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문제 정의
- 이 논문은 2010년도 BK21사업의 한의과학사업단의 지원으로 수행된 연구결과이므로 이에 감사드린다.
제안 방법
- Column은 LUNA 5μ C18(2) (Phenomenex, 250×4.60㎜, USA) column을 사용하였으며, 이동상으로 solvent A는 water (2% acetic acid), solvent B는 50% acetonitrile(0.5% acetic acid)를 사용하여, solvent B의 비율을 10%(0 min.)→18%(20 min.)→24%(30 min.)→30%(45 min.)→30%(65 min.)→55%(70 min.)의 조건으로, 이동상의 속도는 0.4㎖/min, UV detector는 280nm 파장에서 측정하였다.
- LPS로 자극된 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO 의 양은 Nitrate/Nitrite colorimetric assay kit를 이용하여 세포질에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였다. 시료를 200 ㎍/㎖의 농도로 18시간 처리하였다.
- NO의 생성량을 측정함으로써 iNOS의 활성을 측정하였다. RAW 264.
- 7 세포를 96 well plate에 5×104 cells/㎖로 접종하고 24시간 배양 후, 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각 well 에 MTS와 PMS를 20:1의 비율로 잘 혼합하여 처리하고 3시간 배양한 후, ELISA reader를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포생존율(% of control)을 계산하였다.
- 건조된 5종의 민들레의 지상부와 뿌리 50g을 각각 100% methanol을 용매로 하여 환류추출기에서 3시간, 3회씩 반복전탕하였으며, 각각의 추출물은 여과지(Whatman filter parer No.2)로 여과한 후 감압 농축하여 시료로 사용하였다. 시료 중 지상부의 수득률은 약 28.
- 그러므로 국내 자생하는 5종 민들레의 지상부와 뿌리에 대하여 민들레 기지 성분 중 gallic acid, methyl gallate, esculetin, syringic acid의 함량을 비교 분석하였으며, 각각의 항염증 효과를 비교하기 위하여 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에서 COX-2, iNOS 단백질 발현량과 PGE2와 NO의 함량을 측정하여 유의한 결과를 얻었다.
- 그러나, 아직 국내 자생하는 다양한 민들레의 성분 및 항염증 효과는 비교되어 있지 않다. 그러므로, 국내에서 자생하는 5종 민들레의 지상부 및 뿌리의 성분 및 항염 활성을 비교분석하였다.
- 2A). 또한 민들레류의 지상부와 뿌리 추출물(200 ㎍/㎖)에 의한 COX-2의 활성을 조사 하기 위해 세포내 PGE2의 양을 정량하였다. LPS로 유도되는 PGE2의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 대조군에 비하여 뿌리보다 지상부의 PGE2생성이 전반적으로 높게 억제되었다.
- 전초에서 gallic acid, methyl gallate, esculetin, syringic acid 등의 44가지의 성분을 분리하였고29), 지상부에서 taraxasterol, taraxerol30), 꽃에서 arnidiol, lutein, flavoxanthine 등의 성분이 분리되었으며, 잎에는 lutein, violaxanthin, plastoquinone 등이 함유되어 있으며, 특히 guainolide sesquiterpene인 desacetylmatricarin (austricin)은 항알러지 작용이 있는 것으로 알려져 있다31). 본 연구에서는 T. mongolicum의 전초의 성분에 대한 연구보고29)를 참고하여 함유된 성분인 gallic acid, methyl gallate, esculetin 및 syringic acid의 함량을 분하였다. 그중 gallic acid와 methyl gallate는 구강상피세포에서의 염증성 사이토카인에 대한 효과가 있으며32), esculetin은 TNF에 유도된 3T3-L1 adipocytes에 대한 iNOS 발현의 억제 효과가 있고33), syringic acid는 암세포종인 인체 구강유상피암종 세포에 대하여 독성이 있으며 항암작용이 있다고 보고되어 있다.
- 시료의 COX-2 활성을 조사하기 위해 세포내 prostaglandin E₂(PGE2)의 양을 정량하였다. 실험은 nitrite assay와 동일한 방법으로 세포질 용액을 취하여 유리된 PGE2의 양을 Prostaglandin E₂Enzymeimmunoassay Biotrak System의 지시에 따라 정량하였다.
- )의 양을 정량하였다. 실험은 nitrite assay와 동일한 방법으로 세포질 용액을 취하여 유리된 PGE2의 양을 Prostaglandin E₂Enzymeimmunoassay Biotrak System의 지시에 따라 정량하였다.
