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문제 정의
- 薑黃이 수컷 Sprague-Dawleyrat에서 고환 절제술 후에 testosterone의 투여로 유발된 전립선비대증에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행한 본 연구에서 薑黃은 전립선의 선조직의 형태 및 기능보호 작용과 결합조직의 증식억제 작용을 가지는 것으로 관찰되었다. 또한 고용량의 薑黃투여로도 간․신독성이 유발되지 않아 薑黃은 전립선비대증의 치료에 있어 안전하게 사용할 수 있는 유용한 치료제로 기대된다.
- 薑黃이 수컷 Sprague-Dawleyrat에서 고환 절제술 후에 testosterone의 투여로 유발된 전립선비대증에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행한 연구에서 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 실험은 수컷 Sprague-Dawleyrat에서 고환절제 후 testosterone의 투여로 유발된 전립선비대증 모델에서 5α-reductase억제효과가 있는 finasteride 와 薑黃을 투여하여,각 군 간의 전립선 용적과 조직학적 변화를 측정하고 비교함으로써 전립선비대증에 미치는 薑黃의 영향을 알아보고자 하였다.
- 이에 저자들은 전립선비대증의 실험적 모델로 이용되는, 고환절제술 및 testosterone투여로 유발된 전립선비대증 모델 rat14,15의 전립선에 薑黃을 투여하여 관찰되는 혈액학적 변화 및 조직병리학적 형태의 변화를 분석하여, 薑黃의 전립선비대증에 미치는 효과 및 안전성을 검증하고자 하였다.
가설 설정
- (D) Curcuma 1.0 group: Stromal and epithelial cells proliferation is relatively mild.
제안 방법
- 30일간의 testosterone의 경피주사 및 薑黃과 finasteride의 경구투여가 체중에 미치는 영향을 관찰하였다. 연구 종료 시 체중은 정상군과 대조군에서는 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다.
- 대조군은 고환절제술 후 2일째부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서, 생리식염수 5㎖/㎏만을 경구 투여하였다. 薑黃투여군은 고환절제술 다음날부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서,薑黃을 생리식염수에 현탁하여 0.5g/㎏(Curcuma 0.5group)및 1.0g/㎏(Curcuma 1.0group)의 용량으로 zonde를 이용하여 1일 1회 경구로 주입하였다.양성 대조군인 finasteride투여 군은 고환절제술 다음날부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서 finasteride(Sigma,USA)를 생리식염수에 현탁하여 1㎎/㎏의 용량으로 경구 투여하였다(Table1).
- 적응기간을 마친 후 zoletil50(Virbac, France)을 1㎖/㎏의 용량으로 rat의 tailvein을 통해 주사하여 마취시킨 다음 rat의 음낭피부를 절개한 후 고환 상위부위의 정관(vasdeferense),혈관 및 신경 조직을 봉합사로 묶은 후 고환과 부고환을 절제하였다.고환절제 후 음낭피부를 봉합하고 1일간의 회복기를 거치게 하였다.고환절제술 후 2일째부터 testosterone(Wako, Japan)을 cornoil과 ethanol(9:1) 혼합액에 희석하여 30일 동안 20㎎/㎏ 용량으로 실험 동물에 피하주사하여 전립선 비대증을 유발하였다.
- 정상 대조군은 sham-castration으로 음낭을 절개하여 고환부분을 확인한 후 어떠한 조직의 절제나 결박 없이 그대로 봉합하고, 연구기간동안 어떤 약물도 투여하지 않았다. 대조군은 고환절제술 후 2일째부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서, 생리식염수 5㎖/㎏만을 경구 투여하였다. 薑黃투여군은 고환절제술 다음날부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서,薑黃을 생리식염수에 현탁하여 0.
- 동결 건조된 약제 1차 추출물 1g씩을 10㎖의 증류수로 용해시킨 후 95℃ 수조에서 2시간 동안 재차 가열 추출하였고, 이들 추출물을 원심분리용 시험관에 담아 14,000rpm에서 20분간 원심 분리하여上淸液을 수거하였다.이 上淸液을 직경 0.
- 마지막 투약 다음날 체중 측정과 채혈 후 rat를 희생시켜 전립선을 수술로 절제하였다. 전립선 주변의 지방 및 이물질을 제거한 후 전립선 상하 좌우의 최장 길이와 최단 길이를 측정하였고,전립선의 부피는 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.
