Carboxymethyl celluase (cellulase) was purified from cell-free extract of the recombinant Escherichia coli carrying a Bacillus licheniformis WL-12 cellulase gene by DEAE-Sepharose and phenyl-Sepharose column chromatography with specific activity of 163 U/mg protein. The molecular mass of the purifie...
Carboxymethyl celluase (cellulase) was purified from cell-free extract of the recombinant Escherichia coli carrying a Bacillus licheniformis WL-12 cellulase gene by DEAE-Sepharose and phenyl-Sepharose column chromatography with specific activity of 163 U/mg protein. The molecular mass of the purified enzyme was estimated to be approximately 49.5 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The enzyme had a pH optimum at 5.5 and a temperature optimum at $55^{\circ}C$. The activity of the enzyme was completely inhibited by SDS (5 mM), and slightly enhanced by $Cu^{2+}$ (5 mM). The cellulase was active on CMC, konjac, barely glucan and lichenan, while it did not exhibit activity towards xylan, locust bean gum, and p-nitrophenyl-$\beta$-glucopyranoside. The predominant products resulting from the cellulase hydrolysis were cellobiose and cellotriose for cellooligosaccharides including cellotriose, cellotetraose and cellopentaose. The enzyme could hydrolyze cellooligosaccharides larger than cellobiose.
Carboxymethyl celluase (cellulase) was purified from cell-free extract of the recombinant Escherichia coli carrying a Bacillus licheniformis WL-12 cellulase gene by DEAE-Sepharose and phenyl-Sepharose column chromatography with specific activity of 163 U/mg protein. The molecular mass of the purified enzyme was estimated to be approximately 49.5 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The enzyme had a pH optimum at 5.5 and a temperature optimum at $55^{\circ}C$. The activity of the enzyme was completely inhibited by SDS (5 mM), and slightly enhanced by $Cu^{2+}$ (5 mM). The cellulase was active on CMC, konjac, barely glucan and lichenan, while it did not exhibit activity towards xylan, locust bean gum, and p-nitrophenyl-$\beta$-glucopyranoside. The predominant products resulting from the cellulase hydrolysis were cellobiose and cellotriose for cellooligosaccharides including cellotriose, cellotetraose and cellopentaose. The enzyme could hydrolyze cellooligosaccharides larger than cellobiose.
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문제 정의
SDS-PAGE로 활성염색을 하여 resin에 결합되지 않은 효소와 결합된 효소를 비교하였을 때 resin에 결합되지 않은 cellulase는 크기가 작은 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 크기가 큰 cellulase를 정제하기 위해 NaCl로 용출한 분획 중 cellulase 활성을 보이는 분획을 ultrafiltration으로 농축하고 이를 Q-Sepharose 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. Q-Sepharose에 결합된 단백질을 NaCl로 용출한 후 활성분획을 모아 농축하여 SDS-PAGE로 분석한 결과 Fig.
제안 방법
B. licheniformis WL-12의 cellulase 유전자를 대장균에서 과잉 발현시키기 위해 signal peptide를 포함하는 cellulase 구조유전자가 증폭되도록 설계된 12CelF와 12CelR primers를 사용하여 PCR을 수행하였다. Primers의 서열에는 pET23a(+)에 cellulase 유전자를 크로닝하기 위해 NdeI과 XhoI을 도입하였다.
Cellooligosaccharides를 반응기질로 하여 효소반응을 수행하고 반응액을 95℃에서 3분 동안 열처리한 후 원심 분리하여 단백질 침전물을 제거하고 상등액을 적정량 취해 n-propanol, nitromethane과 증류수[7:1:2, (v/v)] 혼합용액을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate (Merck Kiesegel, No. 5748)에서 박층 크로마토그래피를 수행하였다. 전개된 물질을 발색시키기 위해서는 9 ml ethanol, 0.
