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문제 정의
- 이에 저자는 본 연구에서 蒲公英의 염증성 질환에 대한 효과를 실험적으로 확인하기 위해 蒲公英을 RAW 264.7 세포에 전처리한 후, LPS로 유도한 NO 생성과 세포생존율 및 TNF-α, IL-1β (interleukin-1β), IL-6, PGE2 (Prostaglandin E2)등의 염증매개물질 생성에 미치는 영향을 살펴보았다.
- 이에, 본 연구에서는 蒲公英 추출물 (THE)이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극으로 분비되는 염증매개물질 억제를 통해 항염증 효과를 평가함으로써, THE가 면역체계에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- /ml)을 분주하고 THE를 농도별로 처치한 다음, 1시간 후에 LPS를 처치하였다. LPS 처치후 6-12시간에 배지를 수거하여 cytokine을 측정하였다. 수거된 배지는 측정전까지 -70℃에서 보관하였다.
- LPS는 염증반응 매개물질인 PGE2의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, THE 0.03, 0.10 mg/ml 처리군은 LPS로 유도된 PGE2를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성(P<0.01) 있게 감소시켰다(Fig. 6).
- LPS는 전염증성 cytokine인 IL-1β의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, THE 0.01, 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS로 유도된 IL-1β를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성(P<0.05 또는 P<0.01) 있게 감소시켰다(Fig. 4).
- LPS는 전염증성 cytokine인 IL-6의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, THE 0.03, 0.1 mg/ml 처리군은 LPS로 유도된 IL-6를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성(P<0.05 또는 P<0.01) 있게 감소시켰다 (Fig. 5).
- LPS는 전염증성 cytokine인 IL-6의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, THE 0.03, 0.1 mg/ml 처리군은 LPS로 유도된 IL-6를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성(P<0.05 또는 P<0.01) 있게 감소시켰다 (Fig. 5).
- LPS는 전염증성 cytokine인 TNF-α의 생성을 유의성 있게 증가시켰고, THE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS로 유도된 TNF-α를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성(P<0.05 또는 P<0.01) 있게 감소시켰다(Fig. 3)
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 THE의 IL-1β 생성 저해능을 관찰하기 위하여 THE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 IL-1β 생성 정도를 측정하였다.
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 THE의 IL-6 생성 저해능을 관찰하기 위하여 THE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 IL-6 생성 정도를 측정하였다.
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 THE의 PGE2 생성 저해능을 관찰하기 위하여 THE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 PGE2 생성 정도를 측정하였다.
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 THE의 TNF-α 생성 저해능을 관찰하기 위하여 THE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 TNF-α 생성 정도를 측정하였다.
- LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 THE의 TNF-α 생성 저해능을 관찰하기 위하여 THE를 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 세포에 처리하고 18시간 후 ELISA kit를 사용하여 TNF-α 생성 정도를 측정하였다.
- Raw 264.7 cell에서 THE의 NO 생성억제정도를 관찰하기 위하여 THE를 0.01 - 0.1 mg/ml의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO의 양을 측정하였다. LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량이 유의성(P<0.
- THE 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도에서 LPS 로 유도된 NO 생성의 감소가 THE의 세포독성으로 인한 것인지를 관찰하기 위하여 THE 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 처리하고 24시간 후 MTT assay를 실시하여 세포생존율을 측정하였다. LPS 단독 처리군과 THE 0.
- THE 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도에서 LPS 로 유도된 NO 생성의 감소가 THE의 세포독성으로 인한 것인지를 관찰하기 위하여 THE 0.01, 0.03, 0.10 mg/ml의 농도로 처리하고 24시간 후 MTT assay를 실시하여 세포생존율을 측정하였다. LPS 단독 처리군과 THE 0.
