[논문]Bacillus amyloliquefaciens IUB158-03이 생산하는 항진균물질의 분리와 항균활성

김혜영; 이태수

doi:10.4489/kjm.2009.37.1.096

Bacillus amyloliquefaciens IUB158-03이 생산하는 항진균물질의 분리와 항균활성
Isolation of Antifungal Substances by Bacillus amyloliquefaciens IUB158-03 and Antagonistic Activity against Pathogenic Fungi 원문보기

한국균학회지 = The Korean journal of mycology, v.37 no.1, 2009년, pp.96 - 103

초록
AI-Helper

병원성 미생물을 방제하기 위하여 국내의 고추 재배지에서 탄저병균에 감염된 고추로부터 Bacillus속 균주를 분리하였다. 이들 중 고추탄저병균인 C. gloeosporioides 균주와 식물에 회색곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea 균주에 대한 길항작용이 가장 우수한 Bacillus sp. IUB158-03을 선발하였다. 선발된 균주의 형태적, 생리 생화학적 특성과 MicroLog 방법을 이용하여 동정된된 균주는 B. amyloliquefaciens IUB158-03로 명명하였다. 항진균물질 생산을 위한 최적배지 조건은 2% soluble starch, 3% yeast extract, 0.5% tryptone, 0.5% $NH_4H_2PO_4$, 1% NaCl의 pH 6.0에서 $25^{\circ}C$, 72시간 배양한 추출물에서 가장 높은 항진균활성을 나타내었다. B. amyloliquefaciens IUB158-03이 생산한 항진균물질을 butanol로 추출한 후 silica gel column chromatography, preparative thin layer chromatography, and HPLC을 이용하여 항진균물질을 정제하였다. 정제된 항진균물질은 TLC plate 상에서 $R_f$값이 0.27인 것이 확인되었으며, 이 물질은 식물병원균인 Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Botrytis cineria, Alternata alternaria와 인체병원성 진균인 Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Cryptococcus neoformans 등에만 선택적으로 높은 항진균 활성을 보였다.

Abstract ▼ AI-Helper

For the control of pathogenic microorganisms, Bacillus spp. were isolated from diseased pepper fruits in Korea. Among them, Bacillus sp. IUB158-03 showed high inhibitory effect on mycelial growth and spore germination of C. gloeosporioides and Botrytis cinerea. The strain was identified as B. amyloliquefaciens IUB158-03 based on its physiological, biochemical characteristics and Microlog analysis. The highest level of antifungal substances by B. amyloliquefaciens IUB158-03 were obtained when the bacterium was cultured in medium containing 2% soluble starch, 3% yeast extract, 0.5% tryptone, 0.5% $NH_4H_2PO_4$, and 1% NaCl (pH 6.0) at $25^{\circ}C$ for 72 hrs. The antifungal substances were purified by butanol extraction, silica gel column chromatography, preparative thin layer chromatography, and high performance liquid chromatography. The purified antifungal substance was confirmed $R_f$ 0.27 by TLC. This substance exhibited antifungal activity against Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Botrytis cineria, Alternata alternaria of plant pathogenic fungi and Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Cryptococcus neoformans of human pathogenic fungi.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

따라서 본 연구를 통해 분리된 B. amyloliquefaciens IUB158-03이 생산하는 항진균물질은 식물병원성 진균에 대한 생물학적 방제제로 사용될 수 있는 잠재성이 있다고 판단되었으며, 앞으로 정제된 항진균물질의 화학적 특성과 구조를 규명하고 기작을 밝히고자 한다. 또한 세포 및 동물실험을 통해 인체에 대한 독성여부도 파악하고 안정성을 확인하여 미생물제제로서의 개발 가능성을 확인할 예정이다.