Cellulase 유전자를 증폭하기 위해 WL-12의 cellulase 유전자를 함유한 재조합 플라스미드를 주형으로 하고 유전자의 염기서열에 근거하여 제조한 12CelF (5’-GGAAAACATATGTCATATATG AAACGTTC-3’: NdeI sites; underlined)와 12CelR (5’-CGTC AAACTCGAGTTATTTAGGTTCAGTG-3’: XhoI sites; underlined)primers를 사용하여 pfu DNA polymerase로 PCR 반응을 실시하였다.
Cellulase 유전자를 함유한 E. coli BL21(DE3)/pPES3를 ampicillin이 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 진탕배양하면서 600 nm에서 흡광도가 0.7 정도에 이르렀을 때 IPTG를 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 첨가한 후 25℃에서 5시간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 회수한 균체를 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.
Cellulase를 정제하기 위해서 대장균 균체 파쇄상등액을 ammonium sulfate (30%~70%)로 분획하여 얻은 단백질을 DEAE-Sepharose 컬럼 크로마토그래피로 정제하였는데 resin에 결합되지 않고 그대로 용출되는 cellulase와 resin에 결합되어 NaCl 농도구배를 주었을 때 용출되는 cellluase로 구별되었다. SDS-PAGE로 활성염색을 하여 resin에 결합되지 않은 효소와 결합된 효소를 비교하였을 때 resin에 결합되지 않은 cellulase는 크기가 작은 것으로 확인되었다.
Cellulase에 의한 가수분해 산물을 분석하기 위해 기질로 glucose의 중합도가 다른 cellobiose, cellotriose, cellotetraose 그리고 cellopentaose를 사용하여 과량의 효소를 처리한 후 가수분해 산물을 TLC로 조사하였다. 그 결과 cellobiose는 전혀 분해되지 않았으나 중합도가 3개 이상인 올리고당은 모두 분해되는 것으로 나타났으며 cellotriose의 분해정도가 가장 낮았다(Fig.
25 ml를 혼합하여 55℃에서 15분 동안 반응시켰다. DNS 시약 3 ml를 첨가하여 반응을 정지시키고 끓는 물에서 5분 동안 방치하여 발색시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하고 이를 glucose를 표준시료로 사용하여 동일 조건하에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소활성도 1.
0)에 현탁하여 동일한 완충용액으로 투석을 한 후, DEAESepharose 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. NaCl (0~0.8 M)로 추출하여 얻은 활성분획을 모아 ultrafiltration으로 농축한 후 이를 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)로 투석하고 Q-Sepharose 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 결합된 효소를 추출하기 위해서는 동일 완충용액으로 NaCl (0~0.
Cellulase 유전자를 증폭하기 위해 WL-12의 cellulase 유전자를 함유한 재조합 플라스미드를 주형으로 하고 유전자의 염기서열에 근거하여 제조한 12CelF (5’-GGAAAACATATGTCATATATG AAACGTTC-3’: NdeI sites; underlined)와 12CelR (5’-CGTC AAACTCGAGTTATTTAGGTTCAGTG-3’: XhoI sites; underlined)primers를 사용하여 pfu DNA polymerase로 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 95℃에서 3분간 열처리한 후 95℃에서 30초, 62℃에서 40초, 72℃에서 3분간 반응을 30회 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분간 방치하여 수행하였다.
0)로 투석하고 Q-Sepharose 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 결합된 효소를 추출하기 위해서는 동일 완충용액으로 NaCl (0~0.6 M) 농도구배를 주어 분획하였으며 효소활성을 보이는 분획들을 모아서 ultrafiltration으로 농축하고 이를 정제된 효소로 사용하였다.
0)에 현탁하고 초음파로 균체를 파쇄한 후 15,000×g, 4℃에서 20분간 원심분리함으로써 균체 파쇄상등액을 제조하였다. 균체 파쇄상등액에 ammonium sulfate를 첨가하여 30~70% (w/v)로 분획한 침전물을 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)에 현탁하여 동일한 완충용액으로 투석을 한 후, DEAESepharose 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. NaCl (0~0.
