SSR 마커를 이용한 한국산과 중국산 구기자의 품종 판별 Cultivar Discrimination of Korean and Chinese Boxthorn (Lycium chinense Mill. and Lycium barbarum L.) using SSR Markers원문보기
This study was undertaken to develop a technique of discrimination using SSR makers in boxthorn cultivars. Forty one boxthorn cultivars, which were collected from Korea and China, were evaluated by 10 SSR markers. Total of 61 alleles were detected, ranging from 3 to 13 with an average of 6.1 alleles...
This study was undertaken to develop a technique of discrimination using SSR makers in boxthorn cultivars. Forty one boxthorn cultivars, which were collected from Korea and China, were evaluated by 10 SSR markers. Total of 61 alleles were detected, ranging from 3 to 13 with an average of 6.1 alleles per locus. The averages of gene diversity and PIC values were 0.482 and 0.428, with a range from 0.25 (GB-LCM-022 and GB-LCM-087) to 0.83 (GB-LCM-167) and from 0.24 (GB-LCM-022 and GB-LCM-087) to 0.81 (GB-LCM-167), respectively. Five markers out of 10 markers, GB-LCM-022, GB-LCM-075, GB-LCM-104, GB-LCM-167 and GB-LCM-217, were selected as key markers for discrimination in boxthorn cultivars. All of boxthorn cultivars were individually distinguished by the combination of five SSR markers.
This study was undertaken to develop a technique of discrimination using SSR makers in boxthorn cultivars. Forty one boxthorn cultivars, which were collected from Korea and China, were evaluated by 10 SSR markers. Total of 61 alleles were detected, ranging from 3 to 13 with an average of 6.1 alleles per locus. The averages of gene diversity and PIC values were 0.482 and 0.428, with a range from 0.25 (GB-LCM-022 and GB-LCM-087) to 0.83 (GB-LCM-167) and from 0.24 (GB-LCM-022 and GB-LCM-087) to 0.81 (GB-LCM-167), respectively. Five markers out of 10 markers, GB-LCM-022, GB-LCM-075, GB-LCM-104, GB-LCM-167 and GB-LCM-217, were selected as key markers for discrimination in boxthorn cultivars. All of boxthorn cultivars were individually distinguished by the combination of five SSR markers.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구는 SSR 마커를 이용하여 국내산과 중국산 구기자 품종에 대한 유전자형을 분석하여 품종 판별에 대한 가능성을 검토하고 효율적인 품종 판별법을 제시하고자 수행하였다.
제안 방법
본 연구에 사용한 재료는 국립농업유전자원센터에 보유하고 있는 구기자 41점을 사용하였으며 한국산 25점과 중국산 16점이 포함되었다 (Table 1). DNA 추출은 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)을 사용하였으며, 추출한 구기자 DNA는 BioSpec-nano (Shimadzu, Japan)를 이용하여 구기자 DNA의 quality 및 quantity를 확인하였고 PCR 반응을 위해서 DNA 농도를 20 ng/㎕로 정량 후 사용하였다.
(2009)이 발표한 논문에서 polymorphic information content (PIC) 값이 높고 allele 수가 많은 10개 SSR 마커를 선발하여 분석에 사용하였다 (Table 2). PCR 반응을 위해서 Schuelke (2000) 방법을 변형하여 수행하였다. 주형 DNA 40 ng, M13-tailed forward primer 0.
SSR 마커를 이용하여 한국산 및 중국산 구기자에 대한 품종판별을 위하여 10개 마커 중 allele 수, gene diversity 및 PIC 값이 가장 높은 GB-LCM-167 마커를 이용하여 phylogenetic tree를 작성 후 1차 품종 판별 분석을 수행하였다. 구분이 되지 않은 자원에 대해서는 자원들이 자지고 있는 특정 allele를 포함하고 있는 마커 (GB-LCM-217, GB-LCM104, GB-LCM-075, GB-LCM-022)를 선발하여 각각의 단계별로 하나의 마커를 추가하여 phylogenetic tree를 작성하여 최종 5단계로 구기자 품종을 판별하였다.
SSR 마커를 이용하여 한국산 및 중국산 구기자의 판별을 위하여 10개의 마커 중 allele 수, 특이적 allele 수, gene diversity 및 PIC 값이 가장 높은 GB-LCM-167 마커를 이용하여 phylogenetic tree를 작성 후 분석을 하였다 (Fig. 1). 총 5단계로 분석을 수행하였으며 단계별로 GB-LCM-217, GBLCM-104, GB-LCM-075, GB-LCM-022 마커 순으로 추가하여 단계별 tree를 작성하여 분석하였다 (Fig.
