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문제 정의
- carotovorum subsp. carotovorum을 보다 쉽고 정확하게 검출할 수 있는 진단법을 새로이 개발하고자 하였다.
- 본 연구는 P. carotovorum species들을 특이적으로 검출해 낼 수 있는 간편한 PCR법을 개발하고자 한 것이다. Roh 등(2009)은 국내에서 분리한 다양한 P.
제안 방법
- ERB_3_F/R primer를 이용하여 P. carotovorum를 검출하기 위한 PCR의 최적 annealing 온도와 MgCl2 농도를 확립하기 위하여 45~65℃의 범위 내에서 temperature gradient PCR을 수행하고, 0~30 mM 범위 내에서 MgCl2 농도의 gradient PCR을 수행하였다. ERB_3_F/R primer와 ERB_6_F/R primer를 사용한 특이 PCR에서 최적 annealing 온도는 양자 모두 58℃이었고, 최적 MgCl2 농도는 양자 모두 15 mM였다(Fig.
- P. carotovorum 검출을 위한 PCR의 민감도를 조사하기 위하여 genomic DNA를 1 ng (P. carotovorum의 genome 2×105 copies)부터 1/10씩 단계적으로 희석시킨 후, 이를 주형으로 하여 확립된 최적조건에서 각각의 PCR을 수행하였다.
- P. carotovorum 검출을 위한 PCR의 최적 primer annealing 온도의 확립을 위하여 temperature gradient PCR을 수행하였다. 본 PCR은 각 1 μl의 1 ng/μl 농도로 정량한 genomic DNA를 주형으로 1 μl의 2.
- P. carotovorum 검출을 위한 primer의 특이성을 분석하기 위하여 P. carotovorum 외의 다른 병원균, 숙주가 되는 식물체의 genomic DNA를 주형으로 하여 각각 PCR을 수행하였다. ERB_3_F/R primer에서는 양성대조군인 P.
- P. carotovorum 검출을 위해 제작된 primer에 의해 특이적인 진단이 가능한지 여부를 확인하였다. 식물성 병원균인 Xanthomonas oryzae pv.
- PCR 반응액의 조성은 각 1 μl의 1 ng/μl 농도로 정량한 genomic DNA를 주형으로 1 μl의 2.5 mM each dNTPs, 2.5 U Taq polymerase, 10× PCR reaction buffer (15 mM MgCl), 각 1 μl의 F/R primer (10 pmole)로 최종 50 μl의 양으로 하였다.
- 즉, 초기 해리는 96에서 4분간 시행하였고, 해리(96℃, 1 분), 혼성(50~58℃, 1분)및 중합(72℃, 30초)의 세 과정을 35회 반복하고 추가적인 중합과정(72℃, 8분)을 수행하였다. PCR이 끝난 후 반응물을 1.5% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 UV transilluminator에서 관찰하였다.
- carotovorum을 특이적으로 검출하기 위한 PCR법 개발을 위하여, 공시된 primer쌍들은 Roh 등(7)의 논문에서 Pectobacterium species들에 대한 높은 특이도를 보여준 primer쌍들이다. Roh 등 (7)이 제시한 specific primer 9쌍들은 모두 최적화과정을 거쳐, 총 55개 Pectobacterium species들에 대하여 PCR 증폭 패턴을 검사하였으며, 이 예비 실험을 거쳐 P. carotovorum의 검출에 특이성이 가장 높은 primer 2쌍을 선정하였고, 이들을 이후 실험에 사용하였으며, oligonucleotide의 제작은 (주)바이오닉스에 의뢰하였다(Table 2).
- Roh 등(7)의 논문에서 Pectobacterium species들에 대한 높은 특이도를 보여준 9개의 primer쌍들을 기반으로 P. carotovorum을 특이적으로 검출할 수 있는 PCR법을 개발하기 위하여, 먼저 각 primer쌍에 의한 PCR 증폭조건을 최적화하였다. 최적화는 최적 혼성온도 및 최적 MgCl2 농도를 중심으로 하였으며, 이 조건하에서 KACC (농촌진흥청)로부터 분양받은 P.
