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문제 정의
- 봉독이 고환절제술 및 testosterone 투여로 유발된 전립선비대증 모델 rat의 체중, 전립선의 부피, 무게 및 체중 당 전립선 비율, 간기능, 신기능, 테스토스테론 농도, 조직병리학적 변화에 미치는 영향을 관찰한 바, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 등에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 봉독의 疏通氣血, 活血化瘀 효능에 근거하여 봉독 약침이 전립선 비대증에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.
- 이에 저자는 전립선비대증에 대한 봉독의 효능과 안전성을 입증하기 위해 고환절제술 및 testosterone 투여로 유발된 전립선비대증 모델 rat16-17을 이용하여, 혈액학적 변화 및 조직병리학적 형태의 변화를 분석하여 봉독의 효능을 검증하고, 이에 따른 전립선비대증의 임상적 치료의 근거를 마련하고자 한다.
- 전립선 비대증을 유발시킨 실험동물에 5-reductase 억제 효과가 있는 finasteride와 봉독 약침을 사용하여, 각 실험군 간의 전립선 용적과 혈액학적 변화 및 조직학적 변화를 측정하고 비교함으로써 전립선 비대증에 미치는 봉독의 영향을 알아보고자 하였다.
가설 설정
- (2) Control group : Acinar epitherial cells are were flattened irregularity. Duct cells were flattened to low cuboidal or squamous type.
제안 방법
- 적응기간을 마친 후, zoletil 50(Virbac, France) 을 1 ml/kg의 용량으로 rat의 tail vein을 통해 주사하여 마취시킨 다음, rat의 음낭피부를 절개한 후 고환 상위 부위의 정관(vas deferense), 혈관 및 신경조직을 봉합사로 묶은 후 고환과 부고환을 절제하였다. 고환절제 후 음낭피부를 봉합하고, 1일간의 회복기를 거치게 하였다. 고환절제술 후 2일째부터 testosterone(Wako, Japan)을 corn oil과 ethanol (9:1) 혼합액에 희석하여 30일 동안 24시간 간격으로 매일 1회 20 mg/kg 용량으로 실험동물에 피하 주사하여 전립선 비대증을 유발하였다.
- 고환절제 후 음낭피부를 봉합하고, 1일간의 회복기를 거치게 하였다. 고환절제술 후 2일째부터 testosterone(Wako, Japan)을 corn oil과 ethanol (9:1) 혼합액에 희석하여 30일 동안 24시간 간격으로 매일 1회 20 mg/kg 용량으로 실험동물에 피하 주사하여 전립선 비대증을 유발하였다.
- 정상군은 sham-castration으로 음낭을 절개하여 고환부분을 확인한 후 어떠한 조직의 절제나 결박없이 그대로 봉합하고, 연구 기간 동안 어떤 약물도 투여하지 않았다. 대조군의 rat에게는 고환절제술 후 2일째부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서, 생리식염수 5 ml/kg만을 매일 1회 경구투여하였다. 봉독 약침군은 고환절제술 다음날부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서, 10,000:1로 희석한 봉독을 고환절제술 이후 14일 째에 zoletil 50을 1 ml/kg의 용량으로 rat의 tail vein을통해 주사하여 마취시킨 다음, rat의 요도 위쪽 상복부쪽 피부를 절개하여 전립선을 노출시킨 다음, 전립선의 ventral lobe내에 1 cc syringe를 이용하여각 엽 당 0.
- 양성 대조군 finasteride 투여군은 고환절제술 다음날부터 testostero ne을 30일간 피하로 주사하면서 finasteride (Sigma, USA)를 생리식염수에 현탁하여 1 mg/kg의 용량으로 매일 1회 경구 투여하였다. 본 연구에서 finasteride 투여군은 매일 1회 경구 투여하였고, 봉독 약침은 전립선 비대조직에 직접 주사되어 효과를 나타내므로 1회 투여로 약물 경구투여와 유사한 효과를 나타낼 것으로 판단하여 실험을 구성하였다.
- 본 연구의 실험군은 각 군당 6마리씩 정상군(Normal group), 대조군(Control group), 봉독 약침군(BV 1.0 group) 및 양성 대조군인 finasteride 투여군 (Finasteride gro up)의 4군으로 나누었다.