25) 프로그램을 이용하였으며 expected heterozygosity는 POPGEN 프로그램을 사용하였다. 계통분류학적 분석은 PowerMarker에 포함되어 있는 CS Chord 1967 distance를 이용하여 각각의 품종에 대한 유전적 거리를 분석 후 UPGMA 방법을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하여 분석하였다.
SSR 마커를 이용하여 한국산 및 중국산 구기자에 대한 품종판별을 위하여 10개 마커 중 allele 수, gene diversity 및 PIC 값이 가장 높은 GB-LCM-167 마커를 이용하여 phylogenetic tree를 작성 후 1차 품종 판별 분석을 수행하였다. 구분이 되지 않은 자원에 대해서는 자원들이 자지고 있는 특정 allele를 포함하고 있는 마커 (GB-LCM-217, GB-LCM104, GB-LCM-075, GB-LCM-022)를 선발하여 각각의 단계별로 하나의 마커를 추가하여 phylogenetic tree를 작성하여 최종 5단계로 구기자 품종을 판별하였다.
유전자형을 분석하기 위하여 PCR 산물 1.2 ㎕, internal size standard 500 ROX (ABI, Foster city, CA) 0.3 ㎕, Hidi formamid (ABI, Foster City, CA) 9 ㎕을 첨가 후 ABI 3130xl Genetic Analyzer(ABI, Foster City, CA)를 이용하여 분석하였다. 자료 분석을 위하여 Genemapper 4.
1). 총 5단계로 분석을 수행하였으며 단계별로 GB-LCM-217, GBLCM-104, GB-LCM-075, GB-LCM-022 마커 순으로 추가하여 단계별 tree를 작성하여 분석하였다 (Fig. 1).
대상 데이터
Kwon et al. (2009)이 발표한 논문에서 polymorphic information content (PIC) 값이 높고 allele 수가 많은 10개 SSR 마커를 선발하여 분석에 사용하였다 (Table 2). PCR 반응을 위해서 Schuelke (2000) 방법을 변형하여 수행하였다.
본 연구에 사용한 재료는 국립농업유전자원센터에 보유하고 있는 구기자 41점을 사용하였으며 한국산 25점과 중국산 16점이 포함되었다 (Table 1). DNA 추출은 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)을 사용하였으며, 추출한 구기자 DNA는 BioSpec-nano (Shimadzu, Japan)를 이용하여 구기자 DNA의 quality 및 quantity를 확인하였고 PCR 반응을 위해서 DNA 농도를 20 ng/㎕로 정량 후 사용하였다.
주형 DNA 40 ng, M13-tailed forward primer 0.2 µM, reverse primer 0.6 µM, 형광 M13 primer 0.5 µM, dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 각각 200 µM, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM MgCl2, 0.25 unit Taq DNA polymerase를 사용하였다.
집단 내에 존재하는 특이적 allele는 본 연구에 사용된 10개의 모든 마커에서 관찰되었다. 한국과 중국집단 내에 존재하는 특이적 allele 수는 1개 (GB-LCM-025, GB-LCM-104, GB-LCM-119)에서 9개 (GB-LCM-167)로 다양하게 나타났다 (Table 4).
25 unit Taq DNA polymerase를 사용하였다. 형광물질로는 6-FAM, HEX, NED를 사용하였으며, PCR 반응은 PTC-200 thermocycler (MJ Research, USA)를 이용하였다.
데이터처리
마커에 대한 number of allele (NA), major allele frequency (MAF), gene diversity (GD) 및 polymorphic information content (PIC)에 대한 분석은 PowerMarker (ver 3.25) 프로그램을 이용하였으며 expected heterozygosity는 POPGEN 프로그램을 사용하였다. 계통분류학적 분석은 PowerMarker에 포함되어 있는 CS Chord 1967 distance를 이용하여 각각의 품종에 대한 유전적 거리를 분석 후 UPGMA 방법을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하여 분석하였다.
성능/효과
10개 SSR 마커를 이용하여 41점의 한국산 및 중국산 구기자에 대하여 유전적 다양성을 분석한 결과, 총 61개 allele가 관찰되었다. Allele 수는 3개 (GB-LCM-025, GB-LCM-119) 에서 13개 (GB-LCM-167)로 비교적 다양하게 나타났으며, 평균 allele 수는 6.
