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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 비위생적인 식용얼음의 섭취가 식중독의 원인뿐만 아니라 수인성 질병의 원인이 될 수 있으므로 아직 보고된 바 없는 대구시 북구지역의 카페, 페스트푸드점 등에서 사용하는 식용 얼음류를 검체로 이용하여 일반세균 분포와 병원성 세균을 동정하고자 한다.
제안 방법
- MSA에서 mannitol을 분해한 균들은 API Staph kit (API system: bioMérieux Vitek, Inc., Hazelwood, USA)로 동정한 후, API web site (http://localhost/jsp/ident/index.jsp)에 연결해 동정결과를 확인하였다.
- S. aureus와의 유사한 특징을 갖는 것으로 추정되는 균들에 대해 45℃ 발육 시험, xylose (Duksan pure chemical Co., Korea), arabinose (Sigma chemical Co., USA), coagulase test, hemolysis test, DNase 생성능 test, novobiocin 항생제 감수성 검사를 추가로 실시하였다.
- 녹인 원액을 10배, 100배, 1000배 희석하여 만든 것을 일반 세균 분리를 위해 Brain Heart Infusion (BHI) agar (Becton, Dickinson and Company, USA)에 배양하였고 대장균 및 그람음성세균 분리배양을 목적으로 MacConkey agar (Becton, Dickinson and Company, USA), Salmonella-Shigella agar(Becton, Dickinson and Company, USA)에 각각 균을 접종하여 35 배양기에서 18~24시간 배양하였다. 그람양성세균의 분리를 위해 BHI agar에서 배양된 세균집락을 형태에 따라 임의로 집락을 선정하여 BHI agar에 계대 배양하였다(6, 12). 이렇게 순수 분리된 균들에 대해 그람염색을 실시한 후, 그람양성균으로 확인된 균들은 catalase, coagulase test를 실시하였고, 두 검사에 양성인 균들을 다시 mannitol salt agar (Becton, Dickinson and Company, USA)에 접종하였다.
- 그람염색 결과, 그람양성구균이 나온 5개의 검체를 대상으로 catalase 시험을 하였고, catalase 시험결과 양성인 검체를 coagulase test와 MSA (mannitol salt agar) 배지에서 mannitol 당 분해 유무를 알아보았다(Table 3). 세 가지 실험 중 모두 양성으로 나온 2개(A, L)의 검체를 생화학적 검사인 45℃ 발육능, D-xylose, L-arabinose 당 분해시험, 용혈능, Novobiocin 감수성 시험 등을 실시하였다.
- 카페 및 토스트점 등 15곳에서 채취한 식용얼음을 멸균증류수로 씻은 후 멸균한 용기에 넣어 무균상태로 실온에서 녹인다. 녹인 원액을 10배, 100배, 1000배 희석하여 만든 것을 일반 세균 분리를 위해 Brain Heart Infusion (BHI) agar (Becton, Dickinson and Company, USA)에 배양하였고 대장균 및 그람음성세균 분리배양을 목적으로 MacConkey agar (Becton, Dickinson and Company, USA), Salmonella-Shigella agar(Becton, Dickinson and Company, USA)에 각각 균을 접종하여 35 배양기에서 18~24시간 배양하였다. 그람양성세균의 분리를 위해 BHI agar에서 배양된 세균집락을 형태에 따라 임의로 집락을 선정하여 BHI agar에 계대 배양하였다(6, 12).
- 이러한 식용얼음은 대체적으로 매장에서 직접 만들어 사용하거나, 대형 제조업체로부터 만들어 놓은 얼음을 구매하여 음료수 등에 첨가하여 소비자에게 판매되고 있다. 대부분의 사람들이 섭취하고 있는 식용얼음이 얼마나 위생적으로 유통되는지를 2007년 식품 의약품 안전청에서 조사하였다. 그 결과 시중유통 식용 얼음류 191건을 수거·검사한 결과, 제주시, 충북, 충북 청원군, 대전시, 부산시, 서울시에 소재하는 식용얼음제조업체에서 기준을 초과하는 일반 세균수(기준: 100이하/ml) 및 대장균군(기준: 음성/50 ml)이 검출됨으로 부적합 판정을 받았다(6, 7).