- THE를 농도별로 처치하고, 1시간 후에 LPS를 처치한 후, 배양된 배지를 E-tube에 모아서 ELISA Kit (RnD Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용한 PGE2 측정에 사용하였다. PGE2와 link된 acetylcholinesterase가 도포되어 있는 plate에 standard와 배양 배지를 첨가하여 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다.
- THE의 NO 생성억제정도를 관찰하기 위하여 THE를 0.01, 003, 0.1 ㎎/㎖의 농도로 Raw 264.7 cell에 처리하여 생성되는 NO의 양을 측정하였다.
- 蒲公英 추출물이 LPS로 유도된 Raw 264.7 cell에서의 nitric oxide의 생성과, 세포생존률, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2에 미치는 영향을 조사하고 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 배양후 생존세포에 MTT(0.5 mg/ml)를 4시간 처치한 후 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 DMSO에 녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% αnaphthylamide in H2O) 100 ㎕를 혼합하여 96well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- LPS (Escherichia coli 026:B6; Difco, Detroit, MI, U.S.A.) 와 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoleum (MTT)은 Sigma (St. Lois, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS) 과 antibiotics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였으며, Antibody는 BD Bioscience (USA), Cayman (USA), Zymed (USA)에서 구입하였고, NC paper는 Schleicher & Schuell (USA)에서 구입하였다.
- Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells은 한국세포주연구재단 (서울)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- TNF-α, IL-1β와 IL-6의 ELISA Kit는 Pierce endogen (Rockford, IL, USA)에서 구입하였으며, PGE2의 ELISA Kit는 RnD Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- 7 cells은 한국세포주연구재단 (서울)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 실험과정의 모든 cells은 80～90%의 confluency에서 실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 cell만 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±SD로 나타내었으며, 처치군 간의 유의성은 one way analysis of varience(ANOVA)로 검정한 후 Newman - Keuls test로 검정하였다.
이론/모형
- TNF-α, IL-1β와 IL-6는 ELISA Kit (Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였으며, 실험의 방법은 manufacturer's instruction에 따랐다.
성능/효과
- 1. NO의 생성량을 THE 0.03, 0.1 mg/ml에서 유의성 있게 억제하였으며, 모든 농도의 THE에서 세포독성을 유발하지 않았다.
- 3. IL-1β를 모든 농도의 THE mg/ml 에서 유의성 있게 억제하였다.
- 5. PGE2를 THE 0.03, 0.1 mg/ml에서 유의성 있게 억제하였다.
- LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량이 유의성(P<0.01) 있게 증가하였으며, THE 0.01 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS군에 비해 유의성이 없었으나, THE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS군에 비해 유의성(P<0.01) 있게 NO의 생성을 억제하였다(Fig. 1).
- LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량이 유의성(P<0.01) 있게 증가하였으며, THE 0.01 mg/ml를 처치한 실험군에서는 LPS군에 비해 유의성이 없었으나, THE 0.03, 0.1 mg/ml를 처치한 실험군에서는 LPS군에 비해 유의성(P<0.01) 있게 NO의 생성을 억제하였다(Fig. 1).
- LPS는 전염증성 cytokine인 TNF-α의 생성을 유의성 있게 증가시켰고, THE 0.03, 0.1 ㎎/㎖를 처치한 실험군에서는 LPS로 유도된 TNF-α를 LPS단독 처리군에 비해 각각 유의성(P<0.05 또는 P<0.01) 있게 감소시켰다(Fig. 3).
- 이러한 결과는 蒲公英 추출물이 Nitric Oxide 및 pro-inflammatory cytokine의 생성과, gram-negative bacterial infection에 의한 염증과 연관된 면역질환의 치료에 효과가 있음을 알 수 있다.
후속연구
- 이상의 결과는 THE가 NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2 의 생성을 저해함으로써 유의한 항염증 효과가 있음을 보여주며, 향후 기전적 연구를 통해 THE를 활용한 염증반응 조절제 개발과 임상에서의 활용가치를 높일수 있을 것으로 생각된다.
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