금속이온이나 화합물이 cellulase 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 반응액에 5 mM의 농도로 첨가하여 정제된 효소로 반응을 실시하였다. Table 1에 보인 바와 같이 SDS의 존재하에서는 효소활성이 거의 대부분 저해되었으며, 대부분의 다른 화합물은 적은 범위에서 효소활성을 저해 또는 증가시키는 것으로 나타났다.
대장균이 생산한 WL-12의 cellulase 활성에 미치는 반응온도와 반응 pH의 영향을 분석하였다. 그 결과 WL-12의 cellulase는 55℃와 pH 5.
Primers의 서열에는 pET23a(+)에 cellulase 유전자를 크로닝하기 위해 NdeI과 XhoI을 도입하였다. 따라서 증폭한 cellulase 유전자를 NdeI과 XhoI으로 절단한 후 구조유전자 부분을 추출하고 이를 동일한 효소로 절단된 pET23a(+)에 도입함으로써 재조합 플라스미드 pPES3을 제조하였다(Fig. 1). pPES3에 삽입된 cellulase 유전자의 염기서열을 결정하여 PCR 반응 중 변이가 일어나지 않은 것을 확인하였다.
재조합 플라스미드 pPES3을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 얻은 형질전환주를 LB 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하면서 IPTG를 처리하였다. 발현된 cellulase의 수용화 정도를 높이기 위해 IPTG 처리 후에는 배양온도를 25℃로 낮추어 5시간 배양하였다.
정제된 효소를 이용하여 CMC를 비롯한 여러 다당류의 가수 분해 활성을 비교하였다. 효소반응에 사용된 다당류는 모두 반응액에 0.
또한 chitosanase를 생산하는 MB-2가 인도네시아 온천에서 분리된 바 있으며(6), 14A의 펙틴분해에 관련된 효소(1)에 대한 연구도 이루어졌다. 한편 국내 가정에서 제조된 된장에서 고온성 미생물로 분리된 B. licheniformis WL-12의 cellulase는 B. licheniformis ATCC 14580의 효소와 동일한 아미노산 잔기서열을 갖는 것으로 확인되었는데(23), 현재까지 그 특성에 대한 보고가 없어 본 연구에서는 대장균에서 cellulase 유전자를 발현하여 효소를 정제하고 효소반응 특성을 검토하였다.
대상 데이터
B. licheniformis WL-12의 cellulase 유전자를 과잉발현하기 위한 플라스미드와 숙주균으로 pET23a(+)와 E. coli BL21(F-ompT hadSB(rB-mB-), gal dcm(DE3))를 각각 사용하였으며, 배지로는 ampicillin (100 µg/ml)을 첨가한 LB 액체배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10 g; NaCl, 5 g; water, 1 L)를 사용하였다.
이론/모형
Cellulase 활성은 CMC를 기질로 하여 효소 반응 후에 유리된 환원당을 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법으로 다음과 같이 정량함으로써 측정하였다. 증류수에 현탁시킨 1.
성능/효과
BL21(DE3)/pPES3로부터 생산된 cellulase를 SDS-PAGE에서 활성염색을 실시한 결과 3종류 이상의 활성 bands가 확인되었다(결과 미제시). WL-12의 cellulase가 한 개의 활성영역과 한 개의 cellulose binding domain (CBD)으로 구성되어 있고 대장균에서 생산된 cellulase의 C-말단에 존재하는 CBD가 분해되어도 활성 영역은 cellulase 활성을 유지할 수 있으므로 여러 개의 활성 bands가 관찰된 것으로 여겨진다.