- 우리나라에서 자생하는 민들레 5종의 지상부와 뿌리의 methanol추출물의 항염증 효과와 성분 비교 연구를 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 표준 물질인 gallic acid, methyl gallate, esculetin 와 syringic acid (Fig. 4) 의 각각의 검량선을 작성하였다. (Fig.
대상 데이터
- 민들레에 함유된 것으로 보고된29) methyl gallate (분리품, 99.0%), gallic acid (분리품, 99.0%), esculetin (분리품, 99.0%), syringic acid (분리품, 99.0%)을 표준물질로 사용하였으며, 표준물질 1.0㎎을 각각 정밀하게 달아 HPLC 용 methanol 10㎖을 넣어 표준액으로 하였다.
- 본 실험에 사용된 시료 중 서양민들레 T. officinale 는 경기도 안성시 보개면 야산에서 2009년 5월 채취하였고, 좀민들레 T. hallaisanense는 제주도 민속오일장에서 2009년 5월에 구입하였고, 산민들레 T. ohwianum는 강원도 양구군 양구읍에서 2009년 5월에 채취하였고, 흰민들레 T. coreanum는 강원도 정선에서 재배되는 것으로 2009년 5월에 채취하였고, 민들레 T. platycarpum는 강화도 화두면에서 2009년 5월에 채취하였다. 채취한 식물은 뿌리와 지상부로 구분한 후 음건하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에서는 murine macrophage RAW 264.7 세포를 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였으며, 세포 성장을 위한 기본 배지로는 10% fetal bovine serum과 streptomycin sulfate (100μg/㎖), penicillin G (100 units/㎖), 10mM sodium bicarbonate를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium을 사용하여 humidified CO2 incubator (5% CO2, 95% air)에서 37℃의 조건으로 배양하였다.
- 실험에 사용된 시약은 DMEM medium (Gibco BRL Co., USA), Fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL Co., USA), Penicillin (Gibco BRL Co., USA), Streptomycin (Gibco BRL Co., USA), CellTiter 96Ⓡ(Promega Co., USA), Nitrate/Nitrite Colorimetric assay kit (Cayman Chemical Co., USA), Lipopolysaccharide (Sigma Co., USA), Pro-prep protein extraction solution (Intron Biotechnology Co., Korea), COX-2 monoclonal antibody (BD Bioscience Pharmingen Co., Korea), iNOS monoclonal antibody (BD Bioscience Pharmingen Co., Korea), Anti-mouse antibody (Cell Signalling Co., USA), Prostagladin E₂Enzymeimmunoassay Biotrak System (BD Bioscience Pharmingen Co., USA), BCIP-NBT (Nakalai Tesque, Japan)이며, 사용된 기기는 ELISA reader : Versamax (Molecular Devices Co., USA), UV/VIS Spectrophotometer (Gilson Co., USA), HPLC : GILSON 254 Autoinjector (USA), GILSON 321 pump (USA), GILSON UV/VIS-155 (USA) 등이다.
- platycarpum는 강화도 화두면에서 2009년 5월에 채취하였다. 채취한 식물은 뿌리와 지상부로 구분한 후 음건하여 실험에 사용하였다. 시료의 일부는 경희대학교 한의과대학 본초학교실에 표본으로 보관하고 있다.
데이터처리
- 실험결과는 평균값 ± standard error (SE)로 나타냈으며 통계적 분석은 유의성 시험(Student t-test)을 사용하였다.
이론/모형
- LPS로 염증이 유발된 RAW 264.7 cell에서 시료에 의한 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 미치는 효과를 Western blotting을 통하여 확인하였다. 그 결과, iNOS와 COX-2 단백질 발현은 RAW264.
- RAW 264.7 세포로부터 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 양에 미치는 시료의 영향을 조사하기 위해 Western blotting 을 실시하였다. 시료를 처리한 세포를 채취하여 PBS로 2번 씻어낸 후, Pro-prep시약 100 ㎕를 가하여, -20℃에서 10분간 방치한 뒤, 4℃에서 12,000rpm으로 10분 원심 분리하여 상등액을 얻었다.
- NO의 생성량을 측정함으로써 iNOS의 활성을 측정하였다. RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Nitrate/Nitrite colorimetric assay kit를 이용하여 세포질에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였으며, 실험 방법은 Cayman Chemical Company의 지시에 따라 정량하였다.
성능/효과
- 1. RAW 264.7 세포에 대한 독성실험 결과, 시료 농도 50∼ 400 ㎍/㎖에서 모두 80%이상의 세포생존율을 나타내었다.
