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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 韓國獨活(땃두릅)4 continentalic 中國獨活<4 pubescens의 효능을 비교하기 위해 항산화 효능에 대한 영향을 검사하였다.
- 효능을 비교할 필요가 있다. 이에 저자는 獨 活의 효능으로 알려진 祛風, 和血, 항염 등이 항산화 효능과 연관이 있음을 고려하여, 韓國獨活과 中國獨活을 대상으로 항산화 효능을 실험하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1.5X10-4 M의 농도로 에탄올에 녹여 조제한 DPPH 반응액과 일정 농도의 시료를 30 山를 첨가해 최종 부피가 3 血가 되게 혼합하고 3분 후에 517 rnn에서흡광도를 측정하여 소거능(%)을 산출하였다.
- SOD의 활성에 따른 흡광치의 변화를 측정하여 SOD 표준곡선(Fig. 8)을 기준으로 간추출용액의 SOD 활성을 측정하고, 이와 함께 각 시료가 투여된 개체에서 절취하여 준비된 효소용액의 단백질량을 검사하였으며, 이를 근거로 Soluble SOD(Cu . Zn-SOD) 활성을 환산하였다. 정상군의 SOD 활성은 0.
- Sprague-Dawley계 수컷 횐쥐를 1주일간 예비 사육한 후, 에탄올 단독투여군인 대조군, 강력한 항산화제인 silymarind g/kg body weighl/day)투여군 그리고 검액투여군 등으로 실험군을 나누어 모든 실험군에 2주일 동안 매일 마리당 30% 에탄올 3.0 ml를 경구투여하여 산화적 스트레스를 유발하였다(Table 1).
- 측정하였다. lxlO-3 M sodium azide와 ImM EDTA를 함유하는 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) 500 ul, 효소액 100 iA, glutathione reductase(2.768 U/ml) 100 “1, lxlO-2 M glutathione 100M를 혼합, 37P에서 10분 동안 예비 배양한 후 이 반응액에 0.1% NaHCQj에 녹인 1.5xl0「3 m NADPH 100M를 가해 1분간 그리고 1.5xl0 3 M H2O2 100id# 가한 후 다시 1분간 340 mi에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 흡광도와 NADPH의 molecular extinction coefficient(E=6.
- 韓國獨活 전탕액 및 中國獨活 전탕액을 냉동건조하여 얻은 시료의 DPPH 소거능을 측정하여, 항산화제로 널리 활용되고 있는 BHT (butylated hydroxy toluene) 의 DPPH 소거활성과 비교하였다. 62.
- 과산화수소成》를 분해시키는 정도를 검사하여 catalase 활성을 측정하였으며, 이를 위하여 작성한 과산화수소의 표준 곡선은 Fig. 10과 같았다. 정상군의 catalase 활성은 152.
- 1% picric acid를 첨가한 다음, 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 그 상등액을 취하여 0.2 mM NADPH, 0.6 mM DTNB, 5 mM BETA 및 glutathione reductase가 포함된 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 75) 를 첨가하여 412 nm에서 30초 간격으로 3분간 흡광치변화를 측정하였다.
- 불포화유리지방산의 일종인 linoleic acid에 대한 韓國 獨活 및 中國獨活의 산화억제 활성 (oxidation inhibition) 을 측정하였으며, 항산화제로 널리 활용되고 있는 BHT (butylated hydroxy toluene) 와 ascorbic add (AA Vitamin C)의 산화억제활성을 같이 검사하여 비교하였다. 韓國獨 活과 中國獨活의 초기산화억제활성은 8.
- 사육장 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 사육장은 인공조명설비에 의하여 조명시간을 오전 7: 00부터 오후 7 :00까지 12시간으로 조절하며, 실내온도는 22±lt, 습도는 60% 내외로 유지하였고, 급수는 일반 상수도를 사용하였고 사료와 급수는 제한하지 않았다. 정상사료를 食餌 하면서 사육한 후에 체중이 220±10 g인 개체를 실험에 사용하였다.
