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문제 정의
- axonopodis pv. glycines 특이 프라이머를 고안하고, DNA의 추출없이 종자침출액을 이용하여 PCR 분석하여 진단하는 direct PCR 방법을 수행하여 얻은 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- PCR primer의 특이성 검정 및 민감도 검정. PCR primer의 특이성 검정은 콩 종자와 잎에서 분리한 23 균주와 X.
- PCR 반응은 genomic DNA 1 µl, 1.5 mM MgCl2, 각각의 dNTPs 200 p, M, 각각의 primer lOpmole, lx PCR reaction buffer Ⅱ, 그리고 1.0 U AmpliTaq gold polymerase (Perkin elmer)> 포함하여 최종 부피를 25 μl로 하여 수행하였다. 모든 증폭은 ABI 9700을 이용하였다.
- 모든 증폭은 ABI 9700을 이용하였다. PCR 증폭 조건은 94℃에서 10분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 35 cycle을 수행한 뒤 72℃에서 5분간 처리하여 PCR 증폭을 수행하였다. 이 증폭산물의 5~10 B를 1% agrose gel에서 전기 영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 증폭 유무를 확인하였다.
- Primer 제작 및 PCR 조건, GeneBankfl 보고된 glycinecin A gene(GeneBank : AF281069)의 염기서열들을 비교하여 증폭 size가 401 bp인 XagFl(5'-GCGCAGAATCCAAAAC-AAAAC-3'), XagRl(5'-TCCTTCACGACGAATCCTGG-3') primer를 고안하였다. Primer Express Software v2.
- Xag Fl과 Xag R1 primer를 이용하여 PCR 진단 시의 검출한계 농도를 확인하기 위하여 PCR 분석하였다. genomic DNA를 20 ng을 기준으로 희석하여 확인한 결과 200 fg 까지 증폭이 확인되어 높은 민감도를 나타내었다(Fig.
- axonopodis pv. glycines대한 특이성을 확인하였다. 분리 균주 genomic DNA와 병원세균의 세포를 이용하여 확인한 결과 콩 종자와 잎에서 분리한 X axonopodis pv.
- axonopodis pv. glycines의 검줄 최소시간을 확인하기위하여 각 시간별로 진탕 배양 후, 침출액을 수거하여 DNA 추출 없이 PCR 분석하여 검출 한계시간을 조사하였다.
- DNA 분리. 병원균의 genomic DNA의 분리는 NB broth에서 배양시킨 세균을 1.5 mZ tube에 옮겨 7, 500 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 모아진 pellet을 가지고 QIAGEN DNeasy Tissue Kit(QIAGEN Inc.)에 기술되어진 방법대로 DNA를 추출하였다. 추출된 genomic DNA 는 -2(FC에 보관하면서 실험에 이용하였다.
- PCR 증폭 조건은 94℃에서 10분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 35 cycle을 수행한 뒤 72℃에서 5분간 처리하여 PCR 증폭을 수행하였다. 이 증폭산물의 5~10 B를 1% agrose gel에서 전기 영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 증폭 유무를 확인하였다.
- glycines의 검정. 자연 감염된 종자에서 병원균의 검출을 확인하기 위하여 2007년에 수확한 태광콩 종자를 육안상 건전종자와 불건전한 종자(변색립, 피해립)로 구분하여 새로이 고안된 XagFl & XagRl primer를 이용하여 2008년도에 PCR 분석하였다. 콩 종자 약 5립 중에 해당하는 1.
- glycines의 검정. 자연 감염된 종자에서 병원균의 검출을 확인하기위하여 2007년에 수확한 태광콩 종자를 육안상 건전종자와 변색 종자로 구분하여 콩 종자를 완충용액에 넣고 배양한 뒤 DNA 추출 없이 2008년도에 PCR 분석하였다. 실험한 결과 다른 처리나 DNA의 추출 없이 direct PCR 방법으로 병원균의 검출이 가능하다는 것을 확인하였으며 홍 등(2007)이 보고한 자연 감염된 종자의 변색립, 파쇄립, 피해립 등에서 PCR 방법을 통해 병원균을 검출한 결과와 일치함을 확인하였다(Fig.
- 제작된 PCR primer의 특이성 검정과 민감도 검정. 콩불마름 병균에 감염된 종자의 선별을 위해 DNA 추출 없이 콩 침출액을 이용하여 direct PCR 분석하기 위하여 개발된 Xag Fl과 Xag R1 primer의 X.
- 또한 