- 그람염색 결과, 그람양성구균이 나온 5개의 검체를 대상으로 catalase 시험을 하였고, catalase 시험결과 양성인 검체를 coagulase test와 MSA (mannitol salt agar) 배지에서 mannitol 당 분해 유무를 알아보았다(Table 3). 세 가지 실험 중 모두 양성으로 나온 2개(A, L)의 검체를 생화학적 검사인 45℃ 발육능, D-xylose, L-arabinose 당 분해시험, 용혈능, Novobiocin 감수성 시험 등을 실시하였다. Table 4에서 보여지듯이 L업소는 45℃에서 발육하였으나 A업소는 45℃에서 발육하지 않았고 D-xylose, L-arabinose 당 분해시험에서는 A업소 검체에서만 양성이 되었음을 확인하였다(Table 4).
- MacConkey agar에서 배양된 균들도 각 검체마다 집락을 선정하여 그람염색 후, MacConkey agar, Salmonella-Shigella agar에 분리 배양하였다. 이렇게 배양된 균들은 API 20 E kit, API 20 NE kit로 동정한 후, API web site에 연결해 동정결과를 확인하였다.
- 그람양성세균의 분리를 위해 BHI agar에서 배양된 세균집락을 형태에 따라 임의로 집락을 선정하여 BHI agar에 계대 배양하였다(6, 12). 이렇게 순수 분리된 균들에 대해 그람염색을 실시한 후, 그람양성균으로 확인된 균들은 catalase, coagulase test를 실시하였고, 두 검사에 양성인 균들을 다시 mannitol salt agar (Becton, Dickinson and Company, USA)에 접종하였다. MSA에서 mannitol을 분해한 균들은 API Staph kit (API system: bioMérieux Vitek, Inc.
- 이러한 결과는 API Staph kit를 이용하여 재동정한 결과 두 검체에서 Staphylococcus aureus, Staphylococcus xylosus로 나타났다. 잠정적 동정은 API Staph kit을 이용하여 3회 반복하였다.
대상 데이터
- 식용얼음에서 미생물의 분포 15곳의 검체를 BHI 배지에 배양한 결과 1곳을 제외한 14곳의 검체에서 균이 증식 되었다. 14곳의 검체에서 나온 일반세균 집락수를 측정하였다. 식품위생법 시행령 식용얼음 규격의 일반세균수는 1 ml 당 100 이하를 규정으로 하고 있다.
- 2008년 7월 7일 대구시 북구지역 내 패스트푸드점, 카페 및 토스트점 총 15곳에서 검체를 채취하여 실험하였다.
- 카페 및 토스트점 등 15곳에서 채취한 식용얼음을 멸균증류수로 씻은 후 멸균한 용기에 넣어 무균상태로 실온에서 녹인다. 녹인 원액을 10배, 100배, 1000배 희석하여 만든 것을 일반 세균 분리를 위해 Brain Heart Infusion (BHI) agar (Becton, Dickinson and Company, USA)에 배양하였고 대장균 및 그람음성세균 분리배양을 목적으로 MacConkey agar (Becton, Dickinson and Company, USA), Salmonella-Shigella agar(Becton, Dickinson and Company, USA)에 각각 균을 접종하여 35 배양기에서 18~24시간 배양하였다.
이론/모형
- 이런 이유로 대구시 북구지역 뿐만 아니라 여러 지역의 식용얼음을 조사할 필요가 있을 것으로 사료된다. 그리고 본 연구에서는 세균의 동정방법으로 생화학적 방법과 간이신속동정키트(API kit)를 이용하였다. 이은숙 등은 상수계통에서 병원성균인 Aeromonas를 동정시 지방산 추출을 이용한 미생물분류동정장치(Microbial Identification System, MIDI)로 분석하였으며 분자적 typing 분석의 필요성을 언급하였다(9).
