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문제 정의
- polymixa 등에서도 발견되기 때문에 선택 배지에서 자란 집락들이 이들 독소를 함유하고 있는지 확인할 필요가 있다. 이 연구는 MYP 선택배지 상에서 B. cereus를 구분하고 독소 유전자 함유 여부를 판별하기 위해, 형태별로 생화학적 동정, 16S rRNA 유전자의 염기서열 결정, 독소 유전자 확인을 위한 PCR을 수행함으로써 식품공전상 B. cereus 계수 방법을 개선하는데 목표를 두었다.
제안 방법
- 16S rRNA 유전자의 염기서열에 의한 균 동정을 위해 universal primer로서 518F (5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’)와 800R (5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’)을 이용, 각 균주의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭하였고 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems Inc., USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다.
- cytotoxis로 동정할 수 있었다. B. cereus group에 속하는 B. cereus와 B. anthracis는 유전적으로 매우 가까운 근연종이기 때문에 (B), (E), (F)의 경우 16S rRNA 유전자 염기 서열 결과만으로는 동정하기 어려워 생화학적 대사 특성을 이용한 동정 결과를 참고하였다. 생화학적 동정 결과 세 집락 (B), (E), (F)는 B.
- GenBank의 각 B. cereus 독소 유전자 염기서열들에서 PRIMER3 program (12)을 사용해 일차적인 primer 후보들을 찾은 뒤, BLASTN program으로 부터 얻은 독소 유전자들 내의 염기 서열 상동 부위들과 대조하여 최종 primer를 선정하였다 (Table 1). 분리주들을 nutrient broth에 순수 접종하여 흡광도 0.
- FJ982654∼FJ982665로 GenBank에 등재하였다. 각 균주의 염기서열은 NCBI database로부터 BLASTN program (16)과, Ribosomal Database Project 10.10 (RDP)의 database로부터 SeqMatch program version 3을 사용하여 표준균주(type strain)들의 16S rRNA 유전자 염기서열들과 상동성을 비교하였다. 결정한 염기서열들 간의 상호 비교는 CLUSTAL W 프로그램을 사용하였다(15).
- 각 형태별 균 동정을 위해 배양균에 대한 46종류의 생화학 반응을 실시하였다(Table 2). B.
- 각 형태별로 1 toothpick을 취하여 새로운 MYP 한천배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양하였다. 균 모양은 그람 염색 후 광학 현미경을 통해 관찰하였다(8). 생화학적 동정을 위해 VITEK 2 System (bioMérieux Vitek Inc.
- 장류에서 분리한 약 1,500개의 집락들을 대상으로 형태에 따라 분류한 결과 12종으로 나눌 수 있었으며, 각 집락의 균은 그람 염색 시 현미경하에서 양성을 나타냈다. 먼저 집락 주위에 11~16 mm의 불투명한 분홍색 환을 가지기 때문에 MYP 계수 매뉴얼(Difco)에 따라 B. cereus로 분류할 수 있는 6종의 형태 (Fig. 1A~G)를 확인하였다. 이들 중 집락 (B), (D), (F), (G)는 형태적으로는 서로 닮았으나 평판 배양 시 주위 환의 직경과 색, 집락에 대한 환 크기 비율에서 항상 구분할 수 있는 차이를 나타냈다.
- cereus 독소 유전자 염기서열들에서 PRIMER3 program (12)을 사용해 일차적인 primer 후보들을 찾은 뒤, BLASTN program으로 부터 얻은 독소 유전자들 내의 염기 서열 상동 부위들과 대조하여 최종 primer를 선정하였다 (Table 1). 분리주들을 nutrient broth에 순수 접종하여 흡광도 0.7까지 자란 균의 DNA를 추출한 뒤 각 독소 유전자 확인을 위해 PCR은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃ 1분간 변성, 58℃ 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭 과정을 30회 반복과 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.
- 여섯 종류의 시료들을 102 ~104 배로 희석한 뒤 배양한 18개 MYP 평판 배지에서 약 1,500개의 집락들을 형태적 차이에 의해 12종으로 구분하였다. 각 형태별로 1 toothpick을 취하여 새로운 MYP 한천배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양하였다.
- cereus의 배양과 계수는 식품의약품안전청 식품공전 일반 시험법에 준해 행하였다(2). 즉, 전북 소재 전통 장류 업체들로부터 구입한 여섯 종류의 된장, 고추장, 청국장들을 대상으로 각 시료당 5 g을 취해 인산 완충액으로 단계별 희석한 시료액 0.2 ml을 MYP (Difco) 한천 배지에 도말하고 30℃에서 24시간 및 48시간 배양 후 나타난 집락을 계수하였다. 선택 배지 로서 MYP 배지 이외에 chromogenic polymyxin B-methoprim agar (CPMA, Oxoid) 배지를 사용하였고 배양 조건은 MYP 배지에서와 동일하였다.