- 대조군의 rat에게는 고환절제술 후 2일째부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서, 생리식염수 5 ml/kg만을 매일 1회 경구투여하였다. 봉독 약침군은 고환절제술 다음날부터 testosterone을 30일간 피하로 주사하면서, 10,000:1로 희석한 봉독을 고환절제술 이후 14일 째에 zoletil 50을 1 ml/kg의 용량으로 rat의 tail vein을통해 주사하여 마취시킨 다음, rat의 요도 위쪽 상복부쪽 피부를 절개하여 전립선을 노출시킨 다음, 전립선의 ventral lobe내에 1 cc syringe를 이용하여각 엽 당 0.3 cc씩 주사하고 피부를 봉합하였다. 양성 대조군 finasteride 투여군은 고환절제술 다음날부터 testostero ne을 30일간 피하로 주사하면서 finasteride (Sigma, USA)를 생리식염수에 현탁하여 1 mg/kg의 용량으로 매일 1회 경구 투여하였다.
- 부피와 무게를 측정 후 각 전립선을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정한 후 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올에 차례로 담가 탈수시킨 후 파라핀 블록을 만들었다. 이후 microtome을 이용하여 4 ㎛의 두께로 각 전립선조직을 관상으로 절편한 다음 gelatin coated slide에 부착시켰다.
- 실험 시작 31일째에 rat의 심장에서 채혈하여 3,000 rpm에서 20분간 원심 분리한 다음 혈청을 분리하여 –40℃에 보관한 후 DPC's Coat-A-Count testosterone RIA kit (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA)를 이용하여 γ-count를 사용하여 측정하였다.
- 실험 시작 31일째에 rat의 심장에서 채혈하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리한 다음 上淸液을 얻어 -40℃에 보관한 후 AST(aspartate transaminase), ALT (alanine transaminase), BUN(blood urea nitrogen) 및 creatinine 등의 생화학적 분석을 시행하였다.
- 실험 시작 31일째에 체중 측정과 채혈 후 rat를 희생시켜 전립선을 수술로 절제하여 전립선 주변의 지방 및 이물질을 제거한 후 전립선 상하 좌우의 최장 길이와 최단 길이를 측정하였다. 전립선의 부피는 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.
- 3 cc씩 주사하고 피부를 봉합하였다. 양성 대조군 finasteride 투여군은 고환절제술 다음날부터 testostero ne을 30일간 피하로 주사하면서 finasteride (Sigma, USA)를 생리식염수에 현탁하여 1 mg/kg의 용량으로 매일 1회 경구 투여하였다. 본 연구에서 finasteride 투여군은 매일 1회 경구 투여하였고, 봉독 약침은 전립선 비대조직에 직접 주사되어 효과를 나타내므로 1회 투여로 약물 경구투여와 유사한 효과를 나타낼 것으로 판단하여 실험을 구성하였다.
- 이후 microtome을 이용하여 4 ㎛의 두께로 각 전립선조직을 관상으로 절편한 다음 gelatin coated slide에 부착시켰다. 작성된 조직절편들은 조직염색을 위하여 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 조직을 Hematoxyline-Eosin(HE)으로 염색하여 광학현미경하에서 조직학적으로 평가하였다.
- 작성된 조직절편들은 조직염색을 위하여 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 조직을 Hematoxyline-Eosin(HE)으로 염색하여 광학현미경하에서 조직학적으로 평가하였다.
- 적응기간을 마친 후, zoletil 50(Virbac, France) 을 1 ml/kg의 용량으로 rat의 tail vein을 통해 주사하여 마취시킨 다음, rat의 음낭피부를 절개한 후 고환 상위 부위의 정관(vas deferense), 혈관 및 신경조직을 봉합사로 묶은 후 고환과 부고환을 절제하였다. 고환절제 후 음낭피부를 봉합하고, 1일간의 회복기를 거치게 하였다.
- . 전립선비대증의 병리기전 및 약물의 유효성을 검증하기 위한 실험동물 model을 만들기 위하여 Sprague-Dawley rat에 고환절제술후 testosterone을 피하 주사한다. 이 경우 인위적인 남성호르몬의 차단과 투여를 통해 조직병리학적으로 인간의 전립선비대증과 매우 유사하게 발현되어, 전립선비대증에 대한 유용한 실험적 모델로 사용되고 있다16-17.
- 전립선의 무게는 전립선의 크기를 측정한 다음 전립선 주위의 습기를 제거한 후 전자저울을 이용하여 측정하였다.
- 체중 측정은 실험 개시일에 최초 측정을 하였고, 이후 매주 1회씩과 실험종료일 마지막 sampling하기 전까지 측정하였다. 체중 측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.
