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문제 정의
- 노로바이러스는 인간에게 급성위장염을 일으키는 식중독 바이러스로, 최근 전세계적으로 노로바이러스 식중독 사고가 증가하고 있다. 따라서 본 연구에서는 다양한 생리 활성 작용이 있다고 알려진 향신료, 차(茶), 식물성 한약재 둥 11종의 천연물질을 대상으로 노로바이러스의 대체모델인 feline calicivirus (FCV)에 대한 항바이러스 활성을 조사하였다. 각 추출물에 대한 항바이러스 활성은 end pointdilution assay 방법인 50% tissue culture infectious dose(TCID50)으로 바이러스 감염가를 측정하였다.
- 본 연구에서는 다양한 생리활성 작용이 있다고 알려진 여러 향신료 및 식물성 한약재를 대상으로 노로바이러스의 대체모델인 feline calidvirus0)] 대한 항바이러스 활성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 사회경제적으로 막대한 피해를 일으키고 있는 노로바이러스를 효과적으로 제어시킬 수 있는 방안을 찾고자 norovirus의 대체 모델인 feline calidvirus를 이용하여가장 흔하게 접할 수 있는 향신료, 차(茶), 식물성 한약재 둥 11종의 여러가지 천연물질을 대상으로 농도 및 시간별로 FCV를 효과적으로 억제시킬 수 있는 항바이러스 활성을 가지고 있는 물질을 탐색하였다. 이상의 결과를 조합하여 보면 녹차와 홍화씨의 추출물이 FCV에 대한 항바이러스 효과가 뛰어난 것으로 나타났으며, 그중 녹차 추출물의 항바이러스 활성이 가장 강하게 나타났다.
제안 방법
- 각 추출물에 대한 FCV의 숙주세포인 CrFK cell의 세포독성은 96 well culture plate 표면에 CrFK cell0] 부착하여 증식하게 되는 세포부착성 시험(cell attachment test)으로 측정하였다[14, 19]. 각 추출물을 25, 12.
- 각 추출물에 대한 FCV의 숙주세포인 CrFK cell의 세포독성은 96 well culture plate 표면에 CrFK cell0] 부착하여 증식하게 되는 세포부착성 시험(cell attachment test)으로 측정하였다[14, 19]. 각 추출물을 25, 12.5, 6.25, 3.13 및 1.56 mg/ml의 농도로 함유하는 세포배양액내에 세포(6.3X103 cell/ml)를 부 유시 켜, 96 well plate에 4 well 씩 1 set로 하여 접종한 다음,3일간 배양하면서 매일 세포가 부착, 증식 상태를 현미경으로 관찰하였다. 이때 세포가 부착, 증식하면서 독성을 일으키지 않는 최대농도를 MNCC (maxiumum non cytotoxic concen- tration)으로 정하였다[14].
- 각 추출물의 CrFK cell에 대한 세포독성은 25 mg/ml의 농도부터 2배 단계로 희석하여 추출물을 가하지 않은 well의 세 포의 부착정도와 비교하였다. 그 결과, 11종의 항신료, 차 및 식물성 한약재의 메탄올 추출물들은 CrFK cell에 대해 서로 다른 세포독성을 나타내었다(Table 2).
- 3x10s cell/well 되도록 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 배양하여 mono- layer을 얻는다. 각 추출물의 항바이러스 활성은 약 105 TODso/ml로 희석된 FCV를 각 추출물과 농도별로 1:1로 혼합 하여 실온에서 3, 5, 24시간별로 실온에서 반응시킨다. 반응 종료 후 virus를 maintenance medium에 10진법으로 희석하고 CrFK cell이 monolayer로 형성된 96 well plate에 growth medium을 aspirate를 이용하여 제거한 후, 희석된 바이러스를 25 μ1씩 8개의 well에 접종하고 37℃, 5% CO2의 incubator 90분 동안 방치하여 FCV를 CrFK cell에 감염 시 키고, 각 weU에 100 μ1의 maintenance medium을 첨가한다.
- 김치 부재료로 많이 사용되고 있으며 항균작용을 가지는 것으로 알려진 마늘, 생강 및 고춧가루 추출물[1 이의 FCV에 대한 항바이러스 활성을 알아보기 위하여, 각 추출물을 농도별로 FCV 희석액과 반응시키고 CrFK cell에 감염시킨 후 FCV 에 대한 추출물의 항바이러스 활성을 log TCIDso/ml 값으로 조사하였다(Table 3). 향신료 추출물질을 함유하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 마늘의 경우 25 mg/ml의 농도에서도 TQDso 값이 거의 감소하지 않아 항바이러스 활성이 나타나지 않았으며, 생강과 고춧가루 추출물의 경우도 마늘 추출물과 마찬가지로 항바이러스 활성은 나타나지 않았다.