- 산화적 스트레스 유발과 동시에 검액 투여군에는 韓國 獨活 전탕액(0.41 g drug/ml)과 中國獨活 전탕액(0.41 g drug/ml)을 2주일 동안 매일 1회에 걸쳐 17:00-18:00時 에 개체당 0.5 ml 씩 경구투여하였고, 대조군에는 전탕액대신에 생리식염수(0.85% NaCl)를, 실리마린 투여군에는 실리마린(1 g/kg body weighl/day)을 투여하였다.
- 시료액 100 仙와 2% NazCQ; 2 ml 및 50% Folin-Ciota이teau 시약 100 M 를 혼합하고 30분 후 흡광도를 750 nm에서 측정한 후 얻어진 흡광도를 tannic acid를 표준물질로 사용한 검량선에 근거하여 산출하였다.
- 에탄올을 투여하여 산화적 스트레스를 유발시킨 횐쥐간의 ADH 활성을 검사하였다. 에탄올을 투여하지 않은 정상군의 ADH 활성은 1.
- 施 ml를혼합한 후 37C에서 10분간 예열하였다. 여기에 xanthine oxidase(0.1 U/ml) 200 M 를 가하고 다시 370에서 2(福간 배양 휘 0.05% sulfanilamide 0.1 ml, 0.02% N-(l-n%hthyl) rthylenediamine 0.1 血를 가한 후 실온에서 20분간 방치한 후 595 nm에서의 흡광치변화를 측정하였다. 이와 함께 표준 SOD를 사용하여 동일한 과정을 행하여 표준검량선을 얻었으며, 시료의 단백질함량을 반영하여 활성 (unit/mg protein)을 나타내었다.
- 원심분리기로는 high speed centrifuge (Kontron, Model T-324, Italy), ultra centrifuge (Kontron, Model T-2000, Itale), 조직마쇄용으로 homogenizer (B , Braun, Model Potter S, Germaq讯 용액시료의 냉동건조에는 freeze-dryer (Labconco, Model LYPH , LOCK 12, 乙S4) 와 centra-vac system (Vision, Model VS-802F, Korea), 흡광치 측정용으로 UV-visible spectrophotometer (Sbimadzu, Model Mni-1240, Japari), 건조시료의 분쇄에는 pulverizer (Rong-Tsong Iron workers, Taiwan), 용액시료의 농축에는 rotaiy evaporator (Tokyo Rikakikai Co, Model Eyela, Japan), 세포배양에는 CO2 incubator (Nuaire, USA) 및 Clean bench (Hansol SM, Korea) 등의 기기를 이용하였다.
- 0 ml 를혼합한 다음, 300로 온도를 조정하였다. 이 혼합액에 미리 준비된 효소액 0.1 血를 가하여 파장 340 nm에서 1 분간의 흡광도변화를 측정하였으며, 생성된 NADH의 양을 활성으로 환산하였으며, 계산식은 다음과 같았다.
- 1 血를 가한 후 실온에서 20분간 방치한 후 595 nm에서의 흡광치변화를 측정하였다. 이와 함께 표준 SOD를 사용하여 동일한 과정을 행하여 표준검량선을 얻었으며, 시료의 단백질함량을 반영하여 활성 (unit/mg protein)을 나타내었다.
- 전탕액을 냉동건조하여 얻은 전탕 엑스 분말의 superoxide anion radical 소거능(scavenging activity)을 측정하였다. 100, 300, 500, 700 “g/ml(=mg/匝)의 전탕 엑스 분말을 사용하였을 때, 韓國獨活의 superoxide anion radical 소거 능은 각각 0%, 0.
- 페놀성 물질(phenolic compounds)은 여러 산화 반응을 억제하는 영향을 미치기 때문에, 韓國獨活 및 中國獨活 전탕 엑스 분말에 포함되어 있는 페놀성 성분의 함량측정을 위하여, tannic acid를 표준물질로 사용하여 작성한 표준 곡선은 Fig. 5와 같았다.