- 체중 측정은 실험 개시일에 최초 측정을 하였고, 이후 매주 1회씩과 실험종료일 마지막 sampling하기 전까지 측정하였다. 체중 측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.5D, Korea) 을 이용하여 시행하였으며, 측정시 rat의 움직임에 따른 체중 오차를 최소화하기 위해 플라스틱 bowl에 rat을 올려놓고, rat가 안정 상태에 이르러 나타나는 체중을 기록하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 봉독(Bee Venom)은 microchip을 이용한 전자파 발생장치로 벌을 자극하여 채취한 봉독을 가공, 건조하여 얻은 건조 봉독을 정선하여 생리식염수에 10,000:1의 비율로 희석하여 사용하였다.
- 체중 200～220 g의 수컷 Sprague-Dawley rat(중앙실험동물, Korea)을 구입하여 12시간씩 낮과 밤이 교대되는 환경으로 40～70%의 습도를 유지하며 cage에서 1주일간 사육하여 적응기를 거쳤으며, 먹이와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.
데이터처리
- 각 군간의 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 이어 Tuckey's post-hoc test로 사후 검증하였다.
- 각각의 수치는 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 표시했으며, 양방 검정 유의도(Two-tailed p value)는 p값이 <0.05 수준일 때를 기준으로 하였다.
- 통계학적 비교분석은 GraphPad PRISM statistical package(ver 2.00, Graphpad software inc., San Diego, USA)를 이용하였다. 각 군간의 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 이어 Tuckey's post-hoc test로 사후 검증하였다.
이론/모형
- 고환 절제술 및 testosterone 투여 후 봉독 약침이 혈중 testosterone 농도에 미치는 영향을 알아보기 위해 RIA 분석법을 이용하여 분석하였다. 대조군은 13.
- 혈중 testosterone의 측정은 radioimmuno assay (RIA) 방법을 이용하여 측정하였다. 실험 시작 31일째에 rat의 심장에서 채혈하여 3,000 rpm에서 20분간 원심 분리한 다음 혈청을 분리하여 –40℃에 보관한 후 DPC's Coat-A-Count testosterone RIA kit (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA)를 이용하여 γ-count를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 1. 전립선의 무게, 체중당 전립선의 비율은 봉독 약침군에서 대조군에 비해 유의성은 관찰되지 않았으나 체중, 전립선의 부피는 봉독 약침군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
- 2. 간기능과 신기능에 미치는 영향을 측정한 결과 봉독 약침군에서는 대조군에 비해 AST의 감소, ALT의 상승이 나타났으나 유의성은 관찰되지 않았고, BUN의 유의한 감소가 관찰되었다.
- 3. 혈중 testosterone의 농도는 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였으나 유의성은 관찰되지 않았다.
- 4. 전립선의 조직병리학적 변화는 봉독 약침군에서 epithelial elements의 luminal cells은 대조군에 비해 비교적 둥근 형태로 경도의 위축이 관찰되었고, duct cells는 대조군에 비해 정상군에 가까운 형태가 관찰되었고, 결합 조직 및 stromal elements 의 증식이 감소되었다.
- 고환 절제술 후 testosterone를 투여한 대조군에 서는 정상군에 비해 광범위한 epithelial elements의 luminal cells의 flatten이 관찰되었고, acinal cells은 타원형 및 선형의 형태로 위축되어 불규칙하게 분포되어 있으며, duct cell 역시 편평세포 형태로 위축되어 있었고, stromal elements에서의 증식이 관찰되었다.
- 대조군은 13.04 ± 3.33 pg/ml로 정상군의 3.61 ± 1.28 pg/ml에 비해 유의하게 증가하였으며(P<0.01), 봉독 약침군은 11.53 ± 5.22 pg/ml로 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다.
- 본 연구에서 전립선 부피, 무게 및 체중 당 전립선 비율은 정상군에 비해 대조군에서 모두 통계학적으로 유의하게 증가하였는데, 이는 본 실험모델에서 계획한 전립선비대증이 제대로 형성됨을 보여주는 결과이다.
- 봉독 약침군에서는 epithelial elements의 luminal cells는 대조군보다 비교적 둥근 형태로 경도의 위축이 관찰되었고, duct cell은 입방형으로 세포핵과 분비선들의 형태 및 공간이 대조군에 비해 정상군에 가까운 형태를 유지하고 있었으며, 결합 조직 및 stromal elements에서의 증식이 감소된 양상을 보였다.
- 정상군에 비해 대조군에서 AST, ALT의 증가가 관찰되었으나 통계학적 유의성은 없었다. 봉독 약침군은 대조군에 비해 AST의 감소, ALT의 증가가 관찰되었으며, finasteride 투여군은 대조군에 비해 AST 및 ALT의 감소가 관찰되었으나 모든 항목에서 통계학적 유의성은 없었다.
