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문제 정의
- 본 연구에서는 韓藥의 효능을 더욱 증진시키고자 炮製法 중 蒸製法과 현대 발효공학의 고체 발효법과 혼합 발효법을 결합한 九蒸九炮 발효법을 개발하였는데, 고체 발효는 일반 배지 대신 약재만을 그대로 발효키는 것으로 배지가 혼합되지 않은 고유한 발효된 한약만을 얻을 수 있는 장점이 있다. 또한 효모와 유산균을 혼합 발효 시泥醉가 낮아지며 항균력이 증가하여 보존성이 높아지고, 다당류의 저분자화로 단당류 및 각종 아미노산들이 다량으로 나와 豐味 및 관능이 현저히 개선되는 등의 각종이점이 있어 이들을 결합한 새로운 발효법을 개발하였다22).
- 본 연구에서는 피부노화를 예방 혹은 치유할 수 있는 새로운 醱酵 韓方化粧品 원료를 발굴하고자, 炮製法 중가장 대표적인 九蒸九炮 및 현대 발효공학 기술 중 고체발효법과 혼합 발효법을 응용하여 人蔘․生地黃․何首烏 및 黃精을 酵母와 乳酸菌을 번갈아 찌고 고체 발효한 새로운 발효법을 개발하였고 이에 따른 九蒸九炮 발효를 통해 얻은 발효물에 대한 항산화, 세포활성, 콜라겐 생합성 효과및 세포 독성 등 피부 효능 및 안전성을 살펴 본 결과 우수한 결과를 확인할 수 있었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Saccharomyces cerevisiae KTCT1904, Lactobacillus brevis KTCT3102 를 20% glycerol에 혼합하여 -72℃에보관한다. Saccharomyces cerevisiae KTCT1904 1 mL stock을 YM agar 배지에서 도말평판법(Streak plate method)을 통해 계대배양한 후 약 0.1 mg 정도를 취하여 400 mL YM배지에 접종하여 30℃, 250 rpm 조건에서 48시간 배양하였다. 그리고 Lactobacillus brevis KTCT3102 1 mL stock을 MRS agar 배지에서 도말평판법을 통해 계대배양한 후 약 0.
- 人蔘․生地黃․何首烏 및 黃精을 1 mm 정도로 얇게 절편한 후 각각 10 g씩 유리 petri dish에 놓았다. 그 후 Autoclave를 이용한 고온 멸균법으로 약재 속에 들어있는 상재 균을 제거한 후, Saccharomyces cerevisiae 배양액을 약재에 10 mL 정도 넣고 30℃, 75 RH%에서 48시간 동안 발효하였다.
- 人蔘․生地黃․何首烏 및 黃精을 1 mm 정도로 얇게 절편한 후 각각 10 g씩 유리 petri dish에 놓았다. 그 후 Autoclave를 이용한 고온 멸균법으로 약재 속에 들어있는 상재 균을 제거한 후, Saccharomyces cerevisiae 배양액을 약재에 10 mL 정도 넣고 30℃, 75 RH%에서 48시간 동안 발효하였다. 그 후 발효액을 전부 15 mL Falcon Tube에 덜고 이를 0.
- 이후 type Ⅰ collagenase 용액을 제거한 뒤, 표피를 제거한 후 진피를 수술용 칼로 잘게 조각낸 후 DMEM 배지를 넣고, 75 cm2 티슈 플라스크에 정치하였다. 그리고 조각난 티슈에서 세포간 피부조직 밖으로 배출되어 플라스크 안에서 자라면 이를 회수하여 실험에 사용하였다. 섬유아세포는 DMEM에 10% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin을 가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다14).
- 22 um Filter (Millipore, USA)를 이용해 Filtration하여 발효물을 얻었다. 발효된 약재들을 Autoclave를 이용해 고온 멸균하고 Lactobacillus brevis 배양액을 약재에 10 mL를 넣고 30℃, 75 RH%에서 24시간 동안 발효하였다. 그 후 발효액을 전부 15 mL Falcon Tube에 덜고 이를 0.
- 24시간 후 세포들을 serum-free DMEM으로 3회 세척하고 각 시료들을 농도별로 녹인 serum-free DMEM용액으로 교환하고 24시간 배양한다. 배양액으로부터 새로 생성된 Procollagen type Ⅰ C-peptide를 PICP EIA Kit를 이용하여 분광광도계를 이용해 450 nm 에서의 흡광도를 측정하였다17).
- 1 mM 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) 용액을 100 ul씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치한 후 ELISA reader를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험의 양성대조군으로 L-ascorbic acid를 처리하였다. 자유라디칼 소거능은 다음 공식으로 계산하였다.