제안 방법

B. amyloliquefaciens IUB153-03이 생산하는 항진균물질의 정제를 위해 이 균을 최적 액체배지에 접종하여 25℃에서 180 rpm으로 72시간 동안 진탕 배양한 후 10,000 rpm으로 30분간 원심 분리한 후 상등액을 회수하여 butanol과 물(1 : 1)로 3회 반복 분획한 다음, butanol 층만을 회수하여 농축기(N-1, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 감압 농축한 후 동결건조(Operon Co., Korea)하여 항진균성을 나타내는 조추출물질을 얻었다(Fig. 1). 그리고 조추출물을 methanol에 용해시킨 후 1차, 2차 column(Φ 2.
B. amyloliquefaciens IUB153-03이 최적배지에서 항진균물질의 생산을 위한 최적 배양온도와 배양시간을 밝히기 위해 최적배지 100 ml에 B. amyloliquefaciens IUB153-03균주를 접종하여 108시간 동안 25℃에서 180 rpm으로 진탕 배양하면서 12시간 간격으로 9차례 균의 생장 정도와 항진균 활성을 조사하였다.
0에서 25℃, 72시간 배양한 추출물에서 가장 높은 항진균 활성을 나타내었다. B. amyloliquefaciens IUB158-03이 생산한 항진균물질을 butanol로 추출한 후 silica gel column chromatography, preparative thin layer chromatography, and HPLC을 이용하여 항진균물질을 정제하였다. 정제된 항진균물질은 TLC plate 상에서 R_f 값이 0.
6. Growth and antifungal activity of B. amyloliquefaciens IUB158-03 in the medium containing various phosphorus sources (0.5%) Control was consisted of 2% soluble starch, 3% yeast extract, 1% tryptone and 1% NaCl.
공시균의 항진균물질 생산 최적 배양온도와 시간을 알아보기 위해 선발된 최적배지의 pH를 6.0으로 조정하여 B. amyloliquefaciens IUB158-03를 접종하고 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃ 등 5단계 온도로 조정된 배양기에서 배양하면서 12시간 간격으로 108시간까지 총 9차에 걸쳐 균의 생장정도와 항진균 활성을 조사하였다. 실험 결과 균의 생장은 25℃에서 48시간 배양할 때 가장 높게 나타났으며, 항진균물질의 생산은 25℃에서 72시간 배양할 때 가장 높았다.
를 순수 분리한 후 식물병원균에 대한 항진균력이 우수한 Bacillus spp. 균주를 선발하고 동정하였다. 또한 선발된 균주의 항진균 물질의 생산을 위한 최적배지와 배양조건을 규명하고 생산된 항진균 물질을 분리·정제하여 식물과 인체에 병원성을 나타내는 진균을 대상으로 항진균 효과를 검정하였다.
그리고 조추출물을 methanol에 용해시킨 후 1차, 2차 column(Φ 2.5 × 70 cm)에는 silica gel column chromatography(Kiesel gel 60, 70~230 mesh, 80 g)를 이용하여 butanol-acetone-water(4 : 6 : 1, v/v/v)용출하였으며, 3차 분리할 때에는 column (Φ 1.5 × 70 cm)에 ethyl acetate-methanol-water(50 : 18 : 5, v/v/v)로 하여 각 분리된 분획을 얻어 감압 농축하고, 동결 건조한 후 C. gloeosporioides를 대상으로 항진균 활성을 조사하였다 (Fig. 2).
또한 선발된 균주의 항진균 물질의 생산을 위한 최적배지와 배양조건을 규명하고 생산된 항진균 물질을 분리·정제하여 식물과 인체에 병원성을 나타내는 진균을 대상으로 항진균 효과를 검정하였다.
, 1994). 또한, Biolog사(Biolog, Inc. USA)에서 개발한 Biolog MicroLog 3, 4.01 version kit의 실험결과를 분석하여 Bacillus의 종을 동정하였다.
병원성 미생물을 방제하기 위하여 국내의 고추 재배지에서 탄저병균에 감염된 고추로부터 Bacillus속 균주를 분리하였다. 이들 중 고추탄저병균인 C.
분리 동정된 B. amyloliquefaciens IUB153-03으로부터 항진균물질 생산을 위한 최적 배지를 선발하기 위하여 LB 배지 100 ml를 기본 배지로 하여 탄소원에 대해서는 L(+)-arabinose, dextrin, D-fructose, D(+)-galactose, glucose, glycerol, lactose, maltose, mannitol, D(+)-raffinose, sucrose, soluble starch, D-sorbitol, xylose를 각각 1% 씩 첨가하였으며, 질소원은 arginine, beef extract, casamino acid, casitone, malt extract, polypeptone, soytone, tryptone, yeast extract 각각 1% 씩 첨가하고, 인산염 NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄를 각각 0.5% 씩 첨가한 후 각각 25℃에서 180 rpm으로 72시간 진탕 배양한 후 생장 정도와 항진균 활성을 조사하였다.
선발된 균주들을 대상으로 포자발아 억제력을 확인하기 위하여 C. gloeosporioides과 B. cinerea를 PDA에서 14일 배양하여 포자가 형성되면 C. gloeosporioides의 포자 현탁액 1~5 × 106 conidia/ml, B. cinerea의 포자현탁액 1~5 ×1010 conidia/ml로 준비하여 이 중 1 ml를 PDA배지가 들어있는 샤레에 분주하여 유리봉으로 고르게 접종하였다.
