선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이런 이유로 본 연구에서는 발효더덕의 생리활성 탐색을 통해 더덕에 대한 본격적인 연구를 진행하고자 하며 저가의 더덕을 발효시켜 유용생리활성 성분의 증대를 꾀하여 고부가가치성이 높은 산채류로서 나아가 인삼과 함께 한국이 자랑할 수 있는 특화작물로서 개발하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 특히, 이번 실험에서는 일반더덕과 발효더덕의 정상세포에서의 세포독성, 항암효과와 α-glucosidase, tyrosinase의 효소 억제능을 살펴보았다.
- 특히, 이번 실험에서는 일반더덕과 발효더덕의 정상세포에서의 세포독성, 항암효과와 α-glucosidase, tyrosinase의 효소 억제능을 살펴보았다.
제안 방법
- Tyrosinase 억제효과는 dopachrome방법 (Pomerantz, 1963)을 이용하여 측정하였다. 150 ㎕의 mushroom tyrosinase-150 unit (Sigma Chemical Co.), 225 ㎕ (2.5 ㎛M)의 L-tyrosine, 225 ㎕ 의 0.4 M Hepes buffer (pH 6.8), 그리고 300 ㎕ 의 ethanol 용액 혹은 시료 (1 ㎎/㎖)용액을 섞은 후 배양전과 15분간 배양을 한 후 475 ㎚에서 흡광도를 각각 측정하였다. Tyrosinase 억제율은 다음과 같이 측정하였다.
- A549와 AGS 세포주는 RPMI Medium 1640 복합배지 (1 L 멸균 3차수에 RPMI 1640 1 pack, sodium bicarbonate 2 g, hepes buffer 2 g, gentamicin sulfate 54.47을 녹인 것)를, Hep3B, MCF-7, 및 HEK293 세포주는 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle Medium, 1 L 멸균 3차수에 DMEM 1 pack, sodium bicarbonate 3.7 g, hepes buffer 2 g, gentamicin sulfate 54.47 ㎎을 녹인 것)배지를 이용하여 10% 우태아 혈청을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 각각 배양시켰다.
- LVSEM (low level scanning electron microscope)을 통한 관찰로 image를 찍어 생더덕과 발효더덕의 조직적 차이를 비교하였다. 각각의 더덕을 500배율로 관찰하였으며, 더덕의 표면 미세구조 관찰은 한국 기초 과학지원 연구원 춘천분소의 저진공 주사 전자현미경 (LVSEM, Hitachi S-3500N)을 사용하였다.
- LVSEM (low level scanning electron microscope)을 통한 관찰로 image를 찍어 생더덕과 발효더덕의 조직적 차이를 비교하였다. 각각의 더덕을 500배율로 관찰하였으며, 더덕의 표면 미세구조 관찰은 한국 기초 과학지원 연구원 춘천분소의 저진공 주사 전자현미경 (LVSEM, Hitachi S-3500N)을 사용하였다. 생물 시료를 주사전자현미경으로 관찰하기 위해 먼저, 3% glutaraldehyde 용액으로 실온에서 3시간 동안 전고정한 후, 0.
- 본 실험에 사용된 시료는 2008년도 국내산 더덕으로 경동 시장에서 구입하여 사용하였다. 더덕은 깨끗이 세정하여 물기를 제거한 다음 온풍건조기에서 충분히 건조시켰고, 발효 더덕은 수세한 후 온풍 건조하여 건체중량 대비 5%의 Leuconostoc mesenteroides를 접종하여 30℃, 습도 75%를 유지하며 7일간 발효한 후 20℃에서 7일간 숙성하여 얻었다. 두 시료는 각각 100 g에 10 배수의 증류수를 넣고 24시간 환류 냉각 열수 추출기에서 추출하고, 감압여과 및 농축 후, 동결 건조시켜 분말상태로 만들어 냉장 보관하면서 실험에 이용하였다.
- 더덕은 깨끗이 세정하여 물기를 제거한 다음 온풍건조기에서 충분히 건조시켰고, 발효 더덕은 수세한 후 온풍 건조하여 건체중량 대비 5%의 Leuconostoc mesenteroides를 접종하여 30℃, 습도 75%를 유지하며 7일간 발효한 후 20℃에서 7일간 숙성하여 얻었다. 두 시료는 각각 100 g에 10 배수의 증류수를 넣고 24시간 환류 냉각 열수 추출기에서 추출하고, 감압여과 및 농축 후, 동결 건조시켜 분말상태로 만들어 냉장 보관하면서 실험에 이용하였다.
