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문제 정의
- 따라서 본 연구는 MS marker를 이용한 돼지의 개체식별 및 브랜드육 식별 위해 다형성지수가 높은 MS marker를 선발하고 이에 특이적인 primer를 이용하여 multiplexPCR set를 확립하여 과학적인 원산지 추적 시스템을 구축하기 위해 실시하였다.
- 본 연구는 돼지 이력추적제 및 원산지 추적의 DNA 검사에 활용 가능한 MS marker 분석과 선발을 위하여 실시하였다.
제안 방법
- Multiplex PCR은 template DNA 50 ng/㎕, primer Mix 8.25㎕, Hot-start Taq DNA polymerase 0.4㎕ (Bioneer, Korea), 10 × buffer 1.5㎕, 0.25 mM dNTP 1.2㎕ MgCl 2 1.1㎕ 그리고 DMSO 0.25㎕의 조성에 증류수를 첨가하여 최종 부피를 15㎕로 반응하였으며, PCR 조건은 95℃에서 15분간 denaturation을 실시한 후 94℃에서 60초, 55℃에서 75초, 72℃에서 60초를 1 cycle로 하여 5회, 94℃에서 60초, 54℃에서 75초, 72℃에서 60초를 1 cycle로 하여 10회그리고 94℃에서 60초, 55℃에서 75초, 72℃에서 60초를 1 cycle로 하여 25회 반복하는 Touch Down PCR 방법을 사용하였다.
- 으로 사용하는 330두의 Landrace × Large White의혈액을 채취하고, 최종 선발된 MS marker의 상용축군에 대한 활용성 검증을 위해 (Landrace × Large White) × Duroc의 3원 교잡종 400두의 혈액을 채취해 공시재료로 사용하였다. 돼지의 혈액으로부터 게놈 DNA 추출 키트(Promega, USA)를 이용하여 게놈 DNA의 분리하였다.
- ISAG 및 Roslin 연구소 등에서 돼지의 다형성 분석에 사용되도록 권장된 MS marker 중 염색체 분포 및 PCR product size 등을 고려하여, 17 종을 Table 1에서 보는 바와 같이 선발하였다. PCR용 MS priemr와 PCR 산물의 크기 등은 NCBI의 Mapviewer(http://www.
- 09×10-6으로 나타나 13종의 MS marker만을 활용하여도 동일개체가 출현할 확률은 없는 것으로 나타났다. 또한 13종의 MS marker와 성감별이 가능한 2쌍의 primer를 추가하여 한번에 PCR이 가능하도록 Multiplexing PCR 시스템을 확립함으로서 분석의 효율성을 극대화 시켰다(Fig 2.).
- EU에서 추진한 EID+DNA Tracing project의 4차 보고서 (http://quiro.uab.es/tracing/Reports/4th%20Report%20Extension %20Period/4th%20Report%20Extension%20Period.pdf)에 의하면, 12 종의 MS marker를 자체 선정하여 복강 주입용 전자 chip을 활용하는 개체추적 방식의 정확도를 검증하였다. 이 들이 선발한 12 MS marker 중 10개의 MS marker가 본 연구에서 선정한 것과 일치 하였다.
- 돼지 원산지 추적 및 브랜드육 식별을 위한 MS marker set를 확립하기 위해 EU의 EID+DNA DNA Tracing 연구 project, 국제동물유전학회 및 Roslin 연구소 등에서 제안한 돼지의 다형성 분석에 사용되는 MS marker 중 17종을 선발하여 다형성지수, F-통계량, 동일개체 출현확률 및 친자 감별확률 등을 MSA, CERVUS, FSTAT, GENEPOP 및 API-CALC 프로그램 등을 연계적으로 활용하여 추정하였다. 다형성지수 추정치를 1차 선발요인으로 하고, 각 MS marker의 PCR 결과물의 크기 및 분석 비용의 경제성을 추가로 감안하여 최종 13종의 MS marker (SW936, SW951, SW787, S00090, S0026, SW122, SW857, S0005, SW72, S0155, S0225, SW24 and SW632)와 성감별을 위한 2개의 성감별 primer로 조합된 하나의 Multiplexing PCR 시스템을 확립하였다.