amyloliquefaciens IUB153-03의 배양액으로부터 정제된 항진균물질의 항균력을 알아보기 위하여 서울대 식물병원성 곰팡이 유전자은행에서 분양받은 식물병원균 Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Botrytis cineria, Alternata alternaria와 안산1대학 임상병리과에서 분양받은 인체병원성 진균인 Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Cryptococcus neoformans와 인체 병원성 효모인 Candida albicans, 인체병원세균인 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa를 대상으로 실험을 수행하였다. 식물병원균은 PDA, 인체병원성 진균인 Trichophyton mentagrophytes와 Epidermophyton floccosum은 SDA(sabouraud dextrose agar; neopeptone 1%, dextrose 4%, agar 1.5%)에 접종 후 25℃에서 14일간 배양, Cryptococcus neoformans와 Candida albicans는 PDB 배지에 접종하여 25℃에서 2일간 배양하였으며, 인체병원성 세균은 LB 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 실험에 사용한 각각의 진균들의 포자 현탁액은 1~5 × 10⁶ conidia/ml로 조절하여 만들었으며, 포자현탁액 1 ml씩을 취하여 식물병원균은 PDA, 인체병원성 진균은 SDA에 도말하였으며, Cryptococcus neoformans 와 Candida albicans는 PDA 배지, 세균은 Müller-Hinton(Difco, USA) 배지에 도말한 후 paper disc 방법을 이용하여 항진균 활성을 조사하였다.
실험에 사용한 각각의 진균들의 포자 현탁액은 1~5 × 106 conidia/ml로 조절하여 만들었으며, 포자현탁액 1 ml씩을 취하여 식물병원균은 PDA, 인체병원성 진균은 SDA에 도말하였으며, Cryptococcus neoformans 와 Candida albicans는 PDA 배지, 세균은 Müller-Hinton(Difco, USA) 배지에 도말한 후 paper disc 방법을 이용하여 항진균 활성을 조사하였다.
6 ml/min flow rate로 여러 번 HPLC를 수행하여 정제된 항진균물질을 얻었다. 정제된 항진균물질이 단일 물질임을 확인하기 위하여 TLC로 전개한 후 -anisaldehyde로 발색하여 R_f값의 차이를 확인하였으며, 정제된 항진균물질의 항진균효과를 액체 배양액과 조추출물과 비교 분석하였다.
amyloliquefaciens IUB158-03균주를 선발된 최적 배지에 접종하여 배양한 후 상층액을 취해 butanol과 물(1 : 1)로 혼합하여 butanol 층을 회수하여 동결 건조하여 조추출물을 얻었다. 조추출물을 정제하기 위하여 silica gel column chromatography를 이용하여 각 분획을 얻어 감압 농축하여 TLC plate로 분획을 조사하고 항진균력을 확인하였으며, 항진균 물질을 좀더 정제하기 위하여 Preparative TLC로 전개한 후 항진균 활성을 나타낸 spot을 얻어 HPLC를 수행하였다. Preparative TLC로 얻은 물질에서는 retention time이 2.
초기 pH가 B. amyloliquefaciens IUB153-03의 항진균 물질 생산에 미치는 효과를 조사하기 위하여 최적 배지 (soluble starch 2%, yeast extract 3%, tryptone 0.5%, NaCl 1%, NH₄H₂PO₄ 0.5%) 100 ml에 1N HCl 과 1N NaOH로 pH를 4.0~10.0으로 조정하여 25℃에서 180 rpm으로 72시간 진탕 배양한 후 공시균의 생장과 공시균이 생산한 물질의 항진균 활성을 조사하였다.
최적 질소영양원을 선발하기 위하여 2%의 soluble starch를 첨가한 배지를 대조군의 배지로 사용하였으며, 실험군의 배지는 LB 배지에서 yeast extract와 tryptone을 제거한 후 각각 서로 다른 1%의 질소 영양원을 첨가하여 배지를 제조한 후 균의 생장과 항진균물질의 생산성을 조사하였다. 대조군과 실험군을 비교한 결과 균의 생장은 soytone을 첨가한 배지에서 높았으나 길항력은 낮았다.
최적의 인산염을 선발하기 위하여 2% soluble starch, 3% yeast extract와 0.5% tryptone, 1% NaCl로 조성된 배지를 대조군으로 하고 여기에 NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄ 등의 인산염을 각각 0.5% 씩 첨가하여 공시균의 생장과 항진균물질의 생산성을 조사하였다. 실험 결과 NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄를 첨가한 경우 대조군과 비슷한 결과를 나타냈으며, NH₄H₂PO₄를 첨가한 경우에는 대조군에 비해 생장은 낮았으나, 항진균 활성은 높게 나타났다(Fig.
항진균 물질을 Preparative TLC(DE 19713, Analte, Inc., 75 Blue Hen Drice Newark, USA)에 점적한 후 ethyl acetatemethanol-water(50 : 18 : 5, v/v/v)로 전개하여 UV Illuminator 를 이용하여 발색되는 모든 spot을 methanol로 용출하여 Speed vac(CC-105, TOMY, Japan)으로 농축한 다음 80% methanol로 용해하여 μBondapak C18 column(3.9 × 300 mm, Waters), UV detector(245 nm, Waters), 0.8 ml/min flow rate 조건으로 10 μl씩 주입하여 80% methanol로 전개하여 각 분획을 회수하여 항진균 활성을 조사한 후 다시 항진균물질 peak 만을 분리하기 위하여 10 μl 씩 0.6 ml/min flow rate로 여러 번 HPLC를 수행하여 정제된 항진균물질을 얻었다.
항진균물질 생산에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위하여 최적 배지에 1N HCl 과 1N NaOH로 pH 4.0~10.0 까지 7단계로 조정하여 공시균을 접종하여 균의 생장 정도와 항진균 물질의 생산성을 조사하였다. 실험 결과 pH 6.
항진균물질의 추출을 위해 B. amyloliquefaciens IUB158-03균주를 선발된 최적 배지에 접종하여 배양한 후 상층액을 취해 butanol과 물(1 : 1)로 혼합하여 butanol 층을 회수하여 동결 건조하여 조추출물을 얻었다. 조추출물을 정제하기 위하여 silica gel column chromatography를 이용하여 각 분획을 얻어 감압 농축하여 TLC plate로 분획을 조사하고 항진균력을 확인하였으며, 항진균 물질을 좀더 정제하기 위하여 Preparative TLC로 전개한 후 항진균 활성을 나타낸 spot을 얻어 HPLC를 수행하였다.
2). 항진균활성을 나타내는 분획을 얻어 TLC plate (Kiesel gel 60 F254, Merk, Germany)에 점적한 후 butanol-acetone-water(4 : 6 : 1, v/v/v)로 전개하여 UV Illuminator(VL-1.4, VILBER LOURMAT, France)로 254365 에서 항진균성 활성물질을 비교 분석하였다. 항진균 물질을 Preparative TLC(DE 19713, Analte, Inc.

