p< 0.01) 폐무게가 증가되었고, BG 투여군은 2.64±0.25/ BW mg/g로 대조군에 비해 유의성 있게 증가되었다(+ : p <0.05)(Fig. 2).
- 정상군의 폐 무게는 3.7±0.2/Body Weight mg/g, 대조 군은 8.7±1.8/BW mg/g로 나타나 유의성 있게(*** : p <0.001) 폐무게가 증가되었고, BG 투여군은 4.2±0.65/BW0 mg/g로 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다(++ : p < 0.01).
후속연구
- 서양의학에서 고혈압 치료는 다양한 작용기전에 의해발병 정도, 시기, 경과 등에 따른 투여 약물의 종류와 투여량을 조절해야 하는 등 치료 과정의 어려움과 이에 따른 부작용이 많은 실정이다. 따라서 지속적인 강압효과의 유지와 부작용이 없는 치료 약물의 개발이 요구되고 있고13,14), 멀티플한 효능을 가지고 있으면서 부작용이 적은 천연물을 이용한 치료제 개발이 기존 치료의 보완적인 면과 신규 치료제 개발 면에서 의미 있는 연구가 될 수 있을 것이다.
- 이상의 결과로 보아 고혈압의 주요 병리 기전에 본 시료가 유의성 있게 작용함을 실험적으로 입증함으로써 EBM 구축과 더불어 기초적 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 혈관염 등의 다양한 질환에도 응용될 수 있을 것으로 판단되며, 향후 개별 약물 혹은 약물간의 상호작용에 관한 검색이 보완되어야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 현재 임상에서 활용되는 BG의 항고혈압 작용이 실험적으로 검증되어, 향후 임상에서의 지속적인 활용과 더불어 보다 유의성 있는 항고 혈압 처방 개발에 객관적 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 보아 고혈압의 주요 병리 기전에 본 시료가 유의성 있게 작용함을 실험적으로 입증함으로써 EBM 구축과 더불어 기초적 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 혈관염 등의 다양한 질환에도 응용될 수 있을 것으로 판단되며, 향후 개별 약물 혹은 약물간의 상호작용에 관한 검색이 보완되어야 할 것으로 사료된다.
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