- 한국과 중국에서 각각 獨活로 사용되는 韓國獨活 {Aralia continentalis Root)과 中國獨活屜 pubescens R8t)의 항산화 효능에 대한 영향을 검사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 횐쥐에 에탄올을 투여하여 산화적 스트레스를 유발하는 한편, 각 실험군에 韓國獨活 전탕액, 中國獨活 전탕액및 강력한 항산화제인 실리마린을 각각 투여하여, 스트레스만 유발한 대조군(control)과 비교하였다. 흰쥐의 간 (liver)을 절취하여 간에서의 산화적 스트레스의 지표가 되는 GSH 성분의 함량 또는 활성을 검사한 결과, 에탄올만 투여한 대조군의 GSH 농도는 6.
대상 데이터
- DPFH (l, l-diphenyl-2-应rylhydrazyl), glutathione, linoleic acid, NAD (diphosphopyridine nucleotide), NBT (nitro blue tetrazolium chloride monohydrate), sodium azide, sodium xanthine, magnesium chloride, PMS (phenazine methosulfate), rotenone, semicarbazide-HCl 등은 SIGMA 제품, acetaldehyde, glutamine, hydrogen peroxide, silymarin group, tanic acid, trichloroacetic acid, picric acid 등은 Aldrich 제품, ethan이은 JT Baker 제품, xanthine oxidase는 Calbio 제품을 사용하였다.
- In vivo 실험에는 전탕액을, 그리고 in vitro 실험에는 전 탕 엑스 분말을 사용하였다. 약재를 냉각기가 부착된 둥근 플라스크에 넣은 후, 10-15배량의 증류수를 첨가한 다음, 플라스크 탕액이 끓는 시점으로부터 2시간 동안 전 탕하였다.
- 韓國獨活04 continentalis Raot)은 국내산을 시중에서, 中國獨活(4 pubescens Root) 은 중국산을 중국 안 국 시장에서 구입하여 경원대학교 본초학교실에서 감정한 후 사용하였다.
-
2) 동물
동물로는 Sprague-Dawley계의 수컷 횐쥐를 2주일 이상 사육장 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 사육장은 인공조명설비에 의하여 조명시간을 오전 7: 00부터 오후 7 :00까지 12시간으로 조절하며, 실내온도는 22±lt, 습도는 60% 내외로 유지하였고, 급수는 일반 상수도를 사용하였고 사료와 급수는 제한하지 않았다.
- 5% 이상이었다. 본 연구에서 사용한 BHT는 고순도(99.8%)이며, 韓 國獨活 및 中國獨活은 전탕액을 냉동건조하여 얻은 분말임을 고려할 때, 韓國獨活과 中國獨活의 DPPH 소거 활성은 매우 강한 편이라고 생각된다(Fig. 2).
- 사육장은 인공조명설비에 의하여 조명시간을 오전 7: 00부터 오후 7 :00까지 12시간으로 조절하며, 실내온도는 22±lt, 습도는 60% 내외로 유지하였고, 급수는 일반 상수도를 사용하였고 사료와 급수는 제한하지 않았다. 정상사료를 食餌 하면서 사육한 후에 체중이 220±10 g인 개체를 실험에 사용하였다.
- 41 g/血 이었다. 항산화 및 세포증식 실험 등 in vitro 실험을 위한 시료로는 준비된 전탕액을 동결건조기로 완전 건조한 분말을 사용하였다. 韓國獨活 전 탕 액으로부터 얻은 분말의 수율은 7.
데이터처리
- In vivo 실험으로부터 얻은 결과들의 실험군별 상호비교를 위한 평균치는 평균 士 표준오차(Mean土SD)로 산출하였다. 실험군간의 유의성 검증은 students Hest 분석 방법을 이용하여 /厂value가 0.
이론/모형
- ALDH활성은 Tottmar 등27)의 방법에 따라 측정하였다. 75 mM phosphate buffer(pH8.
- Catalase 활성은 Abei20의 방법에 따라 측정하였다. 0.
- DPPH 라디칼 소거능은 Lee 등询의 방법에 따라 실시하였다. 1.
- GSH-px 활성은 Flohe24)의 방법에 따라 측정하였다. lxlO-3 M sodium azide와 ImM EDTA를 함유하는 0.