대상 데이터

B. amyloliquefaciens IUB153-03의 배양액으로부터 정제된 항진균물질의 항균력을 알아보기 위하여 서울대 식물병원성 곰팡이 유전자은행에서 분양받은 식물병원균 Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Botrytis cineria, Alternata alternaria와 안산1대학 임상병리과에서 분양받은 인체병원성 진균인 Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Cryptococcus neoformans와 인체 병원성 효모인 Candida albicans, 인체병원세균인 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa를 대상으로 실험을 수행하였다. 식물병원균은 PDA, 인체병원성 진균인 Trichophyton mentagrophytes와 Epidermophyton floccosum은 SDA(sabouraud dextrose agar; neopeptone 1%, dextrose 4%, agar 1.
gloeosporioides 균주와 식물에 회색곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea 균주에 대한 길항작용이 가장 우수한 Bacillus sp. IUB158-03을 선발하였다. 선발된 균주의 형태적, 생리·생화학적 특성과 MicroLog 방법을 이용하여 동정된된 균주는 B.
cinerea 균주의 균사생장을 동시에 억제시키는 46 균주를 1차 선발하였으며, 이들 중 포자의 발아를 억제시키는 20균주를 2차로 선발하고 그 중 생장과 항균력이 가장 우수한 Bacillus sp. IUB158-03을 최종 선발하였다.
시료는 경기도, 인천시, 충청남·북도, 전라남·북도, 경상북도 및 제주도 등 전국 60개 지역의 고추 재배지에서 탄저병균에 감염된 고추열매를 채집한 후 실험실로 옮겨 4℃에 보관하면서 Bacillus spp.균주를 분리하여 실험에 이용하였다.
5% tryptone을 혼합한 배지에서 더 높게 나타났다. 따라서 3% yeast extract와 0.5% tryptone을 혼합한 질소 영양원을 선발하였다(Fig. 5).
순수분리된 Bacillus spp.의 항진균물질 생산 여부를 탐색하기 위하여 고추열매에 병원성을 나타낸 Colletotrichum gloeosporioides 균주와 고추와 오이에 병원성이 있고 여러 종류의 살균제에 대한 저항성을 나타내는 Botrytis cinerea 균주를 서울대학교 식물병원성 곰팡이 유전자은행으로 부터 분양받아 실험에 사용하였다.

이론/모형

순수 분리한 균이 Bacillus spp.인 것을 확인하기 위하여 Schaeffer-Fulton (Harold, 1990)법을 이용하여 내생포자를 염색한 후 1,000X 배율의 현미경으로 내생포자 형성 여부를 검경하였다.
항진균물질 생산 균주을 동정하기 위하여 Bergey’s Manual의 방법에 따라 그람염색, 내생포자염색, 형태, 운동성, 당분해능 등의 생리·생화학적 특성을 분석하였다(Holt et al., 1994).