- 본 연구의 실험군은 각 군당 6마리씩 정상군 (Normal group), 대조군(Control group),薑黃0.5g투여군(Curcuma 0.5 group),薑黃1.0g 투여군 (Curcuma 1.0 group)및 양성대조군인 finasteride 투여군(Finasteride group)의 5군으로 나누어 진행 하였다.
- 실험 시작 31일째에 rat의 심장에서 채혈하여 3,000rpm 에서 20분간 원심분리한 다음 上淸液을 얻어 -40℃에 보관한 후 AST(Aspartate Transaminase), ALT(Alanine Transaminase), γ-GT(γ-Glutamyltranspeptidase), BUN(Blood ureanitrogen)및 Cr(Creatinine)등의 생화학적 분석을 시행하였다.
- 실험 시작 31일째에 rat의 심장에서 채혈하여 3,000rpm에서 20분간 원심분리한 다음 혈청을 분리하여 -40℃에 보관한 후 DPC's Coat-A-Count testosterone RIA kit(Diagnostic Products Corporation, LosAngeles, CA,USA)를 이용하여 γ-count를 사용하여 측정하였다.
- 0group)의 용량으로 zonde를 이용하여 1일 1회 경구로 주입하였다.양성 대조군인 finasteride투여 군은 고환절제술 다음날부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서 finasteride(Sigma,USA)를 생리식염수에 현탁하여 1㎎/㎏의 용량으로 경구 투여하였다(Table1).
- 이후 microtome을 이용하여 4㎛의 두께로 각 전립선조직을 관상으로 절편한 다음 gelatin coated slide에 부착시켰다. 작성된 조직절편들은 조직염색을 위하여 xylene에 담가 파라핀을 제거하고 100%,95%,80%,70% 에탄올,증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 조직을 Hematoxyline-Eosin(HE) 으로 염색하여 광학현미경하에서 조직학적으로 평가하였다.
- 작성된 조직절편들은 조직염색을 위하여 xylene에 담가 파라핀을 제거하고 100%,95%,80%,70% 에탄올,증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 조직을 Hematoxyline-Eosin(HE) 으로 염색하여 광학현미경하에서 조직학적으로 평가하였다.
- 적응기간을 마친 후 zoletil50(Virbac, France)을 1㎖/㎏의 용량으로 rat의 tailvein을 통해 주사하여 마취시킨 다음 rat의 음낭피부를 절개한 후 고환 상위부위의 정관(vasdeferense),혈관 및 신경 조직을 봉합사로 묶은 후 고환과 부고환을 절제하였다.고환절제 후 음낭피부를 봉합하고 1일간의 회복기를 거치게 하였다.
- 전립선 조직의 변화를 관찰하기 위해 시행한 H&E 염색 표본에서 대조군은 정상군에 비해 광범위한 선조직의 증식과 섬유성 변성을 동반한 결합조직의 증식을 관찰할 수 있었다.
- 마지막 투약 다음날 체중 측정과 채혈 후 rat를 희생시켜 전립선을 수술로 절제하였다. 전립선 주변의 지방 및 이물질을 제거한 후 전립선 상하 좌우의 최장 길이와 최단 길이를 측정하였고,전립선의 부피는 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.
- 전립선의 무게는 전립선의 크기를 측정한 다음 전립선 주위의 습기를 제거한 후 전자저울을 이용 하여 측정하였다. 또한 체중당 전립선무게 비율은 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.
- 전립선의 크기와 무게를 측정하고 각 전립선을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하여 70%, 80%,95%,100% 에탄올에 차례로 담가 탈수시킨 후 파라핀 블록을 만들었다. 이후 microtome을 이용하여 4㎛의 두께로 각 전립선조직을 관상으로 절편한 다음 gelatin coated slide에 부착시켰다.
- 체중측정은 실험 개시일에 최초로 측정하였고, 이후 매주 1회씩과 실험종료일 마지막 sampling하기 전까지 측정하였다. 체중측정은 아침 사료 공급전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.
- 체중측정은 실험 개시일에 최초로 측정하였고, 이후 매주 1회씩과 실험종료일 마지막 sampling하기 전까지 측정하였다. 체중측정은 아침 사료 공급전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.5D,Korea)을 이용하여 시행하였고, 측정시 rat의 움직임에 따른 체중 오차를 최소화하기 위해 플라스틱 bowl에 rat 을 올려놓고,rat가 안정 상태에 이르렀을 때의 체중을 기록하였다.