Lichenan과 barley β-glucan은 모두 glucose가 β-1,3-1,4 결합에 하고 있지만 β-1,3 결합과 β-1,4 결합의 비율이 차이가 있으며 lichenan은 barley β-glucan lichenan에 비해 β-1,3 결합의 비율이 높다. Locust bean gum이나 oat spelt xylan은 cellulase에 의해 가수분해가 일어나지 않은 것으로 보아 WL-12의 cellulase는 mannanase와 xylanase 활성은 없는 것으로 확인되었다. Konjac은 glucomannan 다당류로 구성되어 있는데 cellulase의 경우 glucose 잔기간의 결합을 분해하고 mannanase의 경우는 mannose 잔기간의 결합을 분해할 수 있다.
본 연구에서는 크기가 큰 cellulase를 정제하기 위해 NaCl로 용출한 분획 중 cellulase 활성을 보이는 분획을 ultrafiltration으로 농축하고 이를 Q-Sepharose 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. Q-Sepharose에 결합된 단백질을 NaCl로 용출한 후 활성분획을 모아 농축하여 SDS-PAGE로 분석한 결과 Fig. 2에 보인 바와 같이 분자량이 약 49.5 kDa인 cellulase가 확인되었는데 이는 대장균에서 정제된 B. licheniformis NBL420의 cellulase-chitosanase의 분자량과 동일하였다(8). 유전자의 염기서열에서 유추되는 cellulase의 분자량은 56.
Cellulase를 정제하기 위해서 대장균 균체 파쇄상등액을 ammonium sulfate (30%~70%)로 분획하여 얻은 단백질을 DEAE-Sepharose 컬럼 크로마토그래피로 정제하였는데 resin에 결합되지 않고 그대로 용출되는 cellulase와 resin에 결합되어 NaCl 농도구배를 주었을 때 용출되는 cellluase로 구별되었다. SDS-PAGE로 활성염색을 하여 resin에 결합되지 않은 효소와 결합된 효소를 비교하였을 때 resin에 결합되지 않은 cellulase는 크기가 작은 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 크기가 큰 cellulase를 정제하기 위해 NaCl로 용출한 분획 중 cellulase 활성을 보이는 분획을 ultrafiltration으로 농축하고 이를 Q-Sepharose 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
1). pPES3에 삽입된 cellulase 유전자의 염기서열을 결정하여 PCR 반응 중 변이가 일어나지 않은 것을 확인하였다.
발현된 cellulase의 수용화 정도를 높이기 위해 IPTG 처리 후에는 배양온도를 25℃로 낮추어 5시간 배양하였다. 균체를 회수하고 초음파로 파쇄한 후 원심분리하여 얻은 균체 파쇄상등액과 배양상등액에 존재하는 cellulase 활성을 비교한 결과 배양부피 기준으로 균체 파쇄상등액은 5.28 U/ml의 효소활성을 보였으나, 배양상등액에서는 균체 파쇄상등액의 약 1% 정도에 해당하는 효소활성을 보였다. 이로보아 재조합 대장균에서 생산된 cellulase는 대부분이 균체 내에 존재하는 것으로확인되었는데, 대장균에 도입된 cellulase 유전자가 signal peptide를 부분을 포함하고 있음에도 불구하고 균체외로 분비되지 않았음을 알 수 있다.
대장균이 생산한 WL-12의 cellulase 활성에 미치는 반응온도와 반응 pH의 영향을 분석하였다. 그 결과 WL-12의 cellulase는 55℃와 pH 5.5에서 최대의 활성을 보였다(Fig. 3). B.
Cellulase에 의한 가수분해 산물을 분석하기 위해 기질로 glucose의 중합도가 다른 cellobiose, cellotriose, cellotetraose 그리고 cellopentaose를 사용하여 과량의 효소를 처리한 후 가수분해 산물을 TLC로 조사하였다. 그 결과 cellobiose는 전혀 분해되지 않았으나 중합도가 3개 이상인 올리고당은 모두 분해되는 것으로 나타났으며 cellotriose의 분해정도가 가장 낮았다(Fig. 5). Cellopentaose, cellotetraose와 cellotriose의 최종 가수분해산물로는 B-41351의 cellulase와 유사하게 glucose는 생성되지 않고 cellobiose와 cellotriose가 생성되지만, B-41351과는 달리 cellobiose가 cellotriose 보다 많은 것으로 나타났다(3).