- 본 연구에서는 人蔘․生地黃․何首烏 및 黃精을 배합하여 酵母의 일종인 Saccharomyces cerevisiae 및 乳酸菌의 일종인 Lactobacillus brevis를 발효 균주로 삼아 차례대로 9번 번갈아 찌고 고체 발효하는 과정을 통해 醱酵物을 얻었다. 수득한 醱酵物의 피부 노화에 대한 효능/효과를 규명하기 위해, 발효 전 韓藥 混合추출물 및 Ascorbic acid 등과 비교하여 九蒸九炮 醱酵 韓藥 混合物의 자유라디칼 소거능 평가, 세포활성 및 독성 평가, 콜라겐 생합성 촉진효과 등을 측정하였다.
- 섬유아세포를 96 well plate에 well당 1 × 104개로 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0 및 10.0 ug/mL 농도로 각 시료들을 처리하여 48시간 동안 배양하였다.
- 본 연구에서는 人蔘․生地黃․何首烏 및 黃精을 배합하여 酵母의 일종인 Saccharomyces cerevisiae 및 乳酸菌의 일종인 Lactobacillus brevis를 발효 균주로 삼아 차례대로 9번 번갈아 찌고 고체 발효하는 과정을 통해 醱酵物을 얻었다. 수득한 醱酵物의 피부 노화에 대한 효능/효과를 규명하기 위해, 발효 전 韓藥 混合추출물 및 Ascorbic acid 등과 비교하여 九蒸九炮 醱酵 韓藥 混合物의 자유라디칼 소거능 평가, 세포활성 및 독성 평가, 콜라겐 생합성 촉진효과 등을 측정하였다.
- 2 um Filter를 이용해 Filtration하여 발효물을 얻었다. 이런 방식으로 약재를 Autoclave를 이용해 찌고 균주를 번갈아 가면서 고체 발효하는 과정을총 9번에 걸쳐 실시하여 각 약재의 발효물을 얻은 후 동량으로 섞어 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin과 penicillin 등은 GibcoBRL (USA)사 제품을 사용하였으며, 1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl (DPPH), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrzoliumbromide (MTT), trichloro acetic acid (TCA), potassium phosphate, sodium chloride and sodium phosphate 등은 Sigma Co (USA) 제품을 사용하였다.
- Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin과 penicillin 등은 GibcoBRL (USA)사 제품을 사용하였으며, 1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl (DPPH), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrzoliumbromide (MTT), trichloro acetic acid (TCA), potassium phosphate, sodium chloride and sodium phosphate 등은 Sigma Co (USA) 제품을 사용하였다. 그리고 DifcoTM Lactobacillus MRS Broth, DifcoTM YM Broth 및 DifcoTM BD Agar 등은 BD (USA)사 제품을 사용하였다. 기타 일반 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 人蔘(6년근, 충남 금산), 生地黃(충남 금산), 何首烏(경북 의성) 및 黃精(충남 금산) 등의 生藥材는 (주) 오비엠랩을 통하여 구입하였으며, 이를 세척하여사용하였으며 실험에 사용된 균주인 Saccharomyces cerevisiae (KTCT1904)와 Lactobacillus brevis (KTCT3102)는 한국생명공학연구원에서 입수하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 섬유아세포는 피부과의원에서 시술 후 얻어지는 포피를 이용하여 배양하였다. 얻어진 피부에서 지방층을 제거한 후 2～4 mm × 2～4 mm 크기의 절편으로 조각 낸 뒤, type Ⅰ collagenase (0.
- 실험에 사용된 시약으로 Procollagen Type Ⅰ C-Peptide (PICP) EIA Kit는 TAKARA (Japan)사의 제품을 사용하였다. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin과 penicillin 등은 GibcoBRL (USA)사 제품을 사용하였으며, 1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl (DPPH), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrzoliumbromide (MTT), trichloro acetic acid (TCA), potassium phosphate, sodium chloride and sodium phosphate 등은 Sigma Co (USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 실험은 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean ± S.D.로 나타내었으며, t-test를 시행하여 p<0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 자유라디칼 소거능 평가 법은 Blois의 방법에 준하여 실시하였다15). 각 시료를 96 well plate의 각 well에 100 ul씩 넣은 후 0.
성능/효과
- 0 w/v%에서 섬유아세포의 증식능을 평가한 결과 발효 횟수가 거듭될수록 높아졌으나, 3차 이후에는 경향성이 없었다. 5차 발효 시 34.5%, 7차 발효 시 33.8%의 섬유아세포 증식 효과를 보였으며 9차 발효 시 36.3%의 유의성 있는 섬유아세포 증식 효과를 보였을 뿐만 아니라 1% FBS보다 높은 섬유아세포 증식 효과를 보였다.