성능/효과
- 그람염색으로 분류한 집락을 표현형에 따라 동정하기 위해 API kit를 사용하였으며 먼저 그람음성간균으로 나타난 것을 API 20E kit, API 20NE kit를 이용하여 동정한 결과, Enterobacter cloacae (7곳)가 가장 많이 검출 되었고, Chryseomonas luteola, Pantoea spp., Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Providencia rettgeri 등이 검출 되었다(Table 2). API 20E kit와 API 20NE kit를 이용하여 3회 반복하고 잠정적 동정결과 90% 이상의 상동성을 나타냈다.
- 따라서 본 연구는 대구 북구지역에 패스트푸드점과 일반 카페 및 음식점 15곳에서 얼음류 검체를 채취하여 조사한 결과 식품위생법 시행령 식용얼음 규격의 일반세균수는 1 ml 당 100 이하이어야 하는데 15곳을 조사한 결과 14곳의 검체에서 이를 초과하였고 그람음성세균의 경우 Enterobacter cloacae, Chryseomonas luteola, Pantoea spp., Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Providencia rettgeri 등이 검출 되었다. 가장 많이 검출된 Enterobacter cloacae는 장내세균과로서 물, 토양 및 사람의 장관에 상재하며 유아에 요독성 요독증의 원인균이며 그 밖에 기회감염, 요로감염, 호흡기감염, 피부 상처 감염, 패혈증, 수막염 등의 원인균으로 알려져 있다.
- , Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Providencia rettgeri 등이 검출 되었다(Table 2). API 20E kit와 API 20NE kit를 이용하여 3회 반복하고 잠정적 동정결과 90% 이상의 상동성을 나타냈다.
- 이것을 기준으로 대구시 북구 인근지역 15곳을 채취한 결과 14곳의 검체에서 일반세균수를 초과하였고 1곳의 검체에서는 전혀 세균이 자라지 않았다(Table 1). BHI agar와 MacConkey agar에 배양된 집락을 그람염색하였으며 그 결과 그람음성간균이 80% 차지하였고 그람양성구균 17% 그리고 그람음성구균 3%의 분포를 나타냈다(Fig. 1).
- Table 4에서 보여지듯이 L업소는 45℃에서 발육하였으나 A업소는 45℃에서 발육하지 않았고 D-xylose, L-arabinose 당 분해시험에서는 A업소 검체에서만 양성이 되었음을 확인하였다(Table 4). Novobiocin 감수성 시험에서 A업소 검체에서는 내성을 나타내었고, L업소 검체에서는 감수성을 나타내었다(Fig. 2). 따라서 L업소에서 분리된 균은 S.
- 세 가지 실험 중 모두 양성으로 나온 2개(A, L)의 검체를 생화학적 검사인 45℃ 발육능, D-xylose, L-arabinose 당 분해시험, 용혈능, Novobiocin 감수성 시험 등을 실시하였다. Table 4에서 보여지듯이 L업소는 45℃에서 발육하였으나 A업소는 45℃에서 발육하지 않았고 D-xylose, L-arabinose 당 분해시험에서는 A업소 검체에서만 양성이 되었음을 확인하였다(Table 4). Novobiocin 감수성 시험에서 A업소 검체에서는 내성을 나타내었고, L업소 검체에서는 감수성을 나타내었다(Fig.
- 그 결과 시중유통 식용 얼음류 191건을 수거·검사한 결과, 제주시, 충북, 충북 청원군, 대전시, 부산시, 서울시에 소재하는 식용얼음제조업체에서 기준을 초과하는 일반 세균수(기준: 100이하/ml) 및 대장균군(기준: 음성/50 ml)이 검출됨으로 부적합 판정을 받았다(6, 7).
- 그람염색으로 분류한 집락을 표현형에 따라 동정하기 위해 API kit를 사용하였으며 먼저 그람음성간균으로 나타난 것을 API 20E kit, API 20NE kit를 이용하여 동정한 결과, Enterobacter cloacae (7곳)가 가장 많이 검출 되었고, Chryseomonas luteola, Pantoea spp., Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Providencia rettgeri 등이 검출 되었다(Table 2).