- 돼지 원산지 추적 및 브랜드육 식별을 위한 MS marker set를 확립하기 위해 EU의 EID+DNA DNA Tracing 연구 project, 국제동물유전학회 및 Roslin 연구소 등에서 제안한 돼지의 다형성 분석에 사용되는 MS marker 중 17종을 선발하여 다형성지수, F-통계량, 동일개체 출현확률 및 친자 감별확률 등을 MSA, CERVUS, FSTAT, GENEPOP 및 API-CALC 프로그램 등을 연계적으로 활용하여 추정하였다. 다형성지수 추정치를 1차 선발요인으로 하고, 각 MS marker의 PCR 결과물의 크기 및 분석 비용의 경제성을 추가로 감안하여 최종 13종의 MS marker (SW936, SW951, SW787, S00090, S0026, SW122, SW857, S0005, SW72, S0155, S0225, SW24 and SW632)와 성감별을 위한 2개의 성감별 primer로 조합된 하나의 Multiplexing PCR 시스템을 확립하였다. 이를 이용해 돼지 사육환경을 무작위 교배집단 (PI), 반형매 교배집단 그리고 전형매 교배집단으로 가정하여 동일개체 출현확률을 분석한 결과 2.
대상 데이터
- MS marker 선발을 위해 경상남도의 K종돈장의 계열농가에서 F1으로 사용하는 330두의 Landrace × Large White의혈액을 채취하고, 최종 선발된 MS marker의 상용축군에 대한 활용성 검증을 위해 (Landrace × Large White) × Duroc의 3원 교잡종 400두의 혈액을 채취해 공시재료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 MS marker는 EID + DNA Tracing project, 국제동물유전학회와 Roslin 연구소에서 제안한 돼지의 다형성 분석용 MS marker들을 기초로 하여 선정하였다.
- ISAG 및 Roslin 연구소 등에서 돼지의 다형성 분석에 사용되도록 권장된 MS marker 중 염색체 분포 및 PCR product size 등을 고려하여, 17 종을 Table 1에서 보는 바와 같이 선발하였다. PCR용 MS priemr와 PCR 산물의 크기 등은 NCBI의 Mapviewer(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ mapview/mapviewer)에 보고되어 있는 정보를 이용하였다.
- Chromosome locations were from the Bovine mapviewer of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/mapviewer).
- 또한 17개의 MS를 친자감정에 이용할 경우에도 부, 모의 교배기록 및 유전자형이 파악된 경우에는 100% 친자감정이 가능할 것으로 사료된다. 하지만 돼지의 이력추적제에 적용할 MS marker는 충분하게 유의적인 개체의 판별능력과 genotyping의 용이성 그리고 genotyping 단가를 고려하여야 최종 마커의 조합 및 개수를 선정해야 된다고 사료되어, 17개의 MS 마커 중 He 값의 추정치와 PCR product size를 근거로 SW936, SW951, SW787, S00090, S0026, SW122, SW857, S0005, SW72, S0155, S0255, SW24 그리고 SW632를 최종 13개의 MS marker로 선발하였다. 선발된 13 MS marker 중 SW936, S0225 그리고 SW951는 17개의 MS marker 중에서 He 값이 높은 SW240, SW911 그리고 S0301이 더 높은 He 값을 가진 마커 SW24, SW787 그리고 S00090과 PCR product size가 겹치는 관계로 SW936, S0225 그리고 SW951로 교체하여 최종 13종의 MS marker set를 확립하였으며, 이들의 PI 값은 1.
데이터처리
- 그 후 65℃에서 30분 extension 후 4℃에서 종료하였다. PCR 산물은 ABI-3130xl 자동염기서열 분석장치 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동하고, GeneMapper version 4.0 (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 크기와 표식자의 종류별로 분류한 후 Microsoft Excel (Microsoft, USA)을 이용하여 자료를 취합하였다.