- GSH의 함량은 Ellman 둥23)의 방법에 따라 간(liver) 조직의 분쇄액을 준비하여 측정하였다. 균질화한 액을 20 분간 원심분리(l, 000xg, 46하여 상등액을 취하였다.
- Linoleic acid 과산화저해율은 Haragucbi 등匆)의 방법에 따라 실시하였다. 25 mg/ml 농도의 시료용액 30 iA, linoleic acid 400 iA, phosphate buffer 800 증류수 770 M 를 가해 반응 혼합물을 만들어 400에서 자동산화를 유발하였다.
- SOD 활성은 Pttidis 등夠의 방법에 따라 측정하였다. 15 mM sodium xanthine (in 0.
- Superoxide anion radical 소거능은 Nishikimi 등 2®의방법에 따라 실시하였다. 시료 500 id, 0.
- Tottmar 등初의 방법에 따라 측정하였다. 0.
- 실험군간의 유의성 검증은 students Hest 분석 방법을 이용하여 /厂value가 0.05 미만인 경우에 그 유의성을 인정하였다.
- 페놀 함량은 Kim 등끄)의 방법에 따라 실시하였다. 시료액 100 仙와 2% NazCQ; 2 ml 및 50% Folin-Ciota이teau 시약 100 M 를 혼합하고 30분 후 흡광도를 750 nm에서 측정한 후 얻어진 흡광도를 tannic acid를 표준물질로 사용한 검량선에 근거하여 산출하였다.
성능/효과
- 1. DPPH 소거활성은 韓國獨活이 中國獨活보다 강하였다. 2.
- DPPH 소거활성은 韓國獨活이 中國獨活보다 강하였다. 2. 韓國獨活과 中國獨活의 superoxide anion radical 소거 활성은 비슷하였다.
- 3. Linoleic acid 과산화 저해효과는 韓國獨活이 中國獨 活보다 강하였다.
- 4. 페놀성 성분 함량은 韓國獨活이 中國獨活보다 더 높았다.
- 5. 韓國獨活 및 中國獨活은 산화적 스트레스가 유발된 흰쥐의 GSH 농도를 증가시키고, SOD 활성은 저하시켰으며, 韓國獨活이 더 강하였다.
- 6. 韓國獨活은 GSH-px 활성을 상승시켰으나, 中國獨活 은 효과가 없었다.
- 소거활성과 비교하였다. 62.5, 125, 250, 500, 1, 000 lUg/ml (=㎎/㎏; ppm)의 시료를 사용하였을 때, 韓國獨活 의 DPPH 소거능은 각각 19.9%, 29.9%, 44.4%, 76.2% 및 83.6%였다. 시료의 양이 증가함에 따라 DPPH 소거능도 증가하였으나, 시료량이 500 昭/血 이상인 경우에는 소거 활성이 다소 둔화되는 경향을 보였다.
- 7. 韓國獨活과 中國獨活은 산화적 스트레스가 유발된 횐쥐의 catalase, ADH, ALDH에 유의한 영향을 주지 않았다.
- 전반적으로 韓國獨活이 中國獨活보다 DPPH 소거활성이 더 강하였다. BHT의 DPPH 소거활성은 62.5 飓/ml의 농도에서 74.2%로서 韓國獨活의 약 3.7배의 소거활성을 보였으며, 250 «g/ml 이상에서는 소거활성이 94.5% 이상이었다. 본 연구에서 사용한 BHT는 고순도(99.
- 8%인 韓國獨活 및 中國獨活보다 훨씬 높은 억제효율을 보였으나, 52시간에는 산화억제율이 저하되어 韓國獨活 및 中國獨活과 대등한 억제율을 보였고, 64시간 이후에는 韓國獨活 및 中國獨活의 산화 억제율이 오히려 더 높았다. Linoleic acid에 대한 韓國獨活 및 中國獨活의 산화억제 활성은 반응시간대별로 거의 유사하였으나, 전반적으로 韓國獨活이 中國獨活보다 다소 강한 산화억제활성을 보였다(Fig. 4).