- 집락 형태별로 B. cereus group이 지닌 주요 장독소 유전자들 (nhe, hbl, cytK, ces)의 존재 유무를 PCR을 통해 확인하였다 (Table 3). B.
- 생화학 동정에 사용한 BCL ID Card 및 소프트웨어는 42가지 Bacillus 종만을 구분할 수 있는 프로그램으로 구성되었기 때문에 Bacillus가 아닌 속이나, Bacillus 아종의 경우 동정하기 어렵다. 특히 자연에 노출된 상태로 발효와 숙성과정을 거치는 전통 장류의 경우 Bacillus 이외의 다양한 균들이 함께 성장하는 경우가 흔하기 때문에 생화학적 동정 결과의 재확인을 위해 16S rRNA 유전자의 염기서열 차이에 의한 동정을 수행하였다.
대상 데이터
- FJ982654∼FJ982665로 GenBank에 등재하였다.
- cereus subsp. cytotoxis NVH2391-98 (152022606), B. anthracis A0248 (CP001598)을 계통도 작성에 이용하였다. 계통도는 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 gap이 최소화 되도록 보정한 후 Kimura’s two-parameter method와 maximum parsimony (MP)법을 사용하여 작성하였다.
- 2 ml을 MYP (Difco) 한천 배지에 도말하고 30℃에서 24시간 및 48시간 배양 후 나타난 집락을 계수하였다. 선택 배지 로서 MYP 배지 이외에 chromogenic polymyxin B-methoprim agar (CPMA, Oxoid) 배지를 사용하였고 배양 조건은 MYP 배지에서와 동일하였다.
데이터처리
- 10 (RDP)의 database로부터 SeqMatch program version 3을 사용하여 표준균주(type strain)들의 16S rRNA 유전자 염기서열들과 상동성을 비교하였다. 결정한 염기서열들 간의 상호 비교는 CLUSTAL W 프로그램을 사용하였다(15). RDP database상 B.
- 계통도는 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 gap이 최소화 되도록 보정한 후 Kimura’s two-parameter method와 maximum parsimony (MP)법을 사용하여 작성하였다. 산출된 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위하여 Bootstrap 분석을 1,000회 실행하였다. 계통분석과 bootstrap 분석은 PAUP version 4.
이론/모형
- 계통도는 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 gap이 최소화 되도록 보정한 후 Kimura’s two-parameter method와 maximum parsimony (MP)법을 사용하여 작성하였다.
- 장류 내 B. cereus의 배양과 계수는 식품의약품안전청 식품공전 일반 시험법에 준해 행하였다(2). 즉, 전북 소재 전통 장류 업체들로부터 구입한 여섯 종류의 된장, 고추장, 청국장들을 대상으로 각 시료당 5 g을 취해 인산 완충액으로 단계별 희석한 시료액 0.
성능/효과
- cereus 집락 계수에 포함시키는 것이 당연하다. MYP 계수 매뉴얼상 형태적으로 B. cereus에 포함시킬 수 없었던 2~4 mm의 타원형 붉은색 집락(J)는 계통분석 결과 표준균주인 Brevibacillus borstelensis NRS-1219와 94% 상동성을, BLAST search에서 2종의 Brevibacillus borstelensis 비표준균주들과는 99.7%의 상동성(각각 1467/1472 및 1465/1470 서열 일치)을 나타냈다. 직경 1 mm 크기의 흰색 집락 (K)는 Enterococcus faecium DSM20477과 99.
- cereus subsp. cytotoxis MHV 391-98과 각각 99.7% (1476 bp/1481 bp) 및 99.9% (1483/1485)의 16S rRNA 유전자 염기서열 상동성을 보였고, 집락 (D), (G), (I) 는 B. cereus ATCC 10987과 순서별로 99.7% (1478/1483), 99.8% (1477/1480), 99.7% (1477/1481)의 상동성, 집락 (B), (E), (F)는 순서별로 B. cereus Q1과 99.8% (1456/1459), 99.9% (1478/1480), 99.7% (1478/1482), B. anthracis A0248과는 99.7% (1456/1460), 99.8% (1478/1481), 99.7% (1478/1482)의 상동성을, 집락 (C)는 B. cereus 03BB102와 99.9% (1480/1481) 상동성을 보였다. 특징적으로 9종 모두 3’쪽의 최말단 위치(1,450~1,485 bp)에서 1~5개의 염기서열에 차이가 있었다.