- 결합되지 않은 SRB 염색약은 1% acetic acid로 45회 정도 세척, 건조시킨 후에 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색약을 녹여낸 후 540 ㎚에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 또한, 각 시료 농축물 농도에서 세포독성에 대한 암세포 생육억제 활성의 비로 selectivity를 계산하였다.
- 효소를 10 mM PIPES buffer에 용해시켜 효소액을 제조하고 20 mM maltose와 각 추출물을 농도별로 혼합한 후 37℃에서 20분간 배양한다. 반응액 60 ㎕에 1 ㎖ DNS 시약을 첨가하고 100℃ 물에서 열탕 처리 (10 min)하여 반응을 정지시킨 후에 550 ㎚에서 흡광도를 측정하여 효소반응으로 생성된 환원당을 정량하여 각 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 효소활성 저해율을 계산하였다.
- 0 ㎎/㎖로 100 ㎕ 씩 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양이 완료된 후에 상등액을 조심스럽게 aspirator로 제거하고 냉장 보관한 10% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) 100 ㎕를 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치한 후 증류수로 4회 세척하여 TCA간 배양하고 실온에서 Plate를 건조한 뒤 각 well에 1% (v/v) acetic acid에 녹인 0.4% (w/v) SRB 용액을 100 ㎕ 씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색약은 1% acetic acid로 45회 정도 세척, 건조시킨 후에 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색약을 녹여낸 후 540 ㎚에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 본 실험에 이용된 더덕 시료를 농도별로 0.21.0 ㎎/㎖를 처리하여 정상세포와 암세포에서의 독성을 측정한 후 각 농도에서의 세포독성에 대한 생육억제 활성의 비율인 selectivity를 Table 1에 나타냈다. Fig.
- 실험 대상 세포의 농도를 5 × 104 cells/㎖으로 96 well plate의 각 well에 100 ㎕ 씩 첨가하여 24시간 동안 배양 (37℃, 5%, CO2)한 후, 각 추출물을 0.1 M DMSO로 녹인 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖로 100 ㎕ 씩 첨가하여 48시간 배양하였다.
- 전처리 과정을 통해 이온 코팅된 시료는 진공관 안에서 전자를 주사하여 선명한 이미지를 관찰하는데 이용된다. 앞서 측정된 생리활성 결과와 더불어 발효가 됨에 따라 조직적으로 어떠한 변화가 이루어졌는지를 SEM을 통해 관찰하였다. Fig.
- 45%인 발효더덕에 비하여 세포독성이 조금 더 높게 측정되었지만 25% 미만의 낮은 독성으로 세포수준에서 유의할 만한 독성은 아닌 것으로 확인되었다. 이를 암세포주와 비교해 보기위해 암세포주에 대한 실험을 수행하였고, 그 결과를 Table 1에 나타내었다. Table 1에서 보이듯이 간암세포에서의 생더덕과 발효더덕의 저해율은 추출물의 농도와 비례하여 증가함을 볼 수 있었다.
- 이에 따라, α-glucosidase 억제 활성 실험과 함께 tyrosinase 억제활성도 함께 측정하였다.
- 이어 30% acetone을 시작으로 10%씩 상승된 graded acetone series 탈수과정을 거치고, 탈수된 시료들은 isoamyl acetate에 34회 교체된 후 4℃에서 냉장 보관되었다. 이후 이들 시료는 Hitachi HCP-2 critical point drye 를 이용하여 liquid CO2에 의한 임계점 건조과정 (critical point drying, CPD)을 거쳐 Hitachi E-1030 putter 장치로 약 10 ㎚ 두께의 금속피막 (Au gold coating)을 입힌 후 LVSEM Hitachi S-3500N 저진공 주사 전자현미경으로 관찰하여 수집된 image data는 file에 저장된 후 출력되어 각각의 조직상태를 비교 하였다 (Kim and Lee, 2005).