- 2. 蒲公英 추출물은 LPS로 유도되는 NO, PGE2 생성량을 감소시켰다. NO 생성은 모든 시료에서 크게 감소시켰으며, 특히 흰민들레 뿌리는 70%이상 크게 감소시켰다.
- 3. LPS에 의해 유도된 iNOS 발현은 지상부에서 좀민들레와 서양민들레가 크게 감소시켰고, 뿌리에서는 흰민들레와 좀민들레가 크게 감소시켰다. COX-2 발현은 지상부와 뿌리에서 모두 변화가 나타나지 않았다.
- 4. 민들레의 기지 성분 중 gallic acid, methyl gallate, esculetin, syringic acid에 대한 함량 분석 결과 산민들레의 지상부를 제외한 5종의 민들레에서 methyl gallate 와 esculetin를 정량할 수 있었다. Methyl gallate는 지상부에 11.
- 또한 민들레류의 지상부와 뿌리 추출물(200 ㎍/㎖)에 의한 COX-2의 활성을 조사 하기 위해 세포내 PGE2의 양을 정량하였다. LPS로 유도되는 PGE2의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 대조군에 비하여 뿌리보다 지상부의 PGE2생성이 전반적으로 높게 억제되었다. 산민들레의 지상부와 뿌리추출물은 PGE2생성량이 각 71.
- MTS assay를 이용하여 RAW 264.7 세포에 대한 독성실험 결과, 시료 농도 50∼400 ㎍/㎖에서 정상군에 비해 모두 80%이상의 세포생존율을 보였다.
- MTS assay를 이용하여 RAW 264.7 세포에 대한 시료의 독성 실험 결과, 실험한 모든 농도에서는 세포생존율에 큰 영향을 주지 않았다.
- 蒲公英 추출물은 LPS로 유도되는 NO, PGE2 생성량을 감소시켰다. NO 생성은 모든 시료에서 크게 감소시켰으며, 특히 흰민들레 뿌리는 70%이상 크게 감소시켰다. PGE2생성은 모든 시료에서 크게 감소되었다.
- NO 생성은 모든 시료에서 크게 감소시켰으며, 특히 흰민들레 뿌리는 70%이상 크게 감소시켰다. PGE2생성은 모든 시료에서 크게 감소되었다.
- 실험결과는 평균값 ± standard error (SE)로 나타냈으며 통계적 분석은 유의성 시험(Student t-test)을 사용하였다. 각 실험은 3회 이상 반복하였으며, p값이 0.05미만인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 시료를 200 ㎍/㎖의 농도로 18시간 처리하였다. 그 결과 대조군에 비하여 흰민들레의 뿌리추출물이 74.8%로 가장 많이 억제되었다. 흰민들레 지상부추출물은 22.
- 7 cell에서 시료에 의한 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 미치는 효과를 Western blotting을 통하여 확인하였다. 그 결과, iNOS와 COX-2 단백질 발현은 RAW264.7 세포만 배양한 정상군에서는 나타나지 않았으며, LPS 처리한 대조군에서 높게 나타났다. 민들레의 항염증활성을 알아보기 위해 각각의 시료를 200㎍/㎖ 농도로 처리한 결과 iNOS의 단백질 발현양은 전반적으로 대조 군에 비해 발현양이 줄었으며, 뿌리보다 지상부의 iNOS의 발현 억제율이 높았다.
- 민들레의 지상부에 gallic acid, methyl gallate, esculetin, syringic acid가 대부분 함유되어 있었지만, 산민들레에서 methyl gallate와 syringic acid, 흰민들레에서 gallic acid와 sryingic acid, 좀민들레에서 syringic acid는 검출되지 않았다. 흰민들레의 esculetin의 함량은 다른 민들레보다 2배정도 많이 함유되어 있고 전반적으로 methyl gallate가 높은 함유량을 나타냈다.
- 7 세포만 배양한 정상군에서는 나타나지 않았으며, LPS 처리한 대조군에서 높게 나타났다. 민들레의 항염증활성을 알아보기 위해 각각의 시료를 200㎍/㎖ 농도로 처리한 결과 iNOS의 단백질 발현양은 전반적으로 대조 군에 비해 발현양이 줄었으며, 뿌리보다 지상부의 iNOS의 발현 억제율이 높았다. 특히 좀민들레와 서양민들레의 지상부에서 iNOS 감소량이 많았다(Fig.