- 0 (Marshall 등, 1998)을 이용하였다. 또한 추정된 F-통계량에 근거하여 무작위 교배 집단, 반형매 교배집단 그리고 전형매 교배집단에서의 동일개체 출현가능확률은 API-CALC version 1.0 (Ayres와 Overall, 2004)을 사용하여 계산하였으며, 실험자료 분석과정은 Fig. 1에 도식화하였다.
- FIT는 전체집단에 대한 개체들의 모든 근친도 값을 나타내는 지수로 이들을 통하여 집단 간 유전변이와 집단 내 개체들의 근친정도를 파악하는데 이용할 수 있다. 추정된 F-통계량을 이용하여 무작위 교배집단, 반형매 교배집단 그리고 전형매 교배집단으로 가정하여 MS 유전자형의 동일한 개체 출현확률 (probability of identity; PI, probability of identity from half sibs; PI half-sibs , and probability of identity from sibs; PIsibs)과 친자감정확률 (probability of parent exclusion when both parents are unconfirmed; PEpu와 probability of paternity exclusion; PE)을 API-CALC version 1.0과 Cervus version 2.0을 이용하여 추정하였으며, 그 결과는 Table 2에 나타내었다. 전체 17개의 MS를 사용할 경우 무작위 교배집단 (PI)에서는 1.
이론/모형
- MS marker들의 대립유전자 분포, Nei (1972)의 방법을 이용한 D A 유전적 거리지수 matrix의 추정과 분석 프로그램 간 입력자료 형태의 변환은 Microsatellite Analyzer (MSA) version 3.15 (Dieringer와 Schltterer, 2002)를 이용하였다. Weir와 Hill (2002) 추정법에 의한 F-통계량 (Fst, Fit, 및 Fis)은 FSTAT version 2.
- 15 (Dieringer와 Schltterer, 2002)를 이용하였다. Weir와 Hill (2002) 추정법에 의한 F-통계량 (Fst, Fit, 및 Fis)은 FSTAT version 2.9.3 (Goudet, 2001)과 GENEPOP version 3.4 (Raymond와 Rousset, 1995)를 사용하여 계산하다. Marker의 다형성지수인 heterzygosity (He)와 polymorphic information content (PIC) 그리고 exclusion probability (PE)는 Cervus version 2.
- 4 (Raymond와 Rousset, 1995)를 사용하여 계산하다. Marker의 다형성지수인 heterzygosity (He)와 polymorphic information content (PIC) 그리고 exclusion probability (PE)는 Cervus version 2.0 (Marshall 등, 1998)을 이용하였다. 또한 추정된 F-통계량에 근거하여 무작위 교배 집단, 반형매 교배집단 그리고 전형매 교배집단에서의 동일개체 출현가능확률은 API-CALC version 1.
성능/효과
- 0 프로그램을 이용하여 분석한 MS marker별 allele의 분포와 He 및 PIC 추정치는 Table 1에 나타내었다. 이 중 가장 많은 allele의 개수는 S0005에서 나타난 17개였으며, 가장 높은 He와 PIC 값을 갖는 MS marker 역시 S0005로 He 값은 0.869이며, PIC 값은 0.908로 나타났다.
- 전체 17개의 MS를 사용할 경우 무작위 교배집단 (PI)에서는 1.09×10-17로, 반형매 교배 집단 (PI half-sibs)은 1.09×10-13으로 그리고 전형매 교배집단 (PIsibs)은 1.09×10-7 추정되었다.
- 선발된 13 MS marker 중 SW936, S0225 그리고 SW951는 17개의 MS marker 중에서 He 값이 높은 SW240, SW911 그리고 S0301이 더 높은 He 값을 가진 마커 SW24, SW787 그리고 S00090과 PCR product size가 겹치는 관계로 SW936, S0225 그리고 SW951로 교체하여 최종 13종의 MS marker set를 확립하였으며, 이들의 PI 값은 1.09×10-13, PI half-sibs값은 1.09×10-10 그리고 PIsibs값은 1.09×10-6으로 나타나 13종의 MS marker만을 활용하여도 동일개체가 출현할 확률은 없는 것으로 나타났다.