- 특히, 더덕에 존재하는 조사포닌 성분이 비만억제효과 및 당뇨 등에 관계가 있기 때문에 이 외의 활성 확인을 위해 α-glucosidase, tyrosinase의 생리활성을 이용하였다 (Kim et al., 2009).
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 세포주는 암세포로 인간 폐암세포 A549(Lung carcinoma, human), 인간 위암세포 AGS (Stomach adenocarcinoma, human), 인간 간암세포 Hep3B (Hepatocellular carcinoma, human), 인간 유방암세포 MCF-7 (Breast adenocarcinoma, human)가 이용되었고, 정상세포로는 인간 신장세포인 HEK293 (Kidney normal, human)을 Korea Cell Line Bank로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. A549와 AGS 세포주는 RPMI Medium 1640 복합배지 (1 L 멸균 3차수에 RPMI 1640 1 pack, sodium bicarbonate 2 g, hepes buffer 2 g, gentamicin sulfate 54.
- 본 실험에 사용된 시료는 2008년도 국내산 더덕으로 경동 시장에서 구입하여 사용하였다. 더덕은 깨끗이 세정하여 물기를 제거한 다음 온풍건조기에서 충분히 건조시켰고, 발효 더덕은 수세한 후 온풍 건조하여 건체중량 대비 5%의 Leuconostoc mesenteroides를 접종하여 30℃, 습도 75%를 유지하며 7일간 발효한 후 20℃에서 7일간 숙성하여 얻었다.
데이터처리
- 데이터의 통계처리는 각 시료를 3회 반복으로 행해졌으며, 실험값의 통계는 SAS 9.1 프로그램을 사용하여 평균과 표준 오차를 구하여 처리하였다.
이론/모형
- Saponin계 성분이 비만을 억제한다고 (Kim et al., 2009) 하였고 이에 따라 α-glucosidase 억제 활성 실험을 함께 하였다.
- Tyrosinase 억제효과는 dopachrome방법 (Pomerantz, 1963)을 이용하여 측정하였다. 150 ㎕의 mushroom tyrosinase-150 unit (Sigma Chemical Co.
성능/효과
- 그 밖의 다른 여러 암세포에 대한 결과는 Table 1에 나타내었다. A549인 인간 폐암세포에 대한 억제율과 selectivity는 간암세포에서와 같이 높지는 않았지만, 최고 농도 1.0 ㎎/㎖에서 발효더덕이 53.3%, 생더덕이 35.1%으로 억제율이 나타나 두 시료 모두 폐암세포를 억제할 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 발효더덕은 생더덕 보다 더 높은 비율로 간암세포와 폐암세포를 억제할 수 있는 것을 알 수 있었다.
- 5보다 높은 선택적 사멸도를 나타내었고, 발효더덕 보다는 생더덕에서 높은 수치를 보여주었다. MCF-7이라는 인간 유방암세포도 마찬가지로 저농도부터 최종 농도 1.0 ㎎/㎖까지 억제율과 선택적 사멸도를 알아보았는데 유방암세포에서도 생더덕의 억제율과 선택적 사멸도는 최고 농도 1.0 ㎎/㎖에서 77.4%와 3.6으로 나타났고, 발효더덕의 억제율과 선택적 사멸도는 67.6%, 2.8로 나타났다. 즉, 유방암세포에 대해서는 생더덕 추출물이 발효더덕 추출물보다 억제율과 선택적 사멸도가 높음을 확인하였다.
- 94%보다 높게 나타났다. Selectivity 또한 두 시료 모두 0.4 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 1.5보다 높은 선택적 사멸도를 나타내었고, 발효더덕 보다는 생더덕에서 높은 수치를 보여주었다. MCF-7이라는 인간 유방암세포도 마찬가지로 저농도부터 최종 농도 1.
- 그 결과 α-glucosidase 억제 활성 실험은 Fig. 2에서 보여지듯이 생더덕 추출물은 0.2 ㎎/㎖, 0.4 ㎎/㎖, 0.6 ㎎/㎖, 0.8 ㎎/㎖, 1.0 ㎎/㎖ 의 농도에 대하여 7.8%, 23.6%, 37.7%, 40.1%, 55.1%로 유의하게 억제하였다 (p < 0.05).
