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문제 정의
- 이에 저자는 배양산삼이 인체의 正氣를 補益함으로써 저항력 또는 면역력을 증강시켜 邪氣에 대한 방어능력과 질병으로부터의 회복을 촉진할 것으로 예상하고, B16/F10 세포를 이식하여 종양이 유발된 C57BL/6 생쥐에서 doxorubicin과 배양산삼 추출물을 병용 투여하여 항종양효과의 상승작용과 doxorubicin 독성 완화 효과를 관찰하고자 본 연구를 수행하였다.
- 이와 같이 배양산삼의 효능은 인삼이 신체의 허약함을 補益하고, 正氣를 충만케 하여 邪氣를 제거하고 질병을 치료하는 효능과 유사할 것으로 생각되어 저자는 B16/F10 세포를 이식하여 종양을 유발한 C57BL/6 생쥐에 항암제 doxorubicin과 배양산삼 추출액을 병용 투여하여 종양 증식 억제에 대한 상승작용 여부와 항암제 doxorubicin의 독성을 완화시킬 수 있는지를 연구하였다.
제안 방법
- Doxo+CWG : Melanona-bearing, and i.p. injection of doxorubicin 4 ㎎/㎏ at 0, 4, 8 day and Tissue Cultured Root of Wild Ginseng water extract 0.2 ㎖/day for 12 days. ✝ : significantly different from the value with normal group (✝ : p<0.
- Doxo+CWG군(Doxo+CWG group) : 종양이 발생된 개체에 실험 0일, 4일 및 8일에 doxorubicin (4 ㎎/㎏)을 복강 내 투여하였으며, 배양산삼 추출액 0.2 ㎖를 1일 1회 12일간 복강 내 투여하였다.
- Doxo군(Doxo group) : 종양이 발생된 개체에 0일, 4일 및 8일에 각각 doxorubicin (4 ㎎/㎏)을 복강 내 투여하였고, 생리식염수 0.2 ㎖를 1일 1회 12일간 복강 내 투여하였다.
- 대조군(control group) : 종양이 발생된 양성대조군으로 생리식염수 0.2 ㎖를 1일 1회 12일간 복강 내 투여하였다.
- 배양산삼이 항암제의 독성과 항종양작용에 미치는 영향을 검증하고자 C57BL/6 생쥐에 B16/F10 세포를 이식하여 종양을 유발한 다음 doxorubicin 투여군, doxorubicin과 배양산삼의 병용 투여한 군으로 구분하여 실험하였다.
- 배양세포를 trypan blue로 염색하여 세포 수를 측정한 후 FBS가 첨가되지 않은 RPMI 1640 배양액으로 세포 수가 2×106/㎖가 되도록 조정하였다.
- 실험개시 전일(0일)부터 실험종료일(12일)까지 매일 체중 및 종양체적을 측정하였다. 종양체적은 digital caliper (Mitutoyo, CD-15CP, Japan)로 종양의 장경 및 단경을 측정하여 아래의 공식으로 산출하였다.
- 배양세포를 trypan blue로 염색하여 세포 수를 측정한 후 FBS가 첨가되지 않은 RPMI 1640 배양액으로 세포 수가 2×106/㎖가 되도록 조정하였다. 실험동물의 복부를 면도하고 소독한 후 배양액 0.1 ㎖를 피하주사하여 종양세포를 이식하였다.
- 실험종료일에 모든 개체를 ether로 가볍게 마취시키고 심장에서 채혈한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심하여 혈청을 분리하였으며, 전자동생화학분석기(Hitachi 7150, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 실험종료일에 모든 개체를 ether로 가볍게 마취시킨 상태에서 심장, 간장, 신장, 고환을 적출하여 주변을 정리한 후 무게를 측정하였다.
- 정상군(normal group) : 종양세포를 이식하지 않은 음성대조군으로 생리식염수 0.2 ㎖를 1일 1회 12일간 복강 내 투여하였다.
- 종양무게는 실험종료일에 적출된 종양의 주변을 정리한 후 측정하였다.
- 종양이 발생된 48마리 중 그 크기가 현저히 작거나 또는 현저히 큰 개체는 실험군에서 제외하였으며 종양의 체적(장경×단경2/2)이 50～100㎣인 개체를 선별하여 아래와 같이 군을 분류하였으며, 각 군당 6마리를 배정하였다.
- 실험개시 전일(0일)부터 실험종료일(12일)까지 매일 체중 및 종양체적을 측정하였다. 종양체적은 digital caliper (Mitutoyo, CD-15CP, Japan)로 종양의 장경 및 단경을 측정하여 아래의 공식으로 산출하였다.