- 1과 같다. 九蒸九炮 醱酵 韓藥 混合物을 0.25 w/v%에서 자유라디칼 소거능을 평가한 결과 4차 발효부터 서서히 증가되어 7차 발효 시 0.26, 9차 발효 시 0.08 등의 효과를 보였다. 이는 L-ascorbic acid와 유사한 자유라디칼 소거능을 보인 것으로, 발효 횟수가 증가할수록 자유라디칼 소거 효과도 점점 높은 경향을 나타내었다.
- 3과 같다. 발효하지 않은 혼합 추출물의 경우 0.01 및 0.1 w/v%의 농도에서 대조군보다 6.9～11.3% 정도의 콜라겐 생합성 촉진 효과를 보였고, 九蒸九炮 醱酵 韓藥 混合物의 경우 0.01 및 0.1 w/v%의 농도에서 대조군보다 14.3～16.3% 정도의 대조군보다 높은 유의성 있는 콜라겐 생합성 촉진 효과를 보였으며 혼합 추출물에 비해서도 높은 효과를 보였다.
- 본 연구결과에 따르면, 九蒸九炮 醱酵 韓藥 混合物의 경우 발효 횟수가 증가할수록 자유라디칼 소거능이 높아졌으며 특히 9차에는 기존의 Ascorbic acid와 유사한 효과가 있음을 증명함에 따라 노화방지에 우수한 물질임을 확인할 수 있었으며 세포독성도 적음을 확인하였다.
- 이상의 연구 결과를 종합해볼 때, 酵母와 乳酸菌을 이용해 9번 번갈아 고체 배양한 九蒸九炮 醱酵 韓藥 混合物은 추출물에 비해 피부에 대한 효능이 뛰어났으며, 기존 항산화제로 널리 쓰이던 Ascorbic acid와 비슷한 자유라디칼 소거능을 보였다. 또한 피부 안전성 또한 매우 우수하여 노화된 피부에 대한 효과를 더욱 극대화할 수 있는 醱酵 韓方化粧品 원료로서 매우 유용할 것으로 판단된다.
- 콜라겐 생합성을 증진시키는 효과는 韓藥 混合 추출물보다 九蒸九炮 醱酵 韓藥 混合物이 더욱 우수한 효능을 보임에 따라 내인성 노화가 진행되면서 얇아지고 변성된 피부를 다시 재생시킬 수 있는 우수한 醱酵 韓藥 處方임을 확인할 수 있었다.
- 또한 배양한 섬유아세포에서 세포 증식능은 초기에는 단계적으로 높아지는 경향이 그 후에는 증진되지는 않았다. 하지만 9차 발효 시 1% FBS에 비해 유의성 있게 높은 세포 증식 효과를 보임에 따라, 노화된 피부세포의 활성화를 가져와 노화방지에 우수한 효능을 줄 수 있는 물질임을 확인할 수 있었으며 세포 활성능이 완화하여 피부 세포가 癌화될 가능성도 매우 희박하므로 피부에 독성이 매우 적으면서 더욱 친화적인 물질이 될 가능성을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이상의 연구 결과를 종합해볼 때, 酵母와 乳酸菌을 이용해 9번 번갈아 고체 배양한 九蒸九炮 醱酵 韓藥 混合物은 추출물에 비해 피부에 대한 효능이 뛰어났으며, 기존 항산화제로 널리 쓰이던 Ascorbic acid와 비슷한 자유라디칼 소거능을 보였다. 또한 피부 안전성 또한 매우 우수하여 노화된 피부에 대한 효과를 더욱 극대화할 수 있는 醱酵 韓方化粧品 원료로서 매우 유용할 것으로 판단된다. 또한 향후 다른 韓方處方 및 적합한 발효미생물과의 조합을 통하여 더욱 우수한 효능을 갖는 원료를 개발할 수 있는 가능성을 열었다는 점에서 큰 의의를 가진다.
- 또한 피부 안전성 또한 매우 우수하여 노화된 피부에 대한 효과를 더욱 극대화할 수 있는 醱酵 韓方化粧品 원료로서 매우 유용할 것으로 판단된다. 또한 향후 다른 韓方處方 및 적합한 발효미생물과의 조합을 통하여 더욱 우수한 효능을 갖는 원료를 개발할 수 있는 가능성을 열었다는 점에서 큰 의의를 가진다.
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