- enterica, Paenibacillus larvae subsp. larvae, Escherichia coli, Shigella sonnei와 식물체인 배추와 감자에서 각각 추출한 genomic DNA를 template로 사용하여 PCR을 수행하고 이를 비교하였다.
- 검출 한계를 측정하기 위하여 P. carotovorum genomic DNA를 1 ng로부터 10배씩 단계적으로 희석한 후, 이를 주형으로 확립된 최적조건에서 각각 PCR을 수행하였다. 전기영동으로 확인한 결과 10 pg의 초기 기질까지 437 bp의 정확한 PCR product가 생성된 것으로 확인되었으며, 이 초기기질의 양은 계산결과 2×103 copies의 P.
- 균주의 genomic DNA 추출은 Accuprep® Genomic DNA Extraction kit (Bioneer Inc., Korea)를 사용하였다.
- 본 PCR은 각 1 μl의 1 ng/μl 농도로 정량한 genomic DNA를 주형으로 1 μl의 2.5 mM each dNTPs, 2.5 U Taq polymerase, PCR reaction buffer (15 mM MgCl 2 ), 각 1 μl의 F/R primer (10 pmole)로, 최종반응액은 20 μl의 양으로 하였다.
- 본 실험에서는 GeneAMP® PCR system 2700 (Applied Biosystems, USA)을 사용하여, 제작한 primer쌍과 extraction 한 P. carotovorum의 genomic DNA를 각각의 PCR 반응 조건에 따라 P. carotovorum의 특이유전자를 증폭하였다.
- 채집된 원시료들은 각각 강원도 정선, 충북 충주, 강원도 태백, 대전 대덕구에서 재배된 배추이었으며, 각 배추의 병변부위를 절취하고 일부는 바로 genomic DNA를 추출하였으며, 나머지 일부는 LB 배지에 접종하여 18시간 배양한 후, 그 배양액에서 genomic DNA를 추출하였다. 생체시료 및 배양시료에서 얻어진 두 종류의 genomic DNA들은 각각 정량하여 PCR의 주형으로 사용하였으며 각각 확립된 최적 조건에서 특이 PCR을 수행하여 P. carotovorum의 검출여부를 확인하였다.
-
carotovorum 검출이 가능한가를 확인하기 위하여, 원산지가 각기 다른, 배추 무름병의 전형적 증상을 보이는 4종 배추들을 수집하였다. 이 4종 배추시료들의 각 병변에서 각기 genomic DNA를 바로 추출하였으며, 또한 각기 LB배지에서 배양하고 그 배양액에서 각기 genomic DNA를 추출하여 PCR증폭에 주형으로 사용하였다. PCR증폭은 본 연구에서 확립된 최적 조건의 ERB_3_F/R primer를 사용한 PCR이었으며, 결과로써 4종의 생체시료 및 4종의 배양시료에서 모두 특이적인
- carotovorum 균주 55종 모두를 PCR 증폭하여, 각 primer쌍에 따른 종특이성의 우열을 검사하였다(자료 미제시). 이 결과로써 가장 우수한 종특이성을 보인 2쌍의 primer를 선발할 수 있었으며, 이들 2쌍의 특이 primer를 중심으로 이후 실험을 진행하였다.
- 일반적인 PCR 조건은 다음과 같았다. 즉, 초기 해리는 96에서 4분간 시행하였고, 해리(96℃, 1 분), 혼성(50~58℃, 1분)및 중합(72℃, 30초)의 세 과정을 35회 반복하고 추가적인 중합과정(72℃, 8분)을 수행하였다. PCR이 끝난 후 반응물을 1.
