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문제 정의
- 실제 한방임상에서는 뇌졸중 환자들이 기억력 감퇴 등의 치매 관련 임상증상을 함께 동반하기도 하여 瘀血을 순환시키는 丹蔘, 牛膝, 桂枝와 뇌신경을 보호하는 것으로 알려진 遠志, 石菖蒲 등을 첨가하여 처방하기도 사용하기도 한다. 따라서 본 연구에서는 허혈성 뇌졸중 시 염증반응 유발에 핵심이 되는 신경교세포의 활성을 제어할 수 있는 약물을 개발하기 위해서 加味補陽還五湯(mBHT) 물추출물로부터 다양한 분획물을 분리하고 신경교세포에 서의 염증반응 억제효과를 조사하였다.
- 본 연구에서는 加味補陽還五湯(mBHT)으로부터 염증 반응 억제 효과를 가진 생리활성분획물을 도출하기 위하여 신경교세포로부터 LPS에 의해 유도되는 NO와 iNOS 에 대한 억제효과를 조사하였다.
제안 방법
- 각 well에 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 50 ㎕씩 넣은 후 4시간 동안 배양하면서 환원반응을 유도하였으며, 1 ㎖의 DMSO 용액을 첨가하 여 보라색 formazan 결정을 완전히 용해시켰다. 각 well의 발색정도를 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성은 세포만 배양한 무처리구의 생존도 100%를 기준으로 약물처리군의 상대적인 세포생존도를 계산하였다.
- 1% NED/1% sulfanilamide in 5% H3PO4)을 넣은 후 15분간 암반응 하였다. 발색정도를 microplate reader의 540 nm 흡광도에 서 측정하였으며, 세포배양액 내 NO의 농도는 NaNO2 표준액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
- 본 실험에 사용한 加味補陽還五湯(mBHT)은 Table 1 의 처방 비율로 구성된 각 약재를 정량하여 총 50 kg을 세말한 다음, GMP 시설업체의 추출기에 투입하고 물 1,000 L를 용매로 하여 98℃에서 3시간 동안 추출하였으며 3 batch의 연조엑스를 수득하였다. 이를 다시 700 mmHg, 55℃에서 15시간 감압 건조하여 건조엑스를 수득하였으며, 이때 수득률은 34.
- 본 연구에서는 뇌졸중 환자들이 기억력 감퇴 등 치매와 관련한 임상적 증상이 나타나는 것에 착안하여 補陽 還五湯 處方에 瘀血을 순환시키는 丹蔘, 牛膝, 桂枝와 腦 神經을 보호하는 遠志, 石菖蒲 등을 추가하여 加味補陽還 五湯(modified BHT, mBHT)을 만들었으며, 加味補陽還五湯으로부터 다양한 분획물(methylene chloride, ethylacetate, n-butanol외 water)을 분리하여 신경교세포에서의 염증 매개물질 분비에 대한 억제효과를 조사하였다.
- 분리된 각 단백질의 농도를 protein assay solution으로 정량한 다음, 30 ㎍ 단백질을 2 × sample buffer (100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM dithithreitol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol)와 섞어 10-15% SDSPAGE를 통해 분리하였다.
- BV2 세포로부터 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포 배양액 중 존재하는 NO2 - 의 형태를 Griess reagent 반응 법으로 측정하였다. 즉 BV2 세포에 독성이 없는 농도범 위의 mBHT 분획물을 30분간 전처리한 다음, LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세포배양액을 수거하여 배 양액 100 ㎕에 동일한 양의 Griess 시약(0.
- 활성화된 신경교세포로부터 분비되는 염증물질인 NO 에 대한 mBHT 분획물의 억제효과를 조사하기 위해서 세포배양액으로부터 Griess assay 방법으로 NO의 양을 측정하였다(Fig. 3). 먼저 세포만 배양하였을 때 세포배양 액 내 NO의 농도는 5.
대상 데이터
- 마우스의 뇌 신경교세포주인 BV2 cell은 고려대학교 의과대학 뇌신경과학교실로부터 분양받았으며, 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle’s Medium(DMEM)을 배양액으로 하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 加味補陽還五湯 처방(Table 1)의 구성 한약재는 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입한 후 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다.
- 실험에 사용된 시약은 n-hexane, methylene chloride, ethylacetate, n-BuOH (Merck Co., Germany), lipopolysaccharide (LPS; E. coli B0111:B4; Sigma, St. Louis, MO, USA), MTT(Sigma), Protein assay solution(BioRad Labolatories Inc., Hercules, CA, USA), 30% Acrylamide solution (BioRad Labolatories Inc), NP-40 Cell Lysis Reagent (Invitrogen, CA, USA), N-trityl-1,3-propanediamine acetate (Sigma), Sulfanilamide(Sigma), anti-iNOS antibody(SantaCruz Co Ltd, Santa Cruz, CA, USA) 등이다.
데이터처리
- 결과는 3회 반복실험에 대한 평균(mean)±표준편차(SD)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 Graph Pad Prism program 의 1-way ANOVA test를 수행하여 p값이 0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- BV2 세포로부터 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포 배양액 중 존재하는 NO2 - 의 형태를 Griess reagent 반응 법으로 측정하였다. 즉 BV2 세포에 독성이 없는 농도범 위의 mBHT 분획물을 30분간 전처리한 다음, LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 배양하였다.
- BV2 세포에서 발현되는 염증효소인 iNOS 단백질에 대한 효과를 조사하기 위해 Western blot을 수행하였다. 먼저, BV2 세포에 독성이 없는 농도범위의 mBHT 분획 물을 30분 동안 전처리한 다음, LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 18시간 동안 배양하였다.