성능/효과

B. amyloliquefaciens IUB158-03이 생산한 항진균물질의 항균력을 Table 9와 같이 식물병원진균인 Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Alternaria alternata와 인체 병원성 진균인 Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum에 높은 항진균 활성을 나타냈으나 Cryptococcus neoformans에는 낮게 나타났다. 또한 병원성효모인 Candida albicans과 병원성 세균인 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa에는 항균활성을 전혀 나타내지 못하였다.
B. amyloliquefaciens IUB158-03이 항진균물질 생산을 위한 최적배지를 선발 하기위해 LB 배지에 탄소원을 각각 1% 씩 첨가하여 생장 정도와 항진균물질의 생산성을 조사한 결과 D(+)-raffinose와 soluble starch가 첨가된 배지에서 가장 높게 나타났다. 두 탄소원의 농도에 따른 항진균물질의 생산을 확인한 결과 2%의 soluble starch가 첨가 된 배지에서 B.
조추출물을 정제하기 위하여 silica gel column chromatography를 이용하여 각 분획을 얻어 감압 농축하여 TLC plate로 분획을 조사하고 항진균력을 확인하였으며, 항진균 물질을 좀더 정제하기 위하여 Preparative TLC로 전개한 후 항진균 활성을 나타낸 spot을 얻어 HPLC를 수행하였다. Preparative TLC로 얻은 물질에서는 retention time이 2.6분, 3.1분, 3.9분, 4.4분인 4개의 peak가 혼합되어 있었으며, 이들 중 retention time이 4.4분인 peak가 항진균물질을 함유하고 있는 것으로 확인되었다. 정제된 항진균물질을 TLC로 전개한 후 -anisaldehyde 로 발색하여 R_f 값이 0.
최적 질소영양원을 선발하기 위하여 2%의 soluble starch를 첨가한 배지를 대조군의 배지로 사용하였으며, 실험군의 배지는 LB 배지에서 yeast extract와 tryptone을 제거한 후 각각 서로 다른 1%의 질소 영양원을 첨가하여 배지를 제조한 후 균의 생장과 항진균물질의 생산성을 조사하였다. 대조군과 실험군을 비교한 결과 균의 생장은 soytone을 첨가한 배지에서 높았으나 길항력은 낮았다. 이에 따라 대조군 배지의 두 질소영양원의 혼합 비율을 조정하여 생장 정도와 항진균물질의 생산성을 조사한 결과 3% yeast extract와 1% tryptone의 혼합한 배지에서 공시균의 생장이 가장 높았으나, 항진균물질의 생산성은 3% yeast extract와 0.
amyloliquefaciens IUB158-03이 항진균물질 생산을 위한 최적배지를 선발 하기위해 LB 배지에 탄소원을 각각 1% 씩 첨가하여 생장 정도와 항진균물질의 생산성을 조사한 결과 D(+)-raffinose와 soluble starch가 첨가된 배지에서 가장 높게 나타났다. 두 탄소원의 농도에 따른 항진균물질의 생산을 확인한 결과 2%의 soluble starch가 첨가 된 배지에서 B. amyloliquefaciens IUB158-03의 생장과 항진균물질의 생산이 가장 높았다. 따라서 B.
또한 병원성효모인 Candida albicans과 병원성 세균인 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa에는 항균활성을 전혀 나타내지 못하였다. 따라서 B. amyloliquefaciens IUB158-03 균주가 생산한 항균물질의 항균활성은 진균에만 선택적으로 나타내었다(Table 2). 이는 기존에 Bacillus spp.
8). 따라서 B. amyloliquefaciens IUB158-03 균주의 항진균물질 생산을 위한 최적 배지는 2% soluble starch, 3% yeast extract, 0.5% tryptone, 0.5% NH₄H₂PO₄, 1%의 NaCl이 었으며, 배양 조건은 pH 6.0, 배양온도 25℃ 및 배양시간 72시간으로 결정되었다.
amyloliquefaciens IUB158-03의 생장과 항진균물질의 생산이 가장 높았다. 따라서 B. amyloliquefaciens IUB158-03의 최적 탄소영양원으로 2% soluble starch가 선발되었다(Fig. 3, 4). 이는 Botrytis cinerea에 항균 효과를 보인 Bacillus sp.
5%가 선발되었다. 따라서 실험결과에 따라 B. amyloliquefaciens IUB158-03균주의 항진균물질 생산을 위한 최적 배지의 탄소원은 2% soluble starch, 질소원은 3% yeast extract와 0.5% tryptone, 인산원은 0.5% NH₄H₂PO₄ 1%의 NaCl로 밝혀졌다.