- carotovorum을 특이적으로 검출할 수 있는 PCR법을 개발하기 위하여, 먼저 각 primer쌍에 의한 PCR 증폭조건을 최적화하였다. 최적화는 최적 혼성온도 및 최적 MgCl2 농도를 중심으로 하였으며, 이 조건하에서 KACC (농촌진흥청)로부터 분양받은 P. carotovorum 균주 55종 모두를 PCR 증폭하여, 각 primer쌍에 따른 종특이성의 우열을 검사하였다(자료 미제시). 이 결과로써 가장 우수한 종특이성을 보인 2쌍의 primer를 선발할 수 있었으며, 이들 2쌍의 특이 primer를 중심으로 이후 실험을 진행하였다.
- , Korea)를 사용하였다. 추출방법은 제조사의 지시를 따라 수행하였으며, 추출된 Genomic DNA 시료는 분광광도계(Eppendorf, Germany)를 이용하여 정량하였다.
대상 데이터
- carotovorum subsp. odoriferum 1균주를 사용하였다. 사용된 균주는 nutrient agar (NA)에서 유지하였으며, nutrient broth (NB) 배지에 접종하고 28℃에서 16시간 동안 진탕 배양하여 실험에 사용하였다(Table 1).
- odoriferum 1균주를 사용하였다. 사용된 균주는 nutrient agar (NA)에서 유지하였으며, nutrient broth (NB) 배지에 접종하고 28℃에서 16시간 동안 진탕 배양하여 실험에 사용하였다(Table 1).
- 실험실에서 배양된 균주가 아닌, 현장의 생체시료에 대해서도 특이 PCR 검출법의 적용이 가능한지 확인하기 위하여 원산지별로 무름병으로 의심되는 배추를 수집하였다. 채집된 원시료들은 각각 강원도 정선, 충북 충주, 강원도 태백, 대전 대덕구에서 재배된 배추이었으며, 각 배추의 병변부위를 절취하고 일부는 바로 genomic DNA를 추출하였으며, 나머지 일부는 LB 배지에 접종하여 18시간 배양한 후, 그 배양액에서 genomic DNA를 추출하였다.
- 실험실에서 배양된 균주가 아닌, 현장의 생체시료에 대해서도 특이 PCR 검출법의 적용이 가능한지 확인하기 위하여 원산지별로 무름병으로 의심되는 배추를 수집하였다. 채집된 원시료들은 각각 강원도 정선, 충북 충주, 강원도 태백, 대전 대덕구에서 재배된 배추이었으며, 각 배추의 병변부위를 절취하고 일부는 바로 genomic DNA를 추출하였으며, 나머지 일부는 LB 배지에 접종하여 18시간 배양한 후, 그 배양액에서 genomic DNA를 추출하였다. 생체시료 및 배양시료에서 얻어진 두 종류의 genomic DNA들은 각각 정량하여 PCR의 주형으로 사용하였으며 각각 확립된 최적 조건에서 특이 PCR을 수행하여 P.
- 현장 시료에서 바로 P. carotovorum 검출이 가능한가를 확인하기 위하여, 원산지가 각기 다른, 배추 무름병의 전형적 증상을 보이는 4종 배추들을 수집하였다. 이 4종 배추시료들의 각 병변에서 각기 genomic DNA를 바로 추출하였으며, 또한 각기 LB배지에서 배양하고 그 배양액에서 각기 genomic DNA를 추출하여 PCR증폭에 주형으로 사용하였다.
성능/효과
- 따라서 ERB_3_F/R primer만이 타 생물체의 genome 혼합하에서도 P. carotovorum을 특이적으로 검출할 수 있는 것으로 판단되었으며, 또한, ERB_6_F/R는 배추의 genomic DNA의 오염이 없는 상황에서만 P. carotovorum 특이 PCR 검출에 사용될 수 있음을 보여주었다(Fig. 2).