- 2). 따라서 L업소에서 분리된 균은 S. aureus로 동정되었고 A업소에서 검출된 균은 S. xylosus로 동정되었다(Table 4). 이러한 결과는 API Staph kit를 이용하여 재동정한 결과 두 검체에서 Staphylococcus aureus, Staphylococcus xylosus로 나타났다.
- 따라서 본 연구는 대구 북구지역에 패스트푸드점과 일반 카페 및 음식점 15곳에서 얼음류 검체를 채취하여 조사한 결과 식품위생법 시행령 식용얼음 규격의 일반세균수는 1 ml 당 100 이하이어야 하는데 15곳을 조사한 결과 14곳의 검체에서 이를 초과하였고 그람음성세균의 경우 Enterobacter cloacae, Chryseomonas luteola, Pantoea spp., Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Providencia rettgeri 등이 검출 되었다.
- 위생 상태는 제조 업소들의 부실한 관리로 인하여 지하수를 얼음 제조용 용수로 사용하면서 정제, 소독 등의 공정을 거치지 않는 경우, 비위생적인 제조시설로 인해 미생물이 교차 오염되는 것으로 조사되었다(7). 또한 녹색소비자연대에서 서울시내 지역의 대형 커피 전문점 9곳과 패스트푸드점 5곳, 모두 14곳을 선정하여 54개 지점에서 아이스 커피를 구입해 세균수와 대장균군 검사를 실시한 결과 30% (15곳)에서 기준치 이상의 세균이 조사되었으며 식용얼음 및 수질로부터 분리된 병원성세균의 종류로는 Escherichia coli, Enterobacter, Salmonella spp., Shigella, Serratia, Yersinia, Staphylococcus spp.
- 식용얼음에서 미생물의 분포 15곳의 검체를 BHI 배지에 배양한 결과 1곳을 제외한 14곳의 검체에서 균이 증식 되었다. 14곳의 검체에서 나온 일반세균 집락수를 측정하였다.
- 또 기회감염을 일으키는 균으로서 Klebsiella pneumoniae는 사람의 임상재료에서 가장 흔히 분리되는 균으로 모든 감염증을 일으키는 기회감염, 원내감염의 원인균이며 애주가 또는 노인에게 격증폐렴, 농흉을 일으킨다 (8, 13). 식용얼음에서 병원성이 낮은 기회감염성 세균 및 장내세균 등의 검출뿐만 아니라 병원성 세균도 검출되었다. 본 연구에서도 1곳에서 S.
- 식품위생법 시행령 식용얼음 규격의 일반세균수는 1 ml 당 100 이하를 규정으로 하고 있다. 이것을 기준으로 대구시 북구 인근지역 15곳을 채취한 결과 14곳의 검체에서 일반세균수를 초과하였고 1곳의 검체에서는 전혀 세균이 자라지 않았다(Table 1). BHI agar와 MacConkey agar에 배양된 집락을 그람염색하였으며 그 결과 그람음성간균이 80% 차지하였고 그람양성구균 17% 그리고 그람음성구균 3%의 분포를 나타냈다(Fig.
- xylosus로 동정되었다(Table 4). 이러한 결과는 API Staph kit를 이용하여 재동정한 결과 두 검체에서 Staphylococcus aureus, Staphylococcus xylosus로 나타났다. 잠정적 동정은 API Staph kit을 이용하여 3회 반복하였다.
후속연구
- 그리고 이은화 등은 냉온수기에서의 세균 분리 동정에서는 API kit를 이용하여 잠정적으로 동정하였으며 분자적 동정방법을 겸해야 하는 필요성을 제시하였다(10). 따라서 본 연구에서 동정된 세균의 정확성을 높이기 위해 향후 분자적 기법인 16S rRNA를 이용한 유전자의 염기서열을 분석하여 상동성을 확인한다면 더욱 정확한 미생물동정결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
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