- cereus subsp. cytotoxis, Brevibacillus, B. subtilis, Enterococcus의 다섯 그룹으로 분류할수 있었으며 B. cereus들 사이에서도 세 가지의 소그룹으로 구분 되었다. 집락 (A)와 (H)는 B.
- cereus subsp. cytotoxis로 동정할 수 있었다. B.
- sphaericus/B. fusiformis (93% probability)로, 1 mm 직경의 광택나는 흰색 집락 (K)는 B. coagulans (86% probability)로, 직경 약 1.5 mm의 광택이 있고 투명한 노랑색을 띠며 배지 주위를 노랑으로 바꾸는 집락 (L)은 B. licheniformis (85% probability)로 동정되었다. 생화학 동정에 사용한 BCL ID Card 및 소프트웨어는 42가지 Bacillus 종만을 구분할 수 있는 프로그램으로 구성되었기 때문에 Bacillus가 아닌 속이나, Bacillus 아종의 경우 동정하기 어렵다.
- sphaericus/B. fusiformis로 동정된 (J)의 경우 표준균주들인 B. sphaericus L14010와 B. fusiformis L14013의 16S rRNA 유전자에 대한 염기서열 상동성은 각각 88% 및 87%, 생화학적으로 B. coagulans로 동정된 (K)의 경우 표준균주 B. coagulans IAM12463과의 상동성은 88%, (L)의 경우 표준균주 B. licheniformis DSM13과는 97% 상동성을 보였다. 일반적으로 같은 종의 기준을 99% 이상의 서열 일치도로 볼 때 적어도 (J), (K)의 생화학적 동정결과는 정확하지 않았으므로 16S rRNA 유전자 염기서열 결과를 이용하여 (J)는 Brevibacillus spp.
- cereus 계수 방법에서 집락 형태를 구체적으로 모호하지 않게 정의해둘 필요가 있다. 또한 동정상 B. cereus와 구분되는 B. anthracis, B. mycoides, B. thurigiensis, B. weihenstephanensis, B. polymixa들과 같은 다른 B. cereus group 역시 cereus형 독소를 분비할 수있음을 고려하여, 앞으로 식품공전에 단순히 균수 상한선을 명시하는 것 보다 식품 내 B. cereus 독소들의 최대 허용양을 기준으로 하여 규제하는 쪽이 합리적이라고 생각한다. 이를 위해, 각 독소의 인체 내 독성 허용량 설정과 함께 독소들을 정성 및 정량적으로 간단하게 분석할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.
- anthracis는 유전적으로 매우 가까운 근연종이기 때문에 (B), (E), (F)의 경우 16S rRNA 유전자 염기 서열 결과만으로는 동정하기 어려워 생화학적 대사 특성을 이용한 동정 결과를 참고하였다. 생화학적 동정 결과 세 집락 (B), (E), (F)는 B. anthracis가 아닌 B. cereus (88%, 91%, 92% probability)로 분류되었으므로 이들 균들은 B. cereus로 동정하였다. 집락 (A) 와 (H)는 일반 B.
- 생화학적 동정을 위해 VITEK 2 System (bioMérieux Vitek Inc., USA)의 매뉴얼에 따라 각 균 배양액이 46종 건조 배지 및 생화학 반응물로 구성된 BCL ID card (bioMérieux Vitek)에 주입되고, 15분 간격으로 결과들이 VITEK 2 Compact software (bioMérieux Vitek)에 통합적으로 저장 분석하면서 14시간 후 동정이 완료되었다.
- 1H~L)들이 관찰되었다. 이들 중 장류에서 자주 발견되는 (H)는 집락 주위에 환을 만들지 않아 계수 매뉴얼상 B. cereus로 판단할 수 없는 직경 약 5 mm의 무광택 원형 또는 타원형 분홍색 집락이었고, (I)는 (A)~(G)에서 보인 전형적인 직경 12~15 mm의 환들과 달리 6.5 mm 크기의 작은 반투명 외환과 3.5 mm의 옅은 분홍색 내환을 가져 매뉴얼에 따른 형태 분류 상 B. cereus로 분류하기가 모호하였다. 나머지 3종(Fig.
- cytotoxis로 동정하였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 집락(A)와 (H)는 B. cereus의 한 아종이므로 B. cereus 집락 계수에 포함시키는 것이 당연하다. MYP 계수 매뉴얼상 형태적으로 B.
- 장류에서 분리한 약 1,500개의 집락들을 대상으로 형태에 따라 분류한 결과 12종으로 나눌 수 있었으며, 각 집락의 균은 그람 염색 시 현미경하에서 양성을 나타냈다. 먼저 집락 주위에 11~16 mm의 불투명한 분홍색 환을 가지기 때문에 MYP 계수 매뉴얼(Difco)에 따라 B.