유전자 서열에서 분자량이 27.4 kDa으로 유추된 B. licheniformis의 cellulase나(15) 많은 Bacillus 유래의 cellulases의 분자량(<42 kDa) 보다는 재조합 대장균에서 생산된 WL-12의 cellulase는 분자량이 큰 것을 알 수 있다.
28 U/ml의 효소활성을 보였으나, 배양상등액에서는 균체 파쇄상등액의 약 1% 정도에 해당하는 효소활성을 보였다. 이로보아 재조합 대장균에서 생산된 cellulase는 대부분이 균체 내에 존재하는 것으로확인되었는데, 대장균에 도입된 cellulase 유전자가 signal peptide를 부분을 포함하고 있음에도 불구하고 균체외로 분비되지 않았음을 알 수 있다. 대장균에서 cellulase 또는 이와 유사한 균체외 분비효소의 외래유전자가 발현될 경우 일정량의 효소가 균체외부로 분비되는 경우가 다수 보고된 바가 있다.
CH43과 HR68의 효소와는 유사하였다(8, 16). 최적반응 조건에서 CMC를 기질로 하여 정제된 WL-12 cellulase를 반응하였을 때 효소비활성은 163 U/mg으로 확인되었으며 이는 대장균에서 생산된 B-41351의 cellulase 비활성(60.7 U/mg) 보다는 높고 B-41351의 배양상등액에서 정제된 35 kDa cellulase의 비활성(183 U/mg)과는 유사하며, 최근에 정제된 DL-3의 cellulase 비활성(6,070 U/mg) 보다는 매우 낮았다.
효소반응에 사용된 다당류는 모두 반응액에 0.5% 농도로 하여 실험을 실시하였는데, 정제된 cellulase는 glucose가 β-1,4 결합으로 구성된 CMC의 가수분해능보다 β-1,3-1,4 결합으로 이루어진 barley β-glucan에 대한 가수분해능이 2배 이상 높았으며 lichenan에 대한 가수분해능은 CMC 분해능의 83%에 이르렀다(Table 2).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
대장균이 생산한 WL-12의 cellulase 최대 활성을 나타내는 온도와 pH는?
대장균이 생산한 WL-12의 cellulase 활성에 미치는 반응온도와 반응 pH의 영향을 분석하였다. 그 결과 WL-12의 cellulase는 55℃와 pH 5.5에서 최대의 활성을 보였다(Fig. 3).
Endo-β-1,4-glucanase란 무엇인가?
Endo-β-1,4-glucanase (carboxymethyl cellulase : cellulase)는 exo-β-1,4-glucanase, β-glucosidase와 더불어 cellulase계 구성효소로서 재생자원인 농 · 임산 폐자원의 당화, 과일음료와 맥주의 청징, 사료첨가물 및 면직물 가공 등 다양한 용도로 이용되는 산업용 효소이다. Cellulase는 세균, 곰팡이와 더불어 식물과 동물에서도 생산되고 있으며 glycosyl hydrolase (GH) family를 구성하는 가장 큰 집단이다.
B. licheniformis에서 가장 많이 연구된 효소는 무엇인가?
B. licheniformis에서 가장 많이 연구된 효소로는 내열성 α-amylase가 있으며, 호알칼리성 protease (18), cellulase-chitosanase (8). xylanase (5), β-1,3-1,4-glucanase (15, 20), cellulase (2, 3, 14), mannanase (7)와 같은 섬유물질 분해에 관련된 효소의 특성이나 그 유전자가 분석되었다.
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