-
carotovorum 외의 다른 병원균, 숙주가 되는 식물체의 genomic DNA를 주형으로 하여 각각 PCR을 수행하였다. ERB_3_F/R primer에서는 양성대조군인 P. carotovorum genomic DNA를 주형으로 한 PCR 외에서는 반응산물을 생산하지 않는 것으로 확인되었으나, ERB_6_F/R primer는 배추의 genomic DNA에서 반응산물을 만들어 내는 것으로 확인되었다.
- carotovorum를 검출하기 위한 PCR의 최적 annealing 온도와 MgCl2 농도를 확립하기 위하여 45~65℃의 범위 내에서 temperature gradient PCR을 수행하고, 0~30 mM 범위 내에서 MgCl2 농도의 gradient PCR을 수행하였다. ERB_3_F/R primer와 ERB_6_F/R primer를 사용한 특이 PCR에서 최적 annealing 온도는 양자 모두 58℃이었고, 최적 MgCl2 농도는 양자 모두 15 mM였다(Fig. 3).
-
이 4종 배추시료들의 각 병변에서 각기 genomic DNA를 바로 추출하였으며, 또한 각기 LB배지에서 배양하고 그 배양액에서 각기 genomic DNA를 추출하여 PCR증폭에 주형으로 사용하였다. PCR증폭은 본 연구에서 확립된 최적 조건의 ERB_3_F/R primer를 사용한 PCR이었으며, 결과로써 4종의 생체시료 및 4종의 배양시료에서 모두 특이적인
437 bp의 PCR product가 생성됨으로써 본 연구의 결과인 P. carotovorum 특이 PCR 검출법은 배양시료가 아닌 현장시료에 대해서도 바로 적용할 수 있음을 보여주었다(Fig. 5). - 이 점은 이 primer쌍들의 특이성에 대한 한계라 판단되며, 차후의 연구에서 보완될 수 있기를 기대하였다. 결론적으로 본 연구에서 선발된 2쌍의 primer쌍들은 모두 P. carotovorum에 대한 높은 특이도를 보임을 알 수 있었다(Fig. 1).
- 본 연구에서는 상기 논문에서 제시한 9종의 PCR 염기쌍들을 전수 분석하여, P. carotovorum species들에 대한 특이 검출용 PCR법을 제시할 수 있었으며, 배추의 병원균 동정을 위한 PCR 검출에서는 ERB_3_F/R primer를 사용하는 PCR법이, 또한 순수배양된 시험용 균주에 대하여는 ERB_6_F/R primer를 사용하는 PCR법도 우수한 변별력을 가지는 것을 보여주었다.
- 전기영동으로 확인한 결과 10 pg의 초기 기질까지 437 bp의 정확한 PCR product가 생성된 것으로 확인되었으며, 이 초기기질의 양은 계산결과 2×103 copies의 P. carotovorum genome으로 계산되었다(Fig. 4).
- 최종 선발된 ERB_3F/R primer와 ERB_6F/R primer를 각기 사용한 총 55종의 균주에 대한 PCR 검출실험에서, 양자는 모두 55종 P. carotovorum 균주 중 52종의 균주에 대하여 정확한 반응산물을 생산하는 보편성을 보였다. 또한 2쌍의 primer가 공통적으로 KACC 10358, KACC 10368의 두 종 균주에 대해서 PCR 생성물을 만들지 아니하였으며, P.
후속연구
- 본 연구는, 우리의 조사로는, P. carotovorum species를 특이적 PCR법으로 검출해 낼 수 있는 최초의 보고라 생각하며, 이 보고를 시작으로 다양한 P. carotovorum species들을 더욱 완벽하고 간편하게 검출해 낼 수 있는 우수한 종특이적 PCR 검출법이 개발되기를 기대한다.
- odoriferum 균주에 대하여는 2쌍의 primer가 모두 반응하는 것으로 나타났다. 이 점은 이 primer쌍들의 특이성에 대한 한계라 판단되며, 차후의 연구에서 보완될 수 있기를 기대하였다. 결론적으로 본 연구에서 선발된 2쌍의 primer쌍들은 모두 P.
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