- 이 COX 활성에 따른 주요 산물이 바로 PGE2이며, 염증질환, 자가면역질환, 종양성 질환의 병리에서 중요한 역할을 하며, 특히 염증 반응의 중요한 물질로 매개된다24,25). 본 연구 결과에서 蒲公英 추출물은 LPS에 의해 RAW 264.7 세포로부터 생성된 PGE2의 생성량은 70%이상으로 억제율이 낮게 나타났으며, COX-2의 단백질 발현은 좀 민들레 뿌리추출물을 제외한 약재에서는 효과가 나타나지 않았다. 즉 蒲公英 추출물의 세포 안전성에 관해서는 실험한 모든 농도에서 안전성을 보여주었고, 蒲公英의 추출물에서 NO 와 PGE2는 감소시킴으로써 항염 효과가 있음이 입증되었으며, 이들의 합성효소인 iNOS의 발현은 감소되었으나 COX-2의 발현은 대부분 감소되지 않아 이에 대한 기전 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- LPS로 유도되는 PGE2의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 대조군에 비하여 뿌리보다 지상부의 PGE2생성이 전반적으로 높게 억제되었다. 산민들레의 지상부와 뿌리추출물은 PGE2생성량이 각 71.4%, 82.4%로 30%이하의 억제율이 나타나 효과가 매우 낮았다(Fig. 2B).
- NO는 iNOS에 의해서 발생되는데 iNOS는 외부 자극에 반응하여 생체를 방어하려는 목적으로 단시간에 다량의 NO를 생성하여 급만성 염증에 관여한다21). 연구 결과 蒲公英의 추출물은 LPS에 의해 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 생성량은 전반적으로 억제하였으나 iNOS의 단백질 발현은 산민들레와 흰민들레 지상부추출물에서 억제하는 경향을 보였다.
- 연구 결과 국내 자생하는 다양한 민들레의 지상부와 뿌리는 모두 유의한 항염증 효과를 기대할 수 있었으며, 종 및 부위에 따른 성분함량의 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 본 실험에서 나타난 민들레의 종 및 부위에 따른 항염활성 정도는 분석된 기지성분의 함량과 관련이 없었으므로, 향후 항염활성 및 활성성분 분리에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 8%로 가장 많이 억제되었다. 흰민들레 지상부추출물은 22.1%로 억제율이 낮았으며, 흰민들레 지상부추출물을 제외한 모든 추출물에서 40%이상의 nitrite 생성이 억제되었다(Fig. 2A). 또한 민들레류의 지상부와 뿌리 추출물(200 ㎍/㎖)에 의한 COX-2의 활성을 조사 하기 위해 세포내 PGE2의 양을 정량하였다.
- 민들레의 지상부에 gallic acid, methyl gallate, esculetin, syringic acid가 대부분 함유되어 있었지만, 산민들레에서 methyl gallate와 syringic acid, 흰민들레에서 gallic acid와 sryingic acid, 좀민들레에서 syringic acid는 검출되지 않았다. 흰민들레의 esculetin의 함량은 다른 민들레보다 2배정도 많이 함유되어 있고 전반적으로 methyl gallate가 높은 함유량을 나타냈다. 뿌리에는 전반적으로 methyl gallate와 esculetin이 공통적으로 함유되어 있었고, syringic acid는 함유되어 있지 않았다.
후속연구
- 항염활성이 있는 methyl gallate와 esculetin은 민들레류의 항염증 효과와 관련될 것으로 추정된다. 그러나, 본 실험에서 나타난 항염활성 정도는 methyl gallate와 esculetin의 함량과 비례 관계가 없었으며, 향후 민들레의 항염활성 및 활성성분 분리에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 연구 결과 국내 자생하는 다양한 민들레의 지상부와 뿌리는 모두 유의한 항염증 효과를 기대할 수 있었으며, 종 및 부위에 따른 성분함량의 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 본 실험에서 나타난 민들레의 종 및 부위에 따른 항염활성 정도는 분석된 기지성분의 함량과 관련이 없었으므로, 향후 항염활성 및 활성성분 분리에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 7 세포로부터 생성된 PGE2의 생성량은 70%이상으로 억제율이 낮게 나타났으며, COX-2의 단백질 발현은 좀 민들레 뿌리추출물을 제외한 약재에서는 효과가 나타나지 않았다. 즉 蒲公英 추출물의 세포 안전성에 관해서는 실험한 모든 농도에서 안전성을 보여주었고, 蒲公英의 추출물에서 NO 와 PGE2는 감소시킴으로써 항염 효과가 있음이 입증되었으며, 이들의 합성효소인 iNOS의 발현은 감소되었으나 COX-2의 발현은 대부분 감소되지 않아 이에 대한 기전 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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