- 천연 식물자원 11종의 항바이러스 활성에 대한 탐색 결과, 녹차 추출물과 홍화씨 추출물이 FCV에 대한 항바이러스 효과가 뛰어난 것으로 조사되었다(Table 3). 녹차추출물의 경우6.25 mg/ml에서 3시간 이상 반응시킨 경우 FCV가 완전히 불활성화되었으며, 홍화씨 추출물위 경우 6.25 mg/ml에서 5시간 이상 반응시킨 경우 FCV가 완전히 불활성화되는 것으로 나타나 반응시간을 단축하여 반응 시간대에 따른 항바이러스 활성을 조사하였다(Table 4).
- 각 추출물의 항바이러스 활성은 약 105 TODso/ml로 희석된 FCV를 각 추출물과 농도별로 1:1로 혼합 하여 실온에서 3, 5, 24시간별로 실온에서 반응시킨다. 반응 종료 후 virus를 maintenance medium에 10진법으로 희석하고 CrFK cell이 monolayer로 형성된 96 well plate에 growth medium을 aspirate를 이용하여 제거한 후, 희석된 바이러스를 25 μ1씩 8개의 well에 접종하고 37℃, 5% CO2의 incubator 90분 동안 방치하여 FCV를 CrFK cell에 감염 시 키고, 각 weU에 100 μ1의 maintenance medium을 첨가한다. 추출물의 항바이러스 활성은 FCV 희석액을 일정시간 추출물과 반응시킨 후CrFK cell에서 측정된 TCID50로 나타내었다.
- 그 결과, 11종의 항신료, 차 및 식물성 한약재의 메탄올 추출물들은 CrFK cell에 대해 서로 다른 세포독성을 나타내었다(Table 2). 생강, 로즈마리, 탱자, 당귀, 녹차 추출물의 경우 6.25 mg/ml의 농도에서는 약한 독성을 나타내었으나 세포의 부착 및 성장에는 거의 영향을 미치지 않아 MNCC를 6.25 mg/ml로 정하였다. 천궁, 홍화씨 메탄올 추출물의 경우 12.
- 약리작용 및 항균활성이 있다고 알려진 그 밖의 식물성 한 약재 6종을 메탄올로 추출하여 노로바이러스의 대체모델인 FCV에 대한 항바이러스 활성을 조사하였다. FCV에 대한 항바이러스 활성을 조사한 결과 천궁, 헛개, 탱자, 당귀 및 진피의 경우 MNCC 농도에서 대조군과 비교하였을 때, log TaDw/ml 값이 감소하는 경향을 나타내지 않아 항바이러스 작용은 매우 미약한 것으로 관찰되었다(Table 3).
- 1, right). 이를 이용하여 바이러스 감염가는 FCV에 감염시킨 세포의 5일 배양후, 50%이상 CPE가 나타난 well의 희석단계를 log TCIDso/nl값으로 표시하였다.
- 일반적으로 흔히 음용되고 있는 로즈마리와 녹차의 FCV에 대한 항바이러스 활성을 조사하였다. 로즈마리 추출물의 경우 FCV에 대한 항바이러스 활성을 관찰한 결과 6.
대상 데이터
- FCV에 대한 항바이러스 시험에 사용될 천연식물자원은 향 신료 3종(마늘, 생강, 고춧가루), 차(茶) 2종(로즈마리, 녹차) 그리고 식물성 한약재 6종(천궁, 홍화씨, 헛개, 탱자, 당귀, 진피) 둥 총 11종의 물질을 시험에 사용하였다(Table 1). 그 중 향신료와 녹차는 국내 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용하였으며, 그 외의 식물자원은 2008년 4월 부산 부전시장에서 구입하였다.
- 농축하였다. 각 추출물을 250 mg/ml의 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO; Kanto, Japan) 에 녹인 다음 045 μm millipore filter로여과한 것을 실험에 사용하였다.
- FCV에 대한 항바이러스 시험에 사용될 천연식물자원은 향 신료 3종(마늘, 생강, 고춧가루), 차(茶) 2종(로즈마리, 녹차) 그리고 식물성 한약재 6종(천궁, 홍화씨, 헛개, 탱자, 당귀, 진피) 둥 총 11종의 물질을 시험에 사용하였다(Table 1). 그 중 향신료와 녹차는 국내 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용하였으며, 그 외의 식물자원은 2008년 4월 부산 부전시장에서 구입하였다. 각 천연물질들은 건조중량 10배량의 95% methanol로 45℃에서 3시간 동안 3회 반복하여 교반 추출하였고, 이를 여 과한 후 60℃ 수욕 상에서 rotary evaporator로 감압 .