- 봉독 약침이 대조군에 비하여 전립선의 무게에 별다른 영향을 미치지 않았다는 결과와 전립선의 무게는 잔존 분비액의 양에 의해 결정된다는 점을 고려할 때, 비록 봉독이 전립선 결합 조직 및 상피 세포의 기능과 형태를 유지 보호해주는 작용은 있으나 전립선액 분비에는 영향을 미치는 않는다는 것으로 추정할 수 있다(Table 1, Table 2).
- 봉독 약침이 전립선의 조직학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 시행한 H&E 염색 표본의광학 현미경상 관찰에서, 정상군은 acinar gland가 둥근 형태로 위축없이 잘 유지되고 있었고, duct epithelial cells 역시 원주형의 형태로 정상 세포핵과 분비선들이 정상 형태를 유지하고 있었으며, 결합 조직의 증식이나 섬유화 및 임파구와 단핵구의 침윤은 관찰되지 않았다.
- 봉독이 고환절제술 및 testosterone 투여로 유발된 전립선비대증에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행한 본 연구에서, 전립선의 선 조직 보호 작용과 결합조직 증식억제 작용이 관찰됨에 따라 봉독이 전립선비대증을 개선시킬 가능성이 있음을 확인하였다. 향후 봉독의 전립선 조직 내 호르몬과 수용체, 여러 가지 성장인자들의 작용, 임상적인 적용 등의 추가 연구가 필요할 것으로 생각한다.
- 전립선의 조직학적 변화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 시행한 H&E 염색 표본에서, 대조군은 정상군에 비해 luminal cells의 광범위한 위축, 선포세포의 타원형 및 선형 형태로 위축, duct cell의 편평 세포 형태로 위축, stromal elements에서의 증식이 관찰되어 인간의 전립선비대증과 유사한 병태를 나타냄을 관찰할 수 있었다. 세포의 형태, 세포핵, 분비선들의 형태는 봉독 약침군에 비해 finasteride 투여군에서 정상군에 가까운 형태로 유지되었고, 결합 조직 및 stromal elements은 봉독 약침군에서 감소된 양상을 보인데 비해 finasteride 투여군에서는 경도의 증식과 섬유화가 관찰되었다. 봉독 약침으로 결합조직 면적 비율의 증가가 감소하였는데, 이러한 결과는 봉독이 전립선 선포 상피세포의 보호작용과 더불어 결합조직의 증식 억제 작용을 동시에 갖는다는 것을 의미한다.
- 실험군에서의 연구 종료 후 체중감소는 대조군에 비해 봉독 약침군에서 286.5 ± 15.3 g (P<0.01) 및 finasteride 투여군에서 297.3 ± 23.8 g (P<0.05)으로 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Table 1).
- 전립선 부피는 대조군에서 2.66 ± 0.36 cm3으로 정상군의 1.02 ± 0.54 cm3에 비해 유의하게 증가하였으며(P<0.001), 봉독 약침군은 1.78 ± 0.85 cm3으로 대조군에 비해 유의하게 감소하였고(P<0.05), 양성 대조군인 finasteride 투여군 역시 1.68 ± 0.72 cm3으로 유의하게 감소하였다(P<0.05).
- 전립선의 무게는 대조군에서 1.42 ± 0.31 g으로 정상군의 0.56 ± 0.06 g에 비해 유의하게 증가하였으며(P<0.001), 봉독 약침군은 1.13 ± 0.22 g으로 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였으나 통계학적 유의성은 관찰되지 않았고, finasteride 투여군은 0.99 ± 0.25 g으로 유의하게 감소하였다(P<0.05).
- 전립선의 부피는 대조군에 비해 봉독 약침군(P<0.05)과 finasteride 투여군(P<0.05) 모두 유의한 감소를 보였고, 전립선 무게 및 체중 당 전립선 비율은 봉독 약침군에서 감소되는 경향을 보였으나 통계적으로 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.
- 전립선의 조직학적 변화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 시행한 H&E 염색 표본에서, 대조군은 정상군에 비해 luminal cells의 광범위한 위축, 선포세포의 타원형 및 선형 형태로 위축, duct cell의 편평 세포 형태로 위축, stromal elements에서의 증식이 관찰되어 인간의 전립선비대증과 유사한 병태를 나타냄을 관찰할 수 있었다.