5단계 (GB-LCM-022)에서는 5점의 한국 자원이 판별되었다. 1단계에서 5단계까지 판별과정에서 41점의 구기자를 모두 판별할 수 있었으며, 본 연구에 사용한 구기자의 원산지에 따른 품종 판별은 4단계까지의 마커 조합 (GB-LCM-167, GB-LCM-217, GB-LCM-104, GB-LCM-075)으로도 판별이 가능하였다 (Fig. 1, Table 5, Table 6).
1). 2단계에 GBLCM-217 마커를 추가하여 분석한 결과 1단계에서 판별되지 않았던 29점 중에서 12점 (한국 6점, 중국 6점)이 되었다. GB-LCM-104 마커를 이용한 3단계에서는 4점 (한국 3점, 중국 1점), 4단계 (GB-LCM-075)에서는 8점 (한국 7점, 중국 1점)이 판별되었다.
10개 SSR 마커를 이용하여 41점의 한국산 및 중국산 구기자에 대하여 유전적 다양성을 분석한 결과, 총 61개 allele가 관찰되었다. Allele 수는 3개 (GB-LCM-025, GB-LCM-119) 에서 13개 (GB-LCM-167)로 비교적 다양하게 나타났으며, 평균 allele 수는 6.1개 였다. Allele의 변이는 GB-LCM-025에서 9 bp로 가장 좁았으며, GB-LCM-022가 124 bp로 가장 넓은 변이를 나타냈다.
3개였으며 GB-LCM-167 마커에서 가장 많은 6개의 allele가 관찰되었다. GB-LCM-087 마커의 경우 총 6개의 allele 중 5개 (83%)의 allele가 중국 자원에만 존재하는 특이적 allele이었으며, GB-LCM-025, GB-LCM-104, GB-LCM119 마커의 경우 1개의 특이적 allele가 중국자원에만 존재하였다 (Table 4). 집단 내에 존재하는 이러한 특이적 allele들은 향후 한국 및 중국 원산지에 따른 품종 구분에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
GB-LCM-167 마커를 이용하여 1단계 판별을 수행한 결과 총 41점의 구기자 자원 중 12점 (한국 4점, 중국 8점)이 판별되었다. 판별이 되지 않은 29점은 자원들이 가지고 있는 유전자형에 따라 6개 그룹을 형성하였다 (Fig.
Allele의 변이는 GB-LCM-025에서 9 bp로 가장 좁았으며, GB-LCM-022가 124 bp로 가장 넓은 변이를 나타냈다. MAF 범위는 GB-LCM-167에서 0.28로 가장 낮았으며, GB-LCM-087에서 0.87로 가장 높게 나타났으며, 평균은 0.630이었다. 분석에 사용한 마커에 대한 유전적 다양성을 나타내는 GD와 PIC는 GB-LCM-022와 GB-LCM087 마커에서 두 값 모두 가장 낮았으며 (0.
630이었다. 분석에 사용한 마커에 대한 유전적 다양성을 나타내는 GD와 PIC는 GB-LCM-022와 GB-LCM087 마커에서 두 값 모두 가장 낮았으며 (0.25, 0.24), GBLCM-167에서 가장 높게 나타났다 (0.83, 0.81). 평균은 각각 0.
GB-LCM-022 마커에서 4개로 가장 많았으며, GB-LCM-004와 GB-LCM-116 마커에서 각각 1개로 가장 적었다. 중국 집단의 경우 특이적 allele 수의 평균은 2.3개였으며 GB-LCM-167 마커에서 가장 많은 6개의 allele가 관찰되었다. GB-LCM-087 마커의 경우 총 6개의 allele 중 5개 (83%)의 allele가 중국 자원에만 존재하는 특이적 allele이었으며, GB-LCM-025, GB-LCM-104, GB-LCM119 마커의 경우 1개의 특이적 allele가 중국자원에만 존재하였다 (Table 4).
원산지에 따른 한국산과 중국산 구기자에 대한 유전적 다양성을 분석한 결과는 다음과 같다. 한국 구기자 집단의 평균 expected hetetozygosity (HE)와 PIC 값은 각각 0.434와 0.370로 중국 집단의 평균 HE (0.561)와 PIC (0.483) 값보다 낮게 나타났다 (Table 4). 한국 집단에서 GB-LCM-087 마커의 HE와 PIC 값 모두 0으로 나타났으며, 이는 한국 자원들이 가지고 있는 allele의 크기가 213 bp로 모두 같았기 때문이다.