- 추출액을 micro syringe filter (0.2 μm)로 여과하여 최종 200 ㎖의 추출액을 만들었다.
대상 데이터
- 5주령의 수컷 C57BL/6 생쥐(샘타코, 한국)를 구입하여 온도 23±1℃, 습도 55±5%로 조정된 항온 항습실에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 培養山蔘(Tissue Cultured Root of Wild Ginseng, CWG)은 (주)태성바이오텍에서 건조된 상태로 구입하여 80 g을 round flask에 넣고, 증류수 1,000 ㎖를 가하여 2시간 동안 가열 추출하였다. 추출액을 micro syringe filter (0.
- 이식에 사용된 종양세포는 murine melanoma에서 유래된 B16/F10 세포로 한국세포주은행에서 분양받아 10% FBS (Gibco BRL., Grand Isaland, NY, USA)가 첨가된 RPMI 1640 배양액(Gibco BRL., Grand Isaland, NY, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 2～3일 간격으로 5회 계대배양하였다. 배양세포를 trypan blue로 염색하여 세포 수를 측정한 후 FBS가 첨가되지 않은 RPMI 1640 배양액으로 세포 수가 2×106/㎖가 되도록 조정하였다.
데이터처리
- 측정된 항목의 결과에 대한 통계는 SPSS(SPSS 11 for Windows, USA)를 이용하여 student’s t-test를 실시하여 검증하였다.
성능/효과
- Doxorubicin과 배양산삼추출액을 병용 투여한 Doxo+ CWG군에서는 Doxo군에 비하여 CPK와 GOT는 유의성 있게 감소되었고, creatinine은 증가되는 경향을 보였다(Table 5).
- Doxorubicin과 배양산삼추출액을 병용 투여한 Doxo+ CWG군에서는 Doxo군에 비하여 간장, 신장 및 고환의 무게는 유의성 있게 증가되었고, 심장의 무게는 감소되는 경향을 보였다(Table 4).
- Doxorubicin과 배양산삼추출액을 병용 투여한 Doxo+ CWG군에서도 종양의 체적은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되었으나, Doxo군과는 유의성 있는 차이가 없었다(Table 2).
- Doxorubicin과 배양산삼추출액을 병용 투여한 Doxo+CWG군에서는 실험 10일부터 Doxo군에 비하여 체중의 감소가 유의성 있게 억제되었다(Table 1).
- Doxorubicin을 투여한 Doxo군에서는 대조군에 비하여 CPK와 SGOT는 증가되는 경향을 보였고, creatinine은 감소되는 경향을 보였다.
- Doxorubicin을 투여한 Doxo군에서는 대조군에 비하여 심장의 무게는 차이가 없었으나, 신장과 고환의 무게가 유의성 있게 감소되었고, 간장의 무게도 감소되는 경향을 보였다.
- 그러나 doxorubicin과 배양산삼추출액을 병용 투여한 Doxo+CWG군에서는 Doxo군에 비하여 체중 감소가 유의성있게 억제되었으며, 이것은 배양산삼이 doxorubicin에 의한 독성을 감소시킨 결과로 판단된다.
- 또한 Doxo+CWG군에서도 종양의 체적과 무게가 감소되었고, Doxo군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않아 doxorubicin과 배양산삼추출액의 병용 투여가 doxorubicin의 종양치료효능에 상승작용을 하지는 못하였으나 부정적인 영향을 미치지도 않았음을 알 수 있었다.
- 본 실험에서는 유의성이 인정되지 않았으나 Doxo군이 대조군에 비하여 간장의 무게가 감소되고 혈청 GPT가 증가되는 경향을 보여 어느 정도 간 독성이 유발된 것으로 판단되며, Doxo+CWG군은 Doxo군에 비하여 유의성 있게 간장의 무게를 증가되고 혈청 GPT는 감소되어 배양산삼이 doxorubicin에 의한 간 독성을 완화시킨 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 실험동물의 체중에 미치는 영향을 측정한바, doxorubicin을 투여한 Doxo군이 종양이 유발된 대조군에 비하여 유의한 체중 감소를 나타내었으며, 이것은 doxorubicin에 의한 독성이 유발되었음을 의미한다21-23).
- 본 연구에서는 Doxo군의 심장 무게가 대조군에 비하여 유의한 차이를 보이지 않아 doxorubicin에 의한 독성 여부를 판단하기가 곤란하였으며, Doxo+CWG군에서도 Doxo군과 유의한 차이를 보이지 않아 배양산삼의 영향을 판단하기도 곤란하였다.