선발된 균주의 형태적, 생리·생화학적 특성과 MicroLog 방법을 이용하여 동정된된 균주는 B. amyloliquefaciens IUB158-03로 명명하였다.
5% 씩 첨가하여 공시균의 생장과 항진균물질의 생산성을 조사하였다. 실험 결과 NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄를 첨가한 경우 대조군과 비슷한 결과를 나타냈으며, NH₄H₂PO₄를 첨가한 경우에는 대조군에 비해 생장은 낮았으나, 항진균 활성은 높게 나타났다(Fig. 6). 이상의 결과로 B.
0 까지 7단계로 조정하여 공시균을 접종하여 균의 생장 정도와 항진균 물질의 생산성을 조사하였다. 실험 결과 pH 6.0에서 생장과 항진균 물질의 생산이 가장 높게 나타났다(Fig. 7).
amyloliquefaciens IUB158-03를 접종하고 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃ 등 5단계 온도로 조정된 배양기에서 배양하면서 12시간 간격으로 108시간까지 총 9차에 걸쳐 균의 생장정도와 항진균 활성을 조사하였다. 실험 결과 균의 생장은 25℃에서 48시간 배양할 때 가장 높게 나타났으며, 항진균물질의 생산은 25℃에서 72시간 배양할 때 가장 높았다. 즉, 항진균물질의 생산은 균이 균의 정지기 후인 72시간 배양 후 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
IUB158-03을 동정하기 위하여 Bergey’s Manual 방법에 의해 형태적, 생리 · 생화학적 특성을 조사한 결과는 Table 1과 같다. 이 균주는 Gram 양성 간균으로 운동성을 보였으며, catalase 양성, D-glucose, D-xylose, D-mannose 발효능을 보였지만, D-arabinose는 발효하지 않았다. 또한 casein, starch 가수분해효소를 생산하며, NaCl 2~10%와 생장온도 20~60℃에서 생장을 보였다.
6). 이상의 결과로 B. amyloliquefaciens IUB158-03 균주의 항진균물질 생산을 위한 최적 인산염으로는 NH₄H₂PO₄ 0.5%가 선발되었다. 따라서 실험결과에 따라 B.
대조군과 실험군을 비교한 결과 균의 생장은 soytone을 첨가한 배지에서 높았으나 길항력은 낮았다. 이에 따라 대조군 배지의 두 질소영양원의 혼합 비율을 조정하여 생장 정도와 항진균물질의 생산성을 조사한 결과 3% yeast extract와 1% tryptone의 혼합한 배지에서 공시균의 생장이 가장 높았으나, 항진균물질의 생산성은 3% yeast extract와 0.5% tryptone을 혼합한 배지에서 더 높게 나타났다. 따라서 3% yeast extract와 0.
amyloliquefaciens IUB158-03이 생산한 항진균물질을 butanol로 추출한 후 silica gel column chromatography, preparative thin layer chromatography, and HPLC을 이용하여 항진균물질을 정제하였다. 정제된 항진균물질은 TLC plate 상에서 R_f 값이 0.27인 것이 확인되었으며, 이 물질은 식물병원균인 Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Botrytis cineria, Alternata alternaria와 인체병원성 진균인 Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Cryptococcus neoformans 등에만 선택적으로 높은 항진균 활성을 보였다.
4분인 peak가 항진균물질을 함유하고 있는 것으로 확인되었다. 정제된 항진균물질을 TLC로 전개한 후 -anisaldehyde 로 발색하여 R_f 값이 0.27인 것을 확인하였다(Fig. 9). 또한 배양액, 조추출물 및 정제된 항진균물질의 항균활성을 비교한 결과 Fig.
실험 결과 균의 생장은 25℃에서 48시간 배양할 때 가장 높게 나타났으며, 항진균물질의 생산은 25℃에서 72시간 배양할 때 가장 높았다. 즉, 항진균물질의 생산은 균이 균의 정지기 후인 72시간 배양 후 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 8). 따라서 B.
amyloliquefaciens IUB158-03로 명명하였다. 항진균물질 생산을 위한 최적배지 조건은 2% soluble starch, 3% yeast extract, 0.5% tryptone, 0.5% NH₄H₂PO₄, 1% NaCl의 pH 6.0에서 25℃, 72시간 배양한 추출물에서 가장 높은 항진균 활성을 나타내었다. B.