- 이러한 추정치의 의미는 국내의 돼지 전체사두수가 2007년 기준으로 약 9,659,000두 임을 고려해 보더라도 동일개체가 출현할 확률이 없는 것으로 보아도 무방할 것으로 사료된다. 또한 17개의 MS를 친자감정에 이용할 경우에도 부, 모의 교배기록 및 유전자형이 파악된 경우에는 100% 친자감정이 가능할 것으로 사료된다. 하지만 돼지의 이력추적제에 적용할 MS marker는 충분하게 유의적인 개체의 판별능력과 genotyping의 용이성 그리고 genotyping 단가를 고려하여야 최종 마커의 조합 및 개수를 선정해야 된다고 사료되어, 17개의 MS 마커 중 He 값의 추정치와 PCR product size를 근거로 SW936, SW951, SW787, S00090, S0026, SW122, SW857, S0005, SW72, S0155, S0255, SW24 그리고 SW632를 최종 13개의 MS marker로 선발하였다.
- 최종 선발된 13종의 MS marker의 국내 양돈 산업에 적용 가능성 검증을 위해 Landrace, Large White 그리고 Duroc을 이용해 3원 교잡되어 생산된 돼지 400두를 대상으로 대립유전자형을 분석해 무작위 교배집단 (PI), 반형매 교배집단 (PI half-sibs ), 전형매 교배집단 (PIsibs)으로 가정하여 분석한 결과 2.47×10-18, 6.39×10-13 그리고 1.08×10-8로 추정되었고, 친자확인율에서도 100%에 가까운 확률 값을 추정할 수 있었다 (Table 2).
- 이를 이용해 돼지 사육환경을 무작위 교배집단 (PI), 반형매 교배집단 그리고 전형매 교배집단으로 가정하여 동일개체 출현확률을 분석한 결과 2.47×10-18, 6.39×10-13 그리고 1.08×10-8로 나타나 브랜드 식별 및 원산지 추적에 적합할 것으로 사료된다.
- 50×10-19로 추정하여, 본 연구의 결과와 유사한 무작위 교배 집단에서의 동일개체 출현 확률 값을 보고하였다. 이들이 사용한 13개의 MS marker 중 S0005, S0225, S0226, SW24, SW72 그리고 SW122 6개의 MS marker가 본 연구에서 최종 선발된 것과 일치하였다. 즉, EU와 인도에서 사용한 MS marker들은 본 연구에서 선발한 것과 약 75%와 50%가 일치하여 본 연구에서 선발한 13개의 MS marker가 충분히 범용 적으로 활용될수 있음을 간접적으로 입증해 주는 것으로 사료된다.
- 이들이 사용한 13개의 MS marker 중 S0005, S0225, S0226, SW24, SW72 그리고 SW122 6개의 MS marker가 본 연구에서 최종 선발된 것과 일치하였다. 즉, EU와 인도에서 사용한 MS marker들은 본 연구에서 선발한 것과 약 75%와 50%가 일치하여 본 연구에서 선발한 13개의 MS marker가 충분히 범용 적으로 활용될수 있음을 간접적으로 입증해 주는 것으로 사료된다.
- 이는 선발된 13종의 MS marker를 활용하더라도 국내의 상업돈군으로 활용되는 3원 교잡종에서도 충분한 개체식별 및 친자 감별이 가능하며, 이를 이용해 브랜드 식별 및 원산지 추정에 활용 가능하다고 사료되어 진다. 따라서 돼지의 원산지 추적 및 브랜드육 식별을 위한 친자감별에는 분석비용 및 실험의 효율성 등을 감안하여 13종의 MS 마커를 활용하여도 충분히 분석이 가능하다고 사료되어 진다.
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