- 6k U/mg protein의 활성을 보였다. 中國獨活 투여군의 catalase 활성이 韓國獨活 투여군의 catalase 활성보다 다소 높은 경향성을 보였으나, 대조군과 비교하여 두 실험군 모두 유의한 차이를 보이지는 않았다. 이에 비하여 실리마린 투여군의 활성은 대조군에 비하여 유의하게 상승하였다(p<0.
- 시료의 양이 증가함에 따라 DPPH 소거능도 증가하였으나, 시료량이 500 昭/血 이상인 경우에는 소거 활성이 다소 둔화되는 경향을 보였다. 中國獨活의 DPPH 소거능은 투여된 전탕 엑스 분말의 양에 따라 각각 11.4%, 19.1%, 33.9%, 53.5% 및 75.3%로 시료의 양이 증가함에 비례하여 DPPH 소거능이 증가하였다. 전반적으로 韓國獨活이 中國獨活보다 DPPH 소거활성이 더 강하였다.
- 韓國獨 活과 中國獨活의 초기산화억제활성은 8.9% 및 4.8%로 15.6% 및 52.4%인 BHT 및 ascorbic acid에 비하여 훨씬 약한 수준이었으나, 투여 후 28시간째에는 韓國獨活 의 억제활성이 78.0%, 中國獨活의 억제활성이 70.4%로서 BHT의 억제활성 84.9%에 근접하였다. 항산화제로 널리 활용되고 있는 ascorbic acid의 초기 산화억제율은 52.
- 05). 韓國獨活 및 中國獨活 투여군 모두 대조군에 비하여 GSH농도가 증가하였으나, 韓國獨活 투여군의 증가폭이 더 컸다(Fig. 6).
- 항산화 및 세포증식 실험 등 in vitro 실험을 위한 시료로는 준비된 전탕액을 동결건조기로 완전 건조한 분말을 사용하였다. 韓國獨活 전 탕 액으로부터 얻은 분말의 수율은 7.8%였으며, 中國獨活 전 탕 액으로부터 얻은 분말의 수율은 9.2%였다.
- 韓國獨活 전탕 엑스 분말에는 페놀성 성분이 57.48 点 mg, 그리고 中國獨活 전탕 엑스 분말에는 34.89 娼/mg의 페놀성 성분이 함유되어 있어, 中國獨活보다 韓國獨活의페놀성 성분비율이 더 높았다(Table 2).
- 0%에 달하였다. 韓國獨活 전탕액 투여군의 GSH 농도는 12.8±0.9 ug/g tissue로 대조군과 비교하였을 때 233.0%로 현저히 상승되었으며 QK0.01), 中國獨活 투여군의 GSH함량은 10.0+1.0 昭/g tissue로 역시 대조군에 비하여 유의하게 상승하였다QK0.05). 韓國獨活 및 中國獨活 투여군 모두 대조군에 비하여 GSH농도가 증가하였으나, 韓國獨活 투여군의 증가폭이 더 컸다(Fig.
- 0D. 韓國獨活 전탕액 투여군의 catalase 활성은 127.0+4.4, 中 國獨活 전탕액 투여군의 활성은 135.8±7.2, 그리고 항산화제인 실리마린(1 g/kg body weight /day)투여군의 catalase 활성은 143.7±7.6k U/mg protein의 활성을 보였다. 中國獨活 투여군의 catalase 활성이 韓國獨活 투여군의 catalase 활성보다 다소 높은 경향성을 보였으나, 대조군과 비교하여 두 실험군 모두 유의한 차이를 보이지는 않았다.
- 14 mU/mg protein이었다. 대조군과 비교하였을 때, 韓國獨活 투여군은 ADH 활성이 대조군에 비하여 114.3%의 활성을 보여 다소 증가한 경향성을 보였으나 유의한 정도는 아니었다. 中國獨活 투여군의 ADH 활성 역시 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 효능이 더 강하다고 할 수 있다. 비록 韓國獨活 이 본초문헌에 기록된 기원식물이 아니라 할지라도 이처럼 강한 항산화 효능을 바탕으로 적절한 사용을 하는 것이 타당하다고 사료된다.