- 본 연구에 사용한 feline calidvirus (FCV) VR-782와 FCV의 숙주세포인 Crandell-reese feiline kidney (CrFK) CCL-94는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양받아 사용하였다. CrKF 세포는 75 cm2 tissue culture falsk (Coming, USA)에서 10% fetal bovine serum (FBS; GIBCO/ BRL, USA), 100 U/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin0] 포함된 Dulbecco's Modified Eagled's Medium (DMEM; GIBCO/BRL, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였으며, 세포가 90% 이상 monolayer을 형성하면 계대 배 양 하여 사용하였다.
이론/모형
- FCV의 항바이러스 시험은 end point dilution assay 방법인 50% tissue culture infectious dose (TCID50)으로 바이러스 감염가를 측정하였다[8, 9]. 바이러스 감염가는 바이러스 감염 후 배양 5일째에 바이러스에 의해 lysis된 세포를 가시화한 후 50% 이상 CPE가 나타난 well의 희석단계를 Reed-Muench method로 산정하고 log TCHAo/ml로 표시하였다[10].
- 따라서 본 연구에서는 다양한 생리 활성 작용이 있다고 알려진 향신료, 차(茶), 식물성 한약재 둥 11종의 천연물질을 대상으로 노로바이러스의 대체모델인 feline calicivirus (FCV)에 대한 항바이러스 활성을 조사하였다. 각 추출물에 대한 항바이러스 활성은 end pointdilution assay 방법인 50% tissue culture infectious dose(TCID50)으로 바이러스 감염가를 측정하였다. 녹차(QmdUa sinensisL.
- FCV의 항바이러스 시험은 end point dilution assay 방법인 50% tissue culture infectious dose (TCID50)으로 바이러스 감염가를 측정하였다[8, 9]. 바이러스 감염가는 바이러스 감염 후 배양 5일째에 바이러스에 의해 lysis된 세포를 가시화한 후 50% 이상 CPE가 나타난 well의 희석단계를 Reed-Muench method로 산정하고 log TCHAo/ml로 표시하였다[10].
성능/효과
- 5 mg/ml의 농도에서는 30분 만에 2 log 정도가 감소하였고, 반응시간이 경과함에 항바이러스 활성이 점차 증가하여 3시간 이상 경과한 경우 FCV가 불활성화되는 것으로 조사되었다. 6.25 mg/ml의 농도에서는 3시간이 지나야 2 log 이상이 감소하는 것으로 나타나 녹차보다는 항바이러스 활성이 약하지만 농도 및 반응시간에 유의적으로 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다(Table 4). 향후, 홍화씨 추출물의 FCV에 항바이러스 활성을 나타내는 물질에 대한 세부적인 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
- 약리작용 및 항균활성이 있다고 알려진 그 밖의 식물성 한 약재 6종을 메탄올로 추출하여 노로바이러스의 대체모델인 FCV에 대한 항바이러스 활성을 조사하였다. FCV에 대한 항바이러스 활성을 조사한 결과 천궁, 헛개, 탱자, 당귀 및 진피의 경우 MNCC 농도에서 대조군과 비교하였을 때, log TaDw/ml 값이 감소하는 경향을 나타내지 않아 항바이러스 작용은 매우 미약한 것으로 관찰되었다(Table 3). 그러나 홍화 씨의 경우 MNCC 농도인 125 mg/ml에서 대조군과 비교하였을 때 3시간 이상 반응시킨 경우 TCIDso 값이 4 log 이상 감소하였고, 6.
- 각 추출물의 CrFK cell에 대한 세포독성은 25 mg/ml의 농도부터 2배 단계로 희석하여 추출물을 가하지 않은 well의 세 포의 부착정도와 비교하였다. 그 결과, 11종의 항신료, 차 및 식물성 한약재의 메탄올 추출물들은 CrFK cell에 대해 서로 다른 세포독성을 나타내었다(Table 2). 생강, 로즈마리, 탱자, 당귀, 녹차 추출물의 경우 6.
- 로즈마리는 그람 양성균 에 대하여 항균활성이 있다고 보고되고 있으나[5], 항바이러스 활성은 미약한 것으로 나타났다. 녹차 추출물을 가지고 경우3.13 mg/ml의 농도에서 3시간 이상 FCV와 반응시킨 경우 CrFK cell에서 바이러스 감염이 나타나지 않았으며, 1.56 mg/ml의 농도에서는 24시간 반응시킨 경우 바이러스 감염이 나타내지 않아 다른 추출물에 비해 상대적으로 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내었다(Table 3).