- 7%의 상동성(각각 1467/1472 및 1465/1470 서열 일치)을 나타냈다. 직경 1 mm 크기의 흰색 집락 (K)는 Enterococcus faecium DSM20477과 99.1% (1478/ 1491)의 상동성을, 직경 1.5 mm의 투명한 노랑색 집락 (L)은 B. subtilis DSM10과 99.7% (1483/1488)의 상동성을 나타냈다. 16S rRNA 유전자 염기 서열에 의한 집락 (J), (K), (L)의 동정은 생화학적 동정결과와 달랐다.
- 집락 (A)는 나머지 균들과 형태적으로는 유사했지만 미확인종으로 나왔는데, 전체 46종류 반응 중 (B)~(G)균들과 공통적으로 달랐던 반응은 α-glucosidase (-), 탄소원으로 D-trehalose 및 D-ribose (-), 6.5% NaCl에서 성장 (-)였다.
- 집락 주위 환이 없어 형태적으로 달랐던 (H)는 생화학 반응들 중 β-N-acetyl-L-glucosaminidase (-), α-glucosidase (-), D-trehalose 이용성 (-)에서 (B)~(G)들과 공통적으로 달라 미확인종으로 분류 되었고, 역시 미확인종인 (A)와는 β-N-Acetyl-L-glucosaminidase (-), Ala-Phe-Pro arylamidase (+), α-glucosidase (-), D-ribose 이용성 (+), 6.5% NaCl 성장 (+)인 점에서 생화학적 반응에 차이가 있었다.
- cytotoxis로동정된 (A)와 (H) 집락은 nheB 유전자만 가지고 있다는 점이 달랐다. 최근 장류에서 Bacillus선택 배지에서 자란 집락 152개를 대상으로 독소 유전자 유무를 PCR로 확인한 결과 모두 한 가지 이상의 독소 유전자를 함유했고 특히 설사 독소 유전자인 nheABC 의 경우 151개의 집락에서 모두 발견되었다(결과 미제시). 그러나 집락 형태별로 특정한 독소 유전자 패턴은 보이지 않았고 각 균주 별로 생산하는 독소 종류는 다르게 나타났다.
- 특징적으로 9종 모두 3’쪽의 최말단 위치(1,450~1,485 bp)에서 1~5개의 염기서열에 차이가 있었다.
- 5% NaCl 성장 (+)인 점에서 생화학적 반응에 차이가 있었다. 한편 집락 주위에 이중환 형성과 작은 크기 때문에 형태상 B. cereus로 분류하기 모호했던 집락 (I)는 생화학 동정에서 93%의 높은 확률로 B. cereus로 동정되었다. 나머지 세 종류중 2~4 mm의 타원형 붉은색 집락 (J)는 B.
- 형태별로 분류한 12종의 16S rRNA 유전자 염기서열은 27~1492 bp 영역에서 PCR 증폭 및 서열 분석을 통하여 동정에 중요한 50~900 bp 영역서열을 포함, 약 1,450~1,490 bp들을 판독하였다. RDP 표준균주 및 게놈 프로젝트 사용 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열과 비교한 계통분석도(Fig.
후속연구
- 이에 반해 항생제 methoprim이 더 첨가된 CPMA 배지에서 집락은 주로 3~10 mm 직경의 초록색 집락 주위로 작은 흰색 환을 형성하므로 MYP 배지보다 계수하기가 더 분명하다는 장점이 있다. 따라서 MYP 배지에 의한 B. cereus 계수의 정확성을 위해 CPMA 배지에서 배양을 동시에 수행하는 것도 바람직할 것이다. 그러나, 장류의 경우 CPMA 배지에서도주 집락 형태 이외에 4종의 다른 형태(0.
- cereus 독소들의 최대 허용양을 기준으로 하여 규제하는 쪽이 합리적이라고 생각한다. 이를 위해, 각 독소의 인체 내 독성 허용량 설정과 함께 독소들을 정성 및 정량적으로 간단하게 분석할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.
- cereus 여부를 확인할 수 있는 동정 프로토콜이 확립되어야 하는데 아직까지 장류에서 보고된 바가 없어 계수 정확성에 의문을 가질 수 밖에 없다. 이와 함께 식품 위생에서 실질적인 문제는 B. cereus의 단순 계수가 아닌 B. cereus 독소 생산균 수에 있고 B. cereus에서 발견되는 설사 및 구토 독소 유전자들이 B. mycoides, B. anthracis, B. thuringiensis, B. weihenstephanensis, B. polymixa 등에서도 발견되기 때문에 선택 배지에서 자란 집락들이 이들 독소를 함유하고 있는지 확인할 필요가 있다. 이 연구는 MYP 선택배지 상에서 B.
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