- 본 연구에서도 Doxo군의 고환 무게가 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되어 고환 독성이 유발되었음을 알 수 있었고, Doxo+CWG군은 Doxo군에 비하여 유의성 있게 고환 무게가 증가되어 배양산삼이 doxorubicin에 의한 고환 독성을 억제한 것으로 판단된다.
- 실험 결과 Doxo군의 신장 무게가 대조군에 비하여 유의성있게 감소되었으며, Doxo+CWG군은 Doxo군에 비하여 신장의 무게는 유의성 있게 증가되어 배양산삼이 doxorubicin에 의한 신 독성을 완화시킨 것으로 판단된다. 혈중 creatinine은 Doxo군이 대조군에 비하여 감소되는 경향을 보였으며, Doxo+CWG군은 Doxo군에 비하여 증가되는 경향을 보였으나 모두 정상군의 creatinine 값보다 작아 의의를 둘 수 없었다.
- 실험결과 배양산삼추출액의 병용투여로 doxorubicin에 의한 체중 감소가 유의성 있게 억제되었다.
- 이상의 결과 배양산삼은 항암제 doxorubicin의 항종양 효능에는 영향을 미치지 않으면서 doxorubicin 독성을 완화시키는 효과가 있는 것으로 판단된다.
- 이상의 실험 결과 배양산삼은 B16/F10 세포를 이식하여 종양을 유발한 생쥐에서 항암제 doxorubicin에 의한 체중의 감소와 장기독성을 방어하는 효과가 있는 것으로 밝혀졌으며, 항종양작용에 있어 doxorubicin과 배양산삼의 상승효과는 관찰할 수 없었다.
- 전반적인 실험 결과에서 Doxo+CWG군이 Doxo군에 비하여 악화시킨 결과를 나타내지는 않아 배양산삼이 doxorubicin의 항암효과를 저해하지 않은 것으로 보인다.
- 정상군에 비하여 종양이 유발된 대조군에서 creatinine은 유의성 있게 감소되었고, CPK는 유의성 있게 증가되었으며, GOT는 증가되는 경향을 보였다.
- 정상군에 비하여 종양이 유발된 대조군에서는 체중이 증가되지 않았으며, doxorubicin을 투여한 Doxo군은 대조군에 비하여 실험 10일부터 유의성있게 체중이 감소되었다.
- 종양세포를 이식한 5일 후부터 육안적인 크기의 종양이 발생되기 시작하였으며 8일 후부터 집중적으로 종양이 발생되어 12일 후에는 총 50마리 중 48마리가 발생하여 96%의 종양발생률을 나타내었다. 종양이 발생된 48마리 중 그 크기가 현저히 작거나 또는 현저히 큰 개체는 실험군에서 제외하였으며 종양의 체적(장경×단경2/2)이 50～100㎣인 개체를 선별하여 아래와 같이 군을 분류하였으며, 각 군당 6마리를 배정하였다.
- 종양의 체적과 무게는 doxorubicin을 단독 투여하였을 때와 doxorubicin과 배양산삼추출액을 병용 투여하였을 때 모두 감소되었고, 두 군 사이에 유의한 차이를 나타내지는 않았다.
- 종양의 체적과 무게에 미치는 영향에서는 대조군에 비하여 Doxo군에서 종양의 체적과 무게가 모두 유의성있게 감소되었으며, 이는 doxorubicin이 종양치료효능을 나타낸 것으로 보인다.
- 종양이 유발된 대조군에 비하여 doxorubicin을 투여한 Doxo군의 종양체적은 실험 8일부터 유의성있게 감소되었다.
- 혈액학적인 변화에서 CPK 수치의 편차가 커 유의성은 인정되지 않았으나 Doxo군이 대조군에 비하여 증가되는 경향을 나타내어 어느 정도 독성이 유발된 것으로 보이며, Doxo+CWG군은 Doxo군에 비하여 유의성있게 감소되어 doxorubicin에 의한 심장 독성을 완화시킨 것으로 판단된다.
- 실험 결과 Doxo군의 신장 무게가 대조군에 비하여 유의성있게 감소되었으며, Doxo+CWG군은 Doxo군에 비하여 신장의 무게는 유의성 있게 증가되어 배양산삼이 doxorubicin에 의한 신 독성을 완화시킨 것으로 판단된다. 혈중 creatinine은 Doxo군이 대조군에 비하여 감소되는 경향을 보였으며, Doxo+CWG군은 Doxo군에 비하여 증가되는 경향을 보였으나 모두 정상군의 creatinine 값보다 작아 의의를 둘 수 없었다.
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