- 각 추출물에 대한 항바이러스 활성은 end pointdilution assay 방법인 50% tissue culture infectious dose(TCID50)으로 바이러스 감염가를 측정하였다. 녹차(QmdUa sinensisL.) 추출물의 경우 3.13 mg/ml의 농도에서 1시간 만에 FCV가 완전히 불활성화 되었으며, 홍화씨 (Qrtfems tinctcxius L.) 추출물은 6.25 mg/ml의 농도에서 5시간 만에바이러스가 불활성화되어 녹차추출물이 FCV에 대한 항바이러스 활성이 가장 뛰어난 것으로 조사되었으며, 농도 및 반응시간에 유의적으로 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 녹차 및 홍화씨 추출물 등과 같은 천연 식물 자원을 이용하여 FCV에 대한 항바이러스 활성을 조사한 결과는 궁극적으로는 노로바이러스에 의한 식중독 저감을 위한 기초자료에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구에서는 사회경제적으로 막대한 피해를 일으키고 있는 노로바이러스를 효과적으로 제어시킬 수 있는 방안을 찾고자 norovirus의 대체 모델인 feline calidvirus를 이용하여가장 흔하게 접할 수 있는 향신료, 차(茶), 식물성 한약재 둥 11종의 여러가지 천연물질을 대상으로 농도 및 시간별로 FCV를 효과적으로 억제시킬 수 있는 항바이러스 활성을 가지고 있는 물질을 탐색하였다. 이상의 결과를 조합하여 보면 녹차와 홍화씨의 추출물이 FCV에 대한 항바이러스 효과가 뛰어난 것으로 나타났으며, 그중 녹차 추출물의 항바이러스 활성이 가장 강하게 나타났다.
- 천연 식물자원 11종의 항바이러스 활성에 대한 탐색 결과, 녹차 추출물과 홍화씨 추출물이 FCV에 대한 항바이러스 효과가 뛰어난 것으로 조사되었다(Table 3). 녹차추출물의 경우6.
- 김치 부재료로 많이 사용되고 있으며 항균작용을 가지는 것으로 알려진 마늘, 생강 및 고춧가루 추출물[1 이의 FCV에 대한 항바이러스 활성을 알아보기 위하여, 각 추출물을 농도별로 FCV 희석액과 반응시키고 CrFK cell에 감염시킨 후 FCV 에 대한 추출물의 항바이러스 활성을 log TCIDso/ml 값으로 조사하였다(Table 3). 향신료 추출물질을 함유하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 마늘의 경우 25 mg/ml의 농도에서도 TQDso 값이 거의 감소하지 않아 항바이러스 활성이 나타나지 않았으며, 생강과 고춧가루 추출물의 경우도 마늘 추출물과 마찬가지로 항바이러스 활성은 나타나지 않았다.
- 홍화씨추출물의 경우, 6.25 mg/ml의 농도에서 반응 5시간에 바이러스 감염을 나타내지 않았으나(Table 3), 시간을 단축한 결과 12.5 mg/ml의 농도에서는 30분 만에 2 log 정도가 감소하였고, 반응시간이 경과함에 항바이러스 활성이 점차 증가하여 3시간 이상 경과한 경우 FCV가 불활성화되는 것으로 조사되었다. 6.
후속연구
- 25 mg/ml의 농도에서 5시간 만에바이러스가 불활성화되어 녹차추출물이 FCV에 대한 항바이러스 활성이 가장 뛰어난 것으로 조사되었으며, 농도 및 반응시간에 유의적으로 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 녹차 및 홍화씨 추출물 등과 같은 천연 식물 자원을 이용하여 FCV에 대한 항바이러스 활성을 조사한 결과는 궁극적으로는 노로바이러스에 의한 식중독 저감을 위한 기초자료에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 녹차의 주요 성분인 카테킨은 식중독균이나 병원성 세균에 대해 항균작용을 나타내고 또한, 항노화 및 항바이러스 작용을 가진다고 알려져 있다[18]. 따라서 녹차에 포함된 카테킨이라는 물질이 FCV를 불활성화 시키는 물질들 중의 하나로 사료되며 추후 이에 대한 연구를 진행할 예정이다.
- 바이러스는 숙주세포의 대사과정에 의존하여 증식하는 절대 세포 내 기생체이므로 천연물질을 이용한 항바이러스 물질의 개발은 인체에 부작용을 획기적으로 줄일 수 있을 뿐만 아니라 면역체계의 활성을 높여 보다 뚜렷한 효과를 기대할 수 있으몌20], 천연물질을 이용함으로써 식재료 이용시에 식품의 맛과 영양을 더 증가시킬 수 있다. 따라서, 이러한 FCV 에 대한 천연물질의 in virto서 불활성화 작용을 조사함으로써 노로바이러스 저감화를 위한 기초자료를 제공함과 동시에 식중독 사고에 대한 피해와 혼란을 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
- 25 mg/ml의 농도에서는 3시간이 지나야 2 log 이상이 감소하는 것으로 나타나 녹차보다는 항바이러스 활성이 약하지만 농도 및 반응시간에 유의적으로 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다(Table 4). 향후, 홍화씨 추출물의 FCV에 항바이러스 활성을 나타내는 물질에 대한 세부적인 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
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