한국과 중국집단 내에 존재하는 특이적 allele 수는 1개 (GB-LCM-025, GB-LCM-104, GB-LCM-119)에서 9개 (GB-LCM-167)로 다양하게 나타났다 (Table 4). 한국 집단에 존재하는 특이적 allele 수는 총 14개였으며 평균 1.4개로 나타났다. GB-LCM-022 마커에서 4개로 가장 많았으며, GB-LCM-004와 GB-LCM-116 마커에서 각각 1개로 가장 적었다.
집단 내에 존재하는 특이적 allele는 본 연구에 사용된 10개의 모든 마커에서 관찰되었다. 한국과 중국집단 내에 존재하는 특이적 allele 수는 1개 (GB-LCM-025, GB-LCM-104, GB-LCM-119)에서 9개 (GB-LCM-167)로 다양하게 나타났다 (Table 4). 한국 집단에 존재하는 특이적 allele 수는 총 14개였으며 평균 1.
후속연구
결론적으로 5개 SSR 마커를 이용하여 국내산 구기자와 중국에서 도입한 구기자에 대한 품종판별이 가능하였으며, 본 연구에 사용된 5개 SSR 마커는 구기자 원산지에 따른 품종판별, 순도 검정, 품종보호와 종자 관리체계 확립을 위한 품종의 구별성 (Distinctness), 균일성 (Uniformity) 및 안정성 (Stability) 검정에 활용될 수 있을 것이다. 또한 수입개방화 시대에 우리나라 육성 품종에 대한 지적재산권 확보 및 향후 구기자 품종 등록 시 품종 보증의 표지인자로 활용될 수 있을 것이다.
결론적으로 5개 SSR 마커를 이용하여 국내산 구기자와 중국에서 도입한 구기자에 대한 품종판별이 가능하였으며, 본 연구에 사용된 5개 SSR 마커는 구기자 원산지에 따른 품종판별, 순도 검정, 품종보호와 종자 관리체계 확립을 위한 품종의 구별성 (Distinctness), 균일성 (Uniformity) 및 안정성 (Stability) 검정에 활용될 수 있을 것이다. 또한 수입개방화 시대에 우리나라 육성 품종에 대한 지적재산권 확보 및 향후 구기자 품종 등록 시 품종 보증의 표지인자로 활용될 수 있을 것이다.
GB-LCM-087 마커의 경우 총 6개의 allele 중 5개 (83%)의 allele가 중국 자원에만 존재하는 특이적 allele이었으며, GB-LCM-025, GB-LCM-104, GB-LCM119 마커의 경우 1개의 특이적 allele가 중국자원에만 존재하였다 (Table 4). 집단 내에 존재하는 이러한 특이적 allele들은 향후 한국 및 중국 원산지에 따른 품종 구분에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
구기자 품종육성은 어떻게 이루어지고 있는가?
구기자 품종육성은 주로 교잡육종이 이용되고 있으나 시간이 오래 소요되고 많은 유전자원을 활용해야 하기 때문에 품종 개발이 활발히 이루어지지 않았으며, 국내에서 재배되는 구 기자의 대부분은 지역 수집종, 재래종 및 도입종에 의존하고 있다 (Park et al., 2000).
우리나라의 식물품종보호제도 시행을 위해서 어떤 것을 하고 있는가?
최근 유럽을 비롯한 각 국가들은 세계 무역기구의 지적재산권협정 (WTO/TRIPS)에 따라 식물품종보호제도 (Plant Variety Protection System, PVPS)의 시행을 의무화하고 있다. 우리나라도 국제 식물 신품종 보호동맹 (International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV) 가입, 종자 산업법의 발효 및 WTO 가입에 따른 수입 농산물의 개방으로 인하여 국내산과 외국산 농산물에 대한 품종 구분의 필요성이 대두되고 있으며, 농가 소득 보장과 육종가의 지적재산권을 보호하기 위해서도 과학적인 품종 구분 체계를 구축하는 것은 안정적으로 종자산업 분야를 발전시켜나가는데 중요한 일로 여겨지고 있다.
식물품종보호제도의 시행이 의무화 된 이유는 무엇인가?
최근 유럽을 비롯한 각 국가들은 세계 무역기구의 지적재산권협정 (WTO/TRIPS)에 따라 식물품종보호제도 (Plant Variety Protection System, PVPS)의 시행을 의무화하고 있다. 우리나라도 국제 식물 신품종 보호동맹 (International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV) 가입, 종자 산업법의 발효 및 WTO 가입에 따른 수입 농산물의 개방으로 인하여 국내산과 외국산 농산물에 대한 품종 구분의 필요성이 대두되고 있으며, 농가 소득 보장과 육종가의 지적재산권을 보호하기 위해서도 과학적인 품종 구분 체계를 구축하는 것은 안정적으로 종자산업 분야를 발전시켜나가는데 중요한 일로 여겨지고 있다.