후속연구

amyloliquefaciens IUB158-03이 생산하는 항진균물질은 식물병원성 진균에 대한 생물학적 방제제로 사용될 수 있는 잠재성이 있다고 판단되었으며, 앞으로 정제된 항진균물질의 화학적 특성과 구조를 규명하고 기작을 밝히고자 한다. 또한 세포 및 동물실험을 통해 인체에 대한 독성여부도 파악하고 안정성을 확인하여 미생물제제로서의 개발 가능성을 확인할 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	식물병의 방제는 어떤 측면에서 주목받고 있는가?	식물병의 방제는 작물의 수량과 품질을 향상시키고, 인구증가에 따른 식량자원의 공급량을 증가시킨다는 면에서 중요성이 부각되고 있다. 지금까지 식물병원균의 피해를 방지하기 위해 각종 농약에 의한 화학적 방제법이 널리 이용되어 왔다(Cook et al.
	지금까지 식물병원균의 피해를 방지하기 위해 이용된것은?	식물병의 방제는 작물의 수량과 품질을 향상시키고, 인구증가에 따른 식량자원의 공급량을 증가시킨다는 면에서 중요성이 부각되고 있다. 지금까지 식물병원균의 피해를 방지하기 위해 각종 농약에 의한 화학적 방제법이 널리 이용되어 왔다(Cook et al., 1985).
	농약에 의한 화학적 방제법의 문제점은?	, 1985). 그러나 농약의 과다사용으로 인한 난분해성 물질의 잔류에 의한 공기, 토양, 지하수의 오염으로 환경과 생태계 파괴, 인축독성 등 많은 문제점들이 야기되었다. 이러한 화학적 방제법으로 인한 부작용에 효과적으로 대처할 수 있는 방법으로 생태계에서의 미생물 간의 상호관계를 이용한 친환경적인 생물학적 방제법이 모색되었다(Burpee and Goulty, 1984; Yoshie et al.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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