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문제 정의
- 따라서 본 연구는 기능성식품의 소재로 사용되는 상황버섯(Phellinus linteus)을 초미세 가공하여 마우스에게 경구투 여한 후 기존의 분쇄법으로 생산된 상황버섯 미세분말과 비교함으로써 혈액학, 생화학, 조직학적 관점에서 입자크기의 감소에 따른 생체 안전성을 확인하고자 하였다.
- 따라서 본 연구는 초미세가공된 상황버섯 사료를 동물에게 식이하고 기존의 미세분말사료와 정상사료를 식이한 동물과 비교함으로써 입자의 감소에 따른 식이안전성을 조사 하였다. 실험식이 식이 후 사료섭취량과 체중 및 각 기관의 무게는 그룹 간 유의한 차이를 보이지 않았다.
제안 방법
- 4 μm 두께로 파리핀 절편을 만들어 통상적인 파라핀용 광학현미경의 시료처리법에 따라 처리한 후 hematoxyline-eosin으로 이중염 색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 사료 섭취량은 6일 동안 매일 같은 시간에 측정하였고, 마우스의 체중은 실험 첫날과 6일 동안 실험식이를 공급한 후 7일째에 각각 한 번씩 측정하여 평균값을 계산하였다. 각 기관의 무게는 실험동물을 경추도살 한 후 심장, 간, 위, 신장, 췌장, 소장, 대장을 적출하여 측정하였고, 실험군별 평균값으로 나타내었다.
- 로터의 속도는 10,500 rpm이었고, grinding media의 지름은 210 mm였다. 분쇄된 각 상황버섯 분말의 입자 분포는 한국화학시험연구소(서울, 한국)에 의뢰하여 분석하였다.
- 사료 섭취량은 6일 동안 매일 같은 시간에 측정하였고, 마우스의 체중은 실험 첫날과 6일 동안 실험식이를 공급한 후 7일째에 각각 한 번씩 측정하여 평균값을 계산하였다. 각 기관의 무게는 실험동물을 경추도살 한 후 심장, 간, 위, 신장, 췌장, 소장, 대장을 적출하여 측정하였고, 실험군별 평균값으로 나타내었다.
- 상황버섯 재료는 (주)이제마로부터 구입하여 사용하였다. 상황버섯 미세분말(FPL)은 압착, 충격, 전단력을 원리로 하는 일반분쇄기(Food Mill KFM-10, Koreamedi Co. Ltd., Daegu, Korea)를 이용하여 1,000 rpm으로 분쇄하였다. 초미세 분말(SPL)은 건조식물 재료의 분쇄에 적합하도록 제작된 터보라이저 HKP-05 (Korea Energy Technology Co.
- , USA)를 이용하여 total WBC, 호중구 (neutrophil), 림프구 (lymphocyte), 단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil), 호염 기구(basophil)의 수를 측정하였다. 생화학적 검사를 위해 혈청은 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 취하 였고, 혈청자동분석기(Fuji Dry/Chem 3500, Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan)를 이용하여 Na, K, Cl, Ca, inorganic phosphate, aspartate amino transferase (AST), alanine amino transferase (ALT), total cholesterol, albumin, creatinine, blood urea nitrogen (BUN)을 측정하였다.
- 모든 실험 동물들은 23±2 C와 12시간 명암주기 조건 하에서 일주일 동안 순화시켰다. 실험군은 생쥐용 고형사료(Mouse E.P., Superfeed Co. Ltd., Korea)를 먹인 정상군(Normal), 일반분 쇄된 상황버섯 사료를 먹인 실험군(FPL), 초미분화 상황버섯 사료를 먹인 실험군(SPL) 총 3군으로 나누어 각각 8마리씩 배정하였다. 물은 역삼투압 방식의 정수물을 사용하였고, 먹이와 물은 6일 동안 충분히 공급하였다.
- 적출된 간, 소장 및 대장을 적출하여 10% 포르말린에 24 시간 고정하였다. 에탄올 농도 순으로 탈수한 후 xylene으로 투명과정을 거치고 파라핀으로 포매하였다.
- Ethyl ether로 마우스를 마취시킨 후 안와혈관총(orbital plexus)에서 혈액샘플을 채취하였다. 혈액학적 검사는 혈액 자동분석기 (HEMAVET HV950 FS, Drew Scientific Inc., USA)를 이용하여 total WBC, 호중구 (neutrophil), 림프구 (lymphocyte), 단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil), 호염 기구(basophil)의 수를 측정하였다. 생화학적 검사를 위해 혈청은 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 취하 였고, 혈청자동분석기(Fuji Dry/Chem 3500, Fuji Photo Film Co.