- 6%였다. 시료의 양이 증가함에 따라 DPPH 소거능도 증가하였으나, 시료량이 500 昭/血 이상인 경우에는 소거 활성이 다소 둔화되는 경향을 보였다. 中國獨活의 DPPH 소거능은 투여된 전탕 엑스 분말의 양에 따라 각각 11.
- 01). 에탄올 투여와 더불어 韓國獨活 전탕액 투여군의 SOD 활성은 0.33±0.02, 中國獨活 전탕액 투여군은 0.56+0.04, 그리고 에탄올과 함께 실리마린이 투여된 경우의 SOD 활성은 0.58±0.03 U/mg proteine 활성을 보였다. 대조군과 비교하였을 때, 韓國獨活 투여군의 SOD 활성은 대조군에 비하여 현저하게 저하되었다QK0.
- 에탄올을 투여하여 산화적 스트레스를 유발시킨 흰쥐 간장의 ALDH 활성을 검사한 결과, 에탄올을 투여하지 않은 정상군의 ALDH 활성은 5.23+0.37 mU/mg protein 이었으며, 에탄올이 투여된 대조군의 ALDH활성은 5.07+ 0.37 mU/mg protein으로 정상군과 비교하였을 때 유의한 차이를 보이지 않았다. 에탄올과 함께 韓國獨活 전 탕 액을 투여한 군의 ALDH 활성은 4.
- 이러한 결과들을 종합할 때, 韓國獨活은 中國獨活보다 항산화 효능이 더 강하다고 할 수 있다. 비록 韓國獨活 이 본초문헌에 기록된 기원식물이 아니라 할지라도 이처럼 강한 항산화 효능을 바탕으로 적절한 사용을 하는 것이 타당하다고 사료된다.
- 이러한 결과들을 종합할 때, 韓國獨活은 中國獨活보다 항산화 효능이 더 강하였다.
- 9%에 근접하였다. 항산화제로 널리 활용되고 있는 ascorbic acid의 초기 산화억제율은 52.4 %로 8.9% 및 4.8%인 韓國獨活 및 中國獨活보다 훨씬 높은 억제효율을 보였으나, 52시간에는 산화억제율이 저하되어 韓國獨活 및 中國獨活과 대등한 억제율을 보였고, 64시간 이후에는 韓國獨活 및 中國獨活의 산화 억제율이 오히려 더 높았다. Linoleic acid에 대한 韓國獨活 및 中國獨活의 산화억제 활성은 반응시간대별로 거의 유사하였으나, 전반적으로 韓國獨活이 中國獨活보다 다소 강한 산화억제활성을 보였다(Fig.
- 횐쥐에 에탄올을 투여하여 산화성 스트레스를 유발한 다음 간에서의 항산화 정도를 검사한 결과, 韓國獨活 및 中國獨活 투여군 모두 glutathione 농도가 증가하였으나, 韓國獨活 투여군의 증가폭이 中國獨活 투여군보다 더 컸고, 韓國獨活은 GSH-peroxidase 활성을 상승시켰으나, 中國獨活은 그러한 효과를 보이지 않았으며, SOD 활성은 두 투여군 모두 유의하게 저하되었으나 그 하강폭이 韓國獨活 투여군이 더 컸다. 그러나 두 투여군 모두 catalase 활성, ADH 활성 및 ALDH 활성 등에 대해서는 유의한 차이가 없었다.
- 유발한 대조군(control)과 비교하였다. 흰쥐의 간 (liver)을 절취하여 간에서의 산화적 스트레스의 지표가 되는 GSH 성분의 함량 또는 활성을 검사한 결과, 에탄올만 투여한 대조군의 GSH 농도는 6.7±0.6 ug/g tissue 였으며, 실리마린 투여군은 15.4±0.8 «g/g tissue로 대조군의 230.0%에 달하였다. 韓國獨活 전탕액 투여군의 GSH 농도는 12.
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