대상 데이터
- 체중 200～220g의 수컷 Sprague-Dawley rat(중앙실험동물, Korea)를 구입하여 12시간씩 낮과 밤이 교대되는 환경으로 40～70%의 습도를 유지하고 cage에서 1주일간 사육하여 적응기를 거쳤으며,먹이와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.
데이터처리
- 각각의 수치는 평균 ±표준편차(mean±S.D.)로 표시했으며,양방 검정 유의도(two-tailed p value)는 p 값이 <0.05수준일 때를 기준으로 하였다.
- 통계학적 비교분석은 Graph Pad PRISM statistical package(ver 4.03, Graphpad software inc.,San Diego, USA)를 이용하여 각 군 간의 비교는 Mann-Whitneytest또는 Kruskal-Wallistest에 따른 Dunn’s post-hoctest로 사후 검증하였다.
이론/모형
- 혈중 testosterone의 측정은 radioimmunoassay (RIA)방법을 이용하여 측정하였다. 실험 시작 31일째에 rat의 심장에서 채혈하여 3,000rpm에서 20분간 원심분리한 다음 혈청을 분리하여 -40℃에 보관한 후 DPC's Coat-A-Count testosterone RIA kit(Diagnostic Products Corporation, LosAngeles, CA,USA)를 이용하여 γ-count를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 1.薑黃투여군은 대조군에 비해 체중을 증가시킨 반면 전립선의 무게를 줄였다.
- 2.薑黃투여군은 대조군에 비해 간독성 및 신독성을 나타내지 않았다.
- 3.薑黃투여군은 혈중 testosterone의 농도에 영향을 미치지 않았다.
- 4.薑黃투여군은 대조군에 비해 선포 세포 및 선포상피세포의 형태를 정상화시켰고, 결합조직의 증식 및 섬유화를 감소시켰다.
- 薑黃투여군에서 포상선이 대조군보다 더 둥근 형태로 약간의 위축이 관찰되었고, 선포 세포는 대조군보다 비교적 둥근 형태로 관찰되었으며, 선포 상피세포는 입방형으로 세포핵과 분비선들의 형태 및 공간이 대조군에 비해 정상적인 형태로 유지되었다.결합조직은 경도의 증식과 함께 섬유화 역시대조군에 비해 감소된 양상을 보였다.
- 고환 절제술 및 testosterone, 薑黃및 finasteride 의 투여가 간기능 및 신기능에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행한 혈액의 생화학 분석 결과, 연구 종료시점에서 정상군에 비해 대조군에서 통계학적으로 유의한 차이가 없었으며 대조군과 薑黃투여군 및 finasteride투여군은 AST와 ALT 항목에 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었지만 모두 정상 범위 이하였다(Table3).
- 고환 절제술 후 testosterone을 투여한 대조군에서는 정상군에 비해 광범위한 선조직의 증식이 관찰되었고, 선포 상피세포는 타원형 및 선형의 형태로 확장되어 불규칙하게 분포되어 있으며,결합조직은 심한 세포증식과 함께 여러 부위에서 섬유성 변성이 관찰되었다.
- 0g투여군만이 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이를 보였다.따라서 finasteride보다 薑黃1.0g투여가 비대된 전립선조직을 줄이는데 더 효과적이었다.
- 본 연구에서 ㎏당 1.0g까지 薑黃을 투여한 결과 간기능과 신기능에 별다른 악영향을 미치지 않았고, ALT 항목은 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 개선 효과를 보였으므로, 薑黃은 다량 투여시에도 인체내에서 간독성 및 신독성을 유발하지 않을 것으로 여겨진다. 전립선의 혈류역학적 구조상 약물 치료농도에 도달하기 위해서는 고용량의 약물투여가 요구된다는 점을 고려할 때,薑黃의 임상적 응용에 있어 그 안전성을 확인했다는 의의가 있다.
- 우선 체중의 변화를 관찰한 결과 정상군과 대조군간에 통계학적으로 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 연구 시작시와 종료시의 체중변화를 관찰한 결과 군 간의 차이를 관찰할 수 없었지만,薑黃1.0g투여군에서만 통계학적으로 유의하게 체중이 증가하였다.薑黃은 전통적으로 향신료로써 식욕을 돕는데 사용되었고 담즙배설을 촉진하는 효과 등이 입증되어21,이러한 체중증가는 薑黃으로 인한 섭취량 증가에 기인한다고 볼 수 있다.
- 연구 시작시와 종료시의 체중의 변화를 관찰한 결과,대조군의 109.4±16.0g에 비해 薑黃1.0g투여군의 체중변화는 129.5±9.3g로 통계학적으로 유의성 있는 증가를 보 였다(p<0.05,Fig.1).