대상 데이터
- 5주령 된 평균체중 25±2 g인 ICR 마우스 수컷을 중앙실 험동물 (주)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- Ethyl ether로 마우스를 마취시킨 후 안와혈관총(orbital plexus)에서 혈액샘플을 채취하였다. 혈액학적 검사는 혈액 자동분석기 (HEMAVET HV950 FS, Drew Scientific Inc.
- , Korea)를 먹인 정상군(Normal), 일반분 쇄된 상황버섯 사료를 먹인 실험군(FPL), 초미분화 상황버섯 사료를 먹인 실험군(SPL) 총 3군으로 나누어 각각 8마리씩 배정하였다. 물은 역삼투압 방식의 정수물을 사용하였고, 먹이와 물은 6일 동안 충분히 공급하였다.
- 상황버섯 재료는 (주)이제마로부터 구입하여 사용하였다. 상황버섯 미세분말(FPL)은 압착, 충격, 전단력을 원리로 하는 일반분쇄기(Food Mill KFM-10, Koreamedi Co.
- 실험용 고형사료는 일반분쇄된 미세상황버섯 분말과 나노밀 가공된 초미세상황버섯 분말을 일반사료 분말의 10% 비율로 혼합, 반죽하여 일반 고형사료와 비슷한 형태로 만든 후 50℃에서 건조시켰다.
- , Daegu, Korea)를 이용하여 1,000 rpm으로 분쇄하였다. 초미세 분말(SPL)은 건조식물 재료의 분쇄에 적합하도록 제작된 터보라이저 HKP-05 (Korea Energy Technology Co., Ltd., Chuncheon, Korea)를 이용하여 분쇄하였으며 모든 분쇄과 정은 냉각기(냉매: R-22)가 장착된 밀폐식 분쇄기 내에서 이루어졌다. 로터의 속도는 10,500 rpm이었고, grinding media의 지름은 210 mm였다.
데이터처리
- 통계학적 분석은 Prism 4.0 (Graphicpad Software Inc., USA) 통계프로그램을 이용하여 ANOVA (non-parametric) test를실시하였으며, 실험결과는 실험군 별로 평균±표준편차 (S.D)로 제시하였다.
- 통계학적 유의성은 P ⁄ 0.05일 때 유의한 것으로 판단하였고, 각 실험군 간의 평균값의 차이에 대한 유의성은 Dunn’s multiple comparison test를 이용하여 평가하였다.
성능/효과
- 10% 상황버섯 사료를 식이한 본 실험의 결과에서도 AST (GOT)의 유의성은 발견되지 않았으나 기존의 방식으로 분쇄된 FPL군의 경우 ALT (GPT)가 유의하게 증가한 것으로 나타났다(P⁄0.001).
- 반면 SPL군은 AST와 ALT 모두 정상군에 비해 증가하였지만 그룹 간 유의성은 발견되지 않았다. 또한 BUN의 검사결과는 FPL군과 SPL군 모두 유의하게 낮은 수치를 보여주었지만 정상범위 내에 포함되 었다. BUN은 아미노산의 탈 아미노반응으로 생성된 암모 니아로 주로 간의 요소회로를 거쳐 생성되며, 급만성 간염 이나 간암 또는 심한 탈수의 경우 약간 감소할 수 있다.
- 9 g)보다 약간 낮게 측정되었지만 그룹 간 유의성은 관찰되지 않았다. 또한 실험 종료 후 각 장기를 적출하여 무게를 측정한 결과에서도 유의한 차이는 발견되지 않았다(Table 2).
- 모든 조직에서 염증이나 괴사와 같은 병리학적 소견이 관찰되지 않았고, 각 조직의 핵과 세포질을 비롯하여 장관의 점막층이나 신사구체 등의 조직형태학적 변화는 발견되지 않았다. 그러나 다른 연구자에 의하면, starch granule, cellulose particle, charcoal, silicate crystal, latex particle 등과 같은 마이크로미터 수준의 어떤 입자(macrocorpuscular particles)들은 소화기의 점막 상피층의 세포 사이를 통과하여(persoption) 림프관이나 장관정맥으로 이동한 후 온몸 순환을 통해 신장, 비장, 골수, 간, 심장, 폐, 태반 등의 이차 기관(secondary organ)으로 전달되며, 각 장기에 일정기간 머물다가 제거되는 것으로 보고되고 있다(Volkheimer, 1974; Florence, 1995).
- 백혈구의 종류별 수와 혈청을 이용한 전해질의 수치는 통계학적 차이를 나타내지 않았고, 생화학적 검사 항목에서 간기능의 지표 중 ALT는 SPL군은 FPL군이나 정상군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았으나 FPL군은 정상군과 비교하여 유의하게 높은 수치를 나타내었다. 다른 연구 자에 의하면 발아현미에서 자란 상황버섯의 추출물(Jeon et al.