- 그 결과 시료농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖까지 생더덕의 tyrosinase 억제율이 20.7, 22.5, 23.1, 24.2, 26.9% 로 발효더덕의 억제율 9.9, 10.9, 18.0, 23.4, 24.4% 로 유의한 tyrosinase 억제활성을 보였으며 생더덕이 발효더덕보다 약간 높음을 알 수 있었다 (p < 0.05).
- 그리고, 위 실험을 통해 확인한 암세포에 대한 높은 저해능은 시료인 각 추출물 내의 triterpenoid saponins 성분에 의해 암세포에 특이적인 억제능(Shibata, 2001; Lee et al., 2002)을 보이는 것이라 생각되며 홍경천의 항암활성 (Kim et al., 2007)과 비교하여 볼 때 간 암세포 Hep3B에 대해서는 같은 농도 1.0 ㎎/㎖에서 홍경천의 억제능 69.3 ± 3.6에 비해 89.4 ± 2.5으로 발효더덕의 억제능이 약 20% 높은 억제능을 보인 것으로 in vivo 실험을 통해 억제 기작을 규명할 수 있다면, 기능성 의약품으로 잠재적 가능성을 제시할 수 있을 것이라 사료된다.
- 또한, 발효더덕은 생더덕 보다 더 높은 비율로 간암세포와 폐암세포를 억제할 수 있는 것을 알 수 있었다. 다음으로 AGS인 인간 위암세포에 대한 두 시료의 억제율과 선택적 사멸도를 알아본 결과 위암세포에 대해서도 두 시료 모두 저해율을 보였으며 특히, 발효더덕 보다는 생더덕의 억제율이 최고 농도 1.0 ㎎/㎖에서 74.51%로 발효더덕의 억제율 51.94%보다 높게 나타났다. Selectivity 또한 두 시료 모두 0.
- 1%으로 억제율이 나타나 두 시료 모두 폐암세포를 억제할 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 발효더덕은 생더덕 보다 더 높은 비율로 간암세포와 폐암세포를 억제할 수 있는 것을 알 수 있었다. 다음으로 AGS인 인간 위암세포에 대한 두 시료의 억제율과 선택적 사멸도를 알아본 결과 위암세포에 대해서도 두 시료 모두 저해율을 보였으며 특히, 발효더덕 보다는 생더덕의 억제율이 최고 농도 1.
- 발효더덕 추출물은 0.2 ㎎/㎖, 0.4 ㎎/㎖, 0.6 ㎎/㎖, 0.8 ㎎/㎖, 1.0 ㎎/㎖ 의 농도에 대하여 28.3%, 39.3%, 40.1%, 47.2%, 55.1%로 유의하게 억제하였다 (p < 0.05).
- 이 결과는 제비꽃 열수 추출물 (Lee et al., 2008)의 α-glucosidase 억제능 64.59%와 acarbose (Kim et al., 2001)의 98.04%에는 못 미치지만, 더덕 열수추출물 (Oh and Kim, 2007)의 α-glucosidase 억제능 25%에 대해서는 2배 이상의 억제능을 나타낸 것으로 측정되었다.
- 이와 같은 결과로서 생더덕과 발효더덕 추출물의 농도를 증가시킴에 따라 암세포 억제율이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었고 특히, 간암과 폐암세포에 대해서는 발효더덕의 억제율과 선택적 사멸도가 생더덕에 비해 높으며, 위암과 유방암세포에 대해서는 발효더덕보다는 생더덕의 억제율과 선택적 사멸도가 높음을 알 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 생더덕은 주로 순환기나 소화기 계통의 기관에 작용하여 높은 항암 활성능을 보였고, 발효더덕은 폐와 같은 호흡기계통의 기관에 작용하여 높은 항암활성을 나타내어 기관 특이적으로 암세포에 대한 부위별 억제능이 있는 것으로 사료된다. 그리고, 위 실험을 통해 확인한 암세포에 대한 높은 저해능은 시료인 각 추출물 내의 triterpenoid saponins 성분에 의해 암세포에 특이적인 억제능(Shibata, 2001; Lee et al.
- 이를 통해 더덕의 α-glucosidase 억제능이 존재함을 확인할 수 있었으며, 특히, 발효더덕의 α-glucosidase 억제활성능을 확인하고 생더덕 보다 억제능이 상승한다는 것을 확인할 수 있었다.