- 정상군에 비해 대조군에서 AST, ALT의 증가가 관찰되었으나 통계학적 유의성은 없었다. 봉독 약침군은 대조군에 비해 AST의 감소, ALT의 증가가 관찰되었으며, finasteride 투여군은 대조군에 비해 AST 및 ALT의 감소가 관찰되었으나 모든 항목에서 통계학적 유의성은 없었다.
- 체중의 변화를 관찰한 결과 정상군과 대조군은 유의성 있는 차이를 보이지 않았으나, 대조군에 비하여 봉독 약침군(P<0.01)과 finasteride 투여군(P<0.05) 모두 통계적으로 유의하게 감소하였다.
- 최종적으로 체중당 전립선의 비율은 대조군에서 0.44 ± 0.10으로 정상군의 0.16 ± 0.03에 비해 유의하게 증가하였으며(P<0.001), 봉독 약침군은 0.37 ± 0.09로 뚜렷한 차이가 없었고, finasteride 투여군도 0.39 ± 0.07으로 통계학적 유의성은 관찰되지 않았다(Table 2).
- 혈중 BUN 농도는 정상군에 비해 대조군에서 유의하게 상승한 반면(P<0.05), 봉독 약침군에서는 유의하게 감소되었고(P<0.05), Finasteride 투여군에서는 유의한 변화가 없었다.
- 05), Finasteride 투여군에서는 유의한 변화가 없었다. 혈중 creatinine 농도는 정상군 및 대조군 사이의 뚜렷한 차이는 없었으며, 봉독 약침군 및 finasteride 투여군 모두에서 유의한 차이는 없었다(Table 3).
후속연구
- 임상적으로 널리 사용되는 finasteride는 발기부전, 성욕감퇴 등의 성기능 저하와 더불어 혈압강하, 현훈, 빈맥 등의 부작용을 유발할 수 있다는 보고가 있다5-7. 따라서 장기적으로 유의한 부작용 없이 충분한 효과를 얻을 수 있고, 수술시 경제적 문제 등을 고려할 때, 최근 약물요법, 요도 성형 카테터8-9, 금속 스텐트, 온열요법10 등의 비수술적 치료 및 저침습적 치료에 대한 관심이 증가하고 있어 기존의 치료 방법 이외에 폭넓은 선행연구가 필요하다.
- 봉독 약침군이 finasteride 투여군에 비해 유효하게 결합조직의 과다증식을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 볼 때, 기존의 전립선비대증 치료법들이 가지고 있는 여러 문제점을 보완함으로써 전립선비 대증 치료법의 한 영역으로 이용될 수 있다. 아울러 향후 본 실험결과를 바탕으로 봉독이 전립선 조직의 세포자연사에 관여하는 기전에 관한 추가적인 실험연구 및 전립선비대증 환자에 대해서도 추가적으로 임상연구가 필요하리라 생각한다.
- 최근 실험연구를 통하여 melittin이 전립선암의 성장과 전이를 억제한다는 사실이 확인됐다. 봉독 약침의 주요성분인 melittin이 인간 전립선암세포주인 DU-145의 세포자연사를 유발함으로써 세포증식억제 효과가 있음을 나타내어14-15, 향후 봉독이 전립선암의 예방과 치료에 대한 효과적인 치료제 개발에 도움이 될 것임을 보여주었다. 임상에서 활용되고 있는 각종 봉독 약침의 임상적인 효능에 관해서는 여러 연구 보고가 있었으나 아직까지 봉독이 세포 수준에 미치는 영향에 관한 연구 보고는 많지 않은 실정이다.
- 봉독 약침군이 finasteride 투여군에 비해 유효하게 결합조직의 과다증식을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 볼 때, 기존의 전립선비대증 치료법들이 가지고 있는 여러 문제점을 보완함으로써 전립선비 대증 치료법의 한 영역으로 이용될 수 있다. 아울러 향후 본 실험결과를 바탕으로 봉독이 전립선 조직의 세포자연사에 관여하는 기전에 관한 추가적인 실험연구 및 전립선비대증 환자에 대해서도 추가적으로 임상연구가 필요하리라 생각한다.
- 봉독이 고환절제술 및 testosterone 투여로 유발된 전립선비대증에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행한 본 연구에서, 전립선의 선 조직 보호 작용과 결합조직 증식억제 작용이 관찰됨에 따라 봉독이 전립선비대증을 개선시킬 가능성이 있음을 확인하였다. 향후 봉독의 전립선 조직 내 호르몬과 수용체, 여러 가지 성장인자들의 작용, 임상적인 적용 등의 추가 연구가 필요할 것으로 생각한다.
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