- 상황버섯을 나노밀 가공과 기존의 분쇄 방식으로 분말화한 후 입도분석 한 결과에 의하면 상황버섯 초미세분말 (SPL)과 미세분말(FPL) 입자의 평균지름은 각각 11.8 μm와 216.1 μm였고, 부피분포가 50%일 때의 입자 지름(d (0.5)) 은 각각 5.5 μm와 147.9 μm였다(Fig. 1, Table 1).
- 상황버섯을 동물에게 6일 동안 식이한 후 간, 신장, 비장, 심장, 소장 및 대장을 적출하여 조직학적 검사를 한 결과, 모든 장기들은 비정상적인 소견을 나타내지 않았다. 핵과 세포질을 포함한 조직의 형태학적 변화가 없었고, 염증, 괴사 및 섬유화와 같은 병리학적 변화도 발견되지 않았다(Fig.
- 따라서 본 연구는 초미세가공된 상황버섯 사료를 동물에게 식이하고 기존의 미세분말사료와 정상사료를 식이한 동물과 비교함으로써 입자의 감소에 따른 식이안전성을 조사 하였다. 실험식이 식이 후 사료섭취량과 체중 및 각 기관의 무게는 그룹 간 유의한 차이를 보이지 않았다. 조직학적인 검사 결과, 간, 비장, 신장, 심장, 소장, 대장은 FPL군과 SPL 군 모두에서 정상군과 비교하여 차이를 나타내지 않았다.
- 기존분쇄방식의 상황버섯 미세분말과 나노밀가공에 의한 초미세분말을 생쥐에게 일주일간 식이하고 사염화탄소에 의해 간독성을 유발시킨 후 관찰한 우리의 선행연구 결과에 의하면 상황버섯 초미세분말군은 일반분말군에 비해 뛰어난 간보호효과와 항산화효과를 나타내었다. 이 결과는 나노밀 가공에 의한 입자의 감소가 상황버섯의 생물학적 활성을 향상시킨다는 것을 의미하며 또한 초미세분말화는 기능성 건강식품의 가공법으로서 유용 하게 적용될 수 있다는 것을 말해준다. 그러나 초미세분말 가공에 따른 건강상의 유익에도 불구하고 식품소재 입자의 감소에 따른 인체 유해성은 아직 확인된 바가 없다.
- 실험식이 식이 후 사료섭취량과 체중 및 각 기관의 무게는 그룹 간 유의한 차이를 보이지 않았다. 조직학적인 검사 결과, 간, 비장, 신장, 심장, 소장, 대장은 FPL군과 SPL 군 모두에서 정상군과 비교하여 차이를 나타내지 않았다.
- 상황버섯을 동물에게 6일 동안 식이한 후 간, 신장, 비장, 심장, 소장 및 대장을 적출하여 조직학적 검사를 한 결과, 모든 장기들은 비정상적인 소견을 나타내지 않았다. 핵과 세포질을 포함한 조직의 형태학적 변화가 없었고, 염증, 괴사 및 섬유화와 같은 병리학적 변화도 발견되지 않았다(Fig. 3).
- 혈액학적 검사 결과 전체 백혈구수, 단핵구, 림프구, 중성구, 호산구, 호중구, 호염기구의 수는 모두 그룹 간 통계학적 차이를 나타내지 않았다(Fig. 2).
- 혈청을 이용한 생화학적 검사에서, FPL군의 ALT는 대조군(N) 비해 유의하게 높은 수치를 보여주었으나(P⁄0.001) SPL군은 FPL군이나 N군과 비교하여 통계학적 차이가 없었다.
후속연구
- 아직까지 나노식품의 상용화는 초기단계에 머물러 있지만 상품의 개발과 소비가 대중화되기 전에 식품에 대한 안전성은 우선적으로 검증되어야 한다. 그런 의미에서 본 연구는 나노분쇄 가공법을 적용한 식품재료의 안전성을 평가할 때 기초적인 자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 나노식품 시장의 확대가 예상되고 있는 현 시점에서 향후 개발되는 나노식품의 안전성 평가 가이드라인이 구축될 필요가 있으며, 나노물질에 대한 올바른 정보를 소비자들에게 전달하고 정부차원에서 법적인 규제 장치가 마련될 때 나노식품 산업은 더욱 발전할 수 있을 것으로 판단된다.
- 그런 의미에서 본 연구는 나노분쇄 가공법을 적용한 식품재료의 안전성을 평가할 때 기초적인 자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 나노식품 시장의 확대가 예상되고 있는 현 시점에서 향후 개발되는 나노식품의 안전성 평가 가이드라인이 구축될 필요가 있으며, 나노물질에 대한 올바른 정보를 소비자들에게 전달하고 정부차원에서 법적인 규제 장치가 마련될 때 나노식품 산업은 더욱 발전할 수 있을 것으로 판단된다.
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