- 30일간의 testosterone의 경피주사 및 薑黃과 finasteride의 경구투여가 체중에 미치는 영향을 관찰하였다. 연구 종료 시 체중은 정상군과 대조군에서는 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다.최종 체중의 경우 대조군과 각 薑黃투여군간 통계학적인 유의성이 있었으나 정상군을 포함한 비교에서는 통계학적 유의성은 관찰되지 않았다.
- 연구 종료 시점에서의 전립선 부피, 무게, 체중을 고려한 무게 모두 대조군은 정상군에 비해 통계학적으로 유의하게 증가되었다(p <0.01).
- 연구 종료 시점에서의 혈중 testosterone은 대조 군은 10.61±5.39ng/㎖으로 정상군의 3.62±1.29ng/㎖ 에 비해 통계학적으로 유의하게 증가되었다(p <0.01).
- 우선 체중의 변화를 관찰한 결과 정상군과 대조군간에 통계학적으로 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 연구 시작시와 종료시의 체중변화를 관찰한 결과 군 간의 차이를 관찰할 수 없었지만,薑黃1.
- 전립선 부피 및 무게는 정상군에 비해 대조군에서 모두 통계학적으로 유의하게 증가하였는데 이는 본 실험모델에서 계획한 전립선비대증이 제대로 형성됨을 보여주는 결과이다. 전립선 부피는 대조군에 비해 薑黃투여군과 Finasteride군 모두 통계학적으로 유의한 감소가 관찰되었고,체중을 고려한 전립선 무게비는 薑黃1.
- 전립선 부피 및 무게는 정상군에 비해 대조군에서 모두 통계학적으로 유의하게 증가하였는데 이는 본 실험모델에서 계획한 전립선비대증이 제대로 형성됨을 보여주는 결과이다. 전립선 부피는 대조군에 비해 薑黃투여군과 Finasteride군 모두 통계학적으로 유의한 감소가 관찰되었고,체중을 고려한 전립선 무게비는 薑黃1.0g투여군만이 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이를 보였다.따라서 finasteride보다 薑黃1.
- 전립선 부피의 경우 대조군에 비해서 薑黃투여군과 Finasteride군 모두 통계학적으로 유의한 감소가 관찰되었다(p<0.05,Table2).
- 연구 종료 시 체중은 정상군과 대조군에서는 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다.최종 체중의 경우 대조군과 각 薑黃투여군간 통계학적인 유의성이 있었으나 정상군을 포함한 비교에서는 통계학적 유의성은 관찰되지 않았다.연구 시작시와 종료시의 체중의 변화를 관찰한 결과,대조군의 109.
- 전립선의 혈류역학적 구조상 약물 치료농도에 도달하기 위해서는 고용량의 약물투여가 요구된다는 점을 고려할 때,薑黃의 임상적 응용에 있어 그 안전성을 확인했다는 의의가 있다. 혈중 testosterone농도를 측정한 결과, 정상군에 비해 대조군에서 통계학적으로 유의하게 증가된 결과를 보였고, 薑黃투여군과 Finasteride군은 대조군과 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 외부적으로 주입한 testosterone양이 정상 rat 에서 분비되는 양보다 3배정도 많았음을 의미한다.
후속연구
- 薑黃이 수컷 Sprague-Dawleyrat에서 고환 절제술 후에 testosterone의 투여로 유발된 전립선비대증에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행한 본 연구에서 薑黃은 전립선의 선조직의 형태 및 기능보호 작용과 결합조직의 증식억제 작용을 가지는 것으로 관찰되었다. 또한 고용량의 薑黃투여로도 간․신독성이 유발되지 않아 薑黃은 전립선비대증의 치료에 있어 안전하게 사용할 수 있는 유용한 치료제로 기대된다.아울러 향후 본 실험결과를 바탕으로 薑黃의 전립선 세포자연사를 유도하는 기전에 대한 실험연구 및 전립선비대증 환자에 대한 추가적인 임상연구가 필요하리라 사료된다.
- 또한 고용량의 薑黃투여로도 간․신독성이 유발되지 않아 薑黃은 전립선비대증의 치료에 있어 안전하게 사용할 수 있는 유용한 치료제로 기대된다.아울러 향후 본 실험결과를 바탕으로 薑黃의 전립선 세포자연사를 유도하는 기전에 대한 실험연구 및 전립선비대증 환자에 대한 추가적인 임상연구가 필요하리라 사료된다.
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