참고문헌 (20)
Bernet GP, Bramardi S, Calvache D, Carbonell EA and Asins MJ. (2003). Applicability of molecular markers in the context of the protection of new varieties of cucumber. Plant Breeding. 122:146-152
Choi JS, Huh MK and Sung JS. (2009). Seed purity test and evaluation in Isatis tinctoria var. yezoensis (Ohwi) Ohwi using AFLP markers. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 17:198-203
Jang SJ, Park SJ, Park KH, Song HL, Cho YG, Jong SK, Kong JH and Kim HS. (2009). Genetic diversity and identification of Korean elite soybean cultivars including certified cultivars based on SSR markers. Korean Journal of Crop Science. 54:231-240
Ji HS, Koh HJ, Park SU and McCouch SR. (1998). Varietal identification in japonica rice using microsatellite DNA markers. Korean Journal of Breeding Science. 30:350-360
Kim SH, Chung JW, Moon JK, Woo SH, Cho YG, Jong SK and Kim HS. (2006). Discrimination of Korean soybean cultivars by SSR markers. Korean Journal of Crop Science. 51:658-668
Komori T and Nitta N. (2004). A simple method to control the seed purity of japonica hybrid rice varieties using PCR-based markers. Plant Breeding. 123:549-553
Kwon SJ, Ahn SN, Suh JP, Hong HC, Kim YK, Hwang HG, Moon HP and Choi HC. (2000). Genetic diversity of Korean native rice varieties. Korean Journal of Breeding Science. 32:186-193
Kwon YS, Moon JY, Kwon YS, Park DY, Yoon WM, Song IS and Yi SI. (2003). AFLP analysis for cultivar discrimination in radish and chinese cabbage. Korean Journal of Breeding Science. 35:319-328
Kwon YS, Lee JM, Yi1 GB, Yi SI, Kim KM, Soh EH, Bae KM, Park EK, Song IH and Kim BD. (2005). Use of SSR markers to complement tests of distinctiveness, uniformity, and stability (DUS) of pepper (Capsicum annuum L.) varieties. Molecules and Cells. 19:428-435
Kwon SJ, Lee GA, Lee SY, Park YJ, Gwag JG, Kim TS and Ma KH. (2009). Isolation and characterization of 21 microsatellite loci in Lycium chinense and cross-amplification in Lycium barbarum. Conservation Genetics. DOI 10.1007/s10592-008-9792-x
Lee WS, Choi SY, Yi SI, Cho HI, Lee SY and Kwon YS. (2007). Assessment of genetic relationship among boxthorn (Lycium chinensis Mill.) accessions by ISSR markers. Korean Journal of Breeding Science. 39:9-14
Ni J, Colowit MP and Mackill DJ. (2002). Evaluation of genetic diversity in rice subspecies using microsatellite markers. Crop Science. 42:601-607
Noil E, Teriaca MS, Sanguineti MC and Conti S. (2008). Utilization of SSR and AFLP markers for the assessment of distinctness in durum wheat. Molecular Breeding. 22:301-313
Olufowote JO, Xu Y, Chen X, Park WD, Beachell HM, Dilday RH, Goto M and McCouch SR. (1997). Comparative evaluation of within cultivar variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP makers. Genome. 40:370-378
Park YS, Kim H, Lee BC, Sung CK and Lim YP. (1996). Identification and classification of Lycium chinense Mill. culivars by RAPD analysis. Korean Journal of Breeding Science. 28:221-226
Park JS, Lee BC, Seong CG, Lee KW, Ra SW and Choi KJ. (2000). Genetic similarity of boxthorn varieties(Lycium chinense Mill.) based on RAPD analysis. Korean Journal of Breeding Science. 32:117-121
Schuelke M. (2000). An economic method for the fluorescent labeling of PCR products. Nature Biotechnology. 180:233-234
Sun MM, Choi KJ, Kim HS, Song BH, Woo SH, Lee CW, Jong SK and Cho YG. (2009). Genetic diversity and discrimination of recently distributed Korean cultivars by SSR markers. Korean Journal of Breeding Science. 41:115-125
Tommasini L, Batley J, Arnold GM, Cooke RJ, Donini P, Lee D, Law JR, Lowe C, Moule C, Trick M and Edwards KJ. (2003). The development of multiplex simple sequence repeat (SSR) markers to complement distinctness, uniformity and stability testing of rape (Brassica napus L.) varieties. Theoretical and Applied Genetics. 106:1091-1101
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.