- Cells were treated with different concentrations of the methylene chloride(mBHT-MC), ethylacetate fraction(mBHT-EtOAc), n-butanol fraction(mBHT-BuOH) and water fraction (mBHT-H2O) for 30 min, and then stimulated with or without LPS(1 ㎍/㎖) for 18h. The nitrite concentrations in medium were determined by Griess regent assay. Results of three independent experiments were averaged mean value of three independent experiments (SD=bars).
성능/효과
- 1. BV2 세포에서 mBHT의 ethyl acetate, butanol, H2O 분획물은 100 ㎍/㎖까지 독성이 없었으며, methyl chloride 분획물은 50 ㎍/㎖까지 독성이 없었다.
- 2. mBHT의 methyl chloride, ethyl acetate, butanol 분획물은 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 특히 methyl chloride 분획물은 10 ㎍/㎖ 농도에서 다른 분획물에 비해 NO의 생성을 현저히 감소시켰다.
- 3. mBHT의 methyl chloride 분획물은 다른 분획물에 비해 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도되는 iNOS의 단백질 발현을 현저히 감소시켰다.
- mBHT 분획물(1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖)의 BV2 세포에 대한 독성정도를 MTT assay 방법으로 조사한 결과(Fig. 2), mBHT-MC는 100 ㎍/㎖ 농도 (15.47±6.95%)에서 독성을 나타내었으며, mBHT-EtoAc, mBHT-BuOH, mBHT-H2O는 각각 100 ㎍/㎖ 농도에서 93.92±10.76%, 98.47±4.33%, 104.30±1.31%로 모두 독성이 나타나지 않았다.
- mBHT-MC는 1, 5, 10, 50 ㎍/㎖ 농도에서 각각 9.38±0.30 μM, 8.84±0.84 μM, 5.56±0.32 μM, 4.52±0.04 μ M로 측정되었으며, mBHT-EtoAc는 각각 8.37±1.10 μM, 7.67±0.30 μM, 7.57±1.90 μM, 5.45±1.62 μM로 측정되어 유의적이고 처리 농도에 의존적으로 NO 생성이 감소되었다.
- 결론적으로 본 연구에서는 mBHT의 여러 분획 중 LPS에 의해 활성화된 신경교세포로부터 생성되는 염증 매개물질인 NO와 iNOS를 가장 효과적으로 억제할 수 있는 분획물은 methyl chloride 분획물인 것으로 나타났으며, 이는 mBHT의 methyl chloride 분획물이 뇌졸중에서 신경교세포에 의한 염증반응을 조절할 수 있는 약물로 근거가 될 수 있는 것으로 보아진다.
- 따라서 mBHT 물추출물의 분획물 중 methyl chloride 분획물이 활성화된 뇌신경교세포로부터 분비되는 NO와 iNOS를 가장 효과적으로 억제시키는 것으로 나타났다.
- 따라서 mBHT 분획물 중 mBHT-MC가 다른 분획물에 비해 LPS에 의해 유도된 iNOS 단백질의 발현을 효과적으로 억제시켜 NO 생성을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다.
- . 따라서 mBHT의 분획물은 iNOS의 유전자 전사를 억제함으로써 단백질 합성을 차단하여 최종적으로 NO의 생성을 억제할 수 있는 것으로 보인다.
- 28 μM로 측정되어 유의적인 감소효과가 나타나지 않았다. 따라서 mBHT의 분획물을 동일한 농도로 비교하였을 때, 10 ㎍/㎖ 농도에서 mBHT-MC만 유의적으로 NO 생성을 감소시켰으며(Fig. 4A), 50 ㎍/㎖ 농도에서는 mBHT-H2O을 제외한 모든 분획물에서 유의적으로 NO의 농도를 감소시켜(Fig. 4B), mBHT의 분획물 중에서는 mBHT-MC가 활성화된 신경교세포로부터 생성되는 NO의 억제활성이 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 5). 또한 mBHT-BuOH의 경우, mBHT-MC와 mBHT-EtOAc 보다는 적었으나, 대조군에 비해서는 iNOS의 발현이 감소되었고, mBHT-H2O는 iNOS 발현을 억제시키지 않는 것으로 나타났다. 따라서 mBHT 분획물 중 mBHT-MC가 다른 분획물에 비해 LPS에 의해 유도된 iNOS 단백질의 발현을 효과적으로 억제시켜 NO 생성을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 mBHT 물추출물의 분획물(methylene chloride, ethylacetate, n-butanol, water)은 모두 독성이 없는 농도범위에서 LPS에 의해 활성화된 BV2 세포로부터 분비되는 NO의 농도를 유의적으로 감소시켰다. 특히 methyl chloride 분획물은 ethyl acetate, n-BuOH 분획물 에 비해 NO 생성을 가장 많이 억제시키는 것으로 나타났다.
- 특히 methyl chloride 분획물은 ethyl acetate, n-BuOH 분획물 에 비해 NO 생성을 가장 많이 억제시키는 것으로 나타났다.
- 활성화된 신경교세포로부터 발현되는 NO 합성효소인 iNOS에 대한 mBHT 분획물의 억제효과를 Western blot 방법으로 조사한 결과, 세포만 배양하였을 때는 iNOS 발 현이 거의 관찰되지 않았으며, LPS 처리에 의해 유의적 으로 증가하였고 mBHT-MC와 mBHT-EtOAc에 의해 현저히 감소되었다(Fig. 5). 또한 mBHT-BuOH의 경우, mBHT-MC와 mBHT-EtOAc 보다는 적었으나, 대조군에 비해서는 iNOS의 발현이 감소되었고, mBHT-H2O는 iNOS 발현을 억제시키지 않는 것으로 나타났다.
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