- 즉, 유방암세포에 대해서는 생더덕 추출물이 발효더덕 추출물보다 억제율과 선택적 사멸도가 높음을 확인하였다. 이와 같은 결과로서 생더덕과 발효더덕 추출물의 농도를 증가시킴에 따라 암세포 억제율이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었고 특히, 간암과 폐암세포에 대해서는 발효더덕의 억제율과 선택적 사멸도가 생더덕에 비해 높으며, 위암과 유방암세포에 대해서는 발효더덕보다는 생더덕의 억제율과 선택적 사멸도가 높음을 알 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 생더덕은 주로 순환기나 소화기 계통의 기관에 작용하여 높은 항암 활성능을 보였고, 발효더덕은 폐와 같은 호흡기계통의 기관에 작용하여 높은 항암활성을 나타내어 기관 특이적으로 암세포에 대한 부위별 억제능이 있는 것으로 사료된다.
- 1에서는 인간 정상 세포 HEK293에 대한 독성을 나타낸 것이다. 정상세포에 대한 세포독성은 생더덕과 발효더덕 모두에서 농도가 높아질수록 증가하였고, 1.0 ㎎/㎖에서 생더덕이 24.01%로 21.45%인 발효더덕에 비하여 세포독성이 조금 더 높게 측정되었지만 25% 미만의 낮은 독성으로 세포수준에서 유의할 만한 독성은 아닌 것으로 확인되었다. 이를 암세포주와 비교해 보기위해 암세포주에 대한 실험을 수행하였고, 그 결과를 Table 1에 나타내었다.
- 8로 나타났다. 즉, 유방암세포에 대해서는 생더덕 추출물이 발효더덕 추출물보다 억제율과 선택적 사멸도가 높음을 확인하였다. 이와 같은 결과로서 생더덕과 발효더덕 추출물의 농도를 증가시킴에 따라 암세포 억제율이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었고 특히, 간암과 폐암세포에 대해서는 발효더덕의 억제율과 선택적 사멸도가 생더덕에 비해 높으며, 위암과 유방암세포에 대해서는 발효더덕보다는 생더덕의 억제율과 선택적 사멸도가 높음을 알 수 있었다.
- 05). 최고 농도 1.0 ㎎/㎖에서는 생더덕의 억제활성이 55%, 발효더덕의 억제활성능이 59%로 비슷한 저해능을 나타냈지만 발효더덕의 억제활성이 약간 높음을 알 수 있었다. 이 결과는 제비꽃 열수 추출물 (Lee et al.
- Table 1에서 보이듯이 간암세포에서의 생더덕과 발효더덕의 저해율은 추출물의 농도와 비례하여 증가함을 볼 수 있었다. 추출물의 농도가 1.0 ㎎/㎖일 때 저해율은 발효더덕이 89.44%로 생더덕의 저해율 71.46%보다 높았으며, 세포의 선택적 사멸도인 selectivity 또한 비교적 저농도에서도 두 시료 모두 1.5 이상의 선택적 사멸도를 나타내었다. 그 밖의 다른 여러 암세포에 대한 결과는 Table 1에 나타내었다.
후속연구
- 이것으로 더덕은 발효를 통해 조직과 조직 사이가 벌어져 세포벽의 파괴뿐만 아니라 다공성 조직체화를 형성하고, 발효더덕에서의 발효성 미생물의 역할로 유용성분이 더 잘 용출될 수 있는 것이다. 또한, 앞의 발효물에서 전반적으로 활성이 높았기 때문에 발효에 따라 실제 미생물의 영향으로 유용성분의 용출이 증가된 것이라 생각할 수 있어 향후에 이러한 미생물과 발효된 물질을 더 연구하여야 할 것이라 사료된다.
- , 2009)는 50 ㎕/㎖, 100 ㎕/㎖, 200 ㎕/㎖, 500 ㎕/㎖ 에서 각각 22%, 33%, 51%, 79%의 높은 억제율을 나타내었다. 이러한 tyrosinase 억제능활성을 높이기 위해서는 농도를 높이거나 다른 추출공정을 통하여 유용성분의 효과적인 용출을 유도하는 다각적인 방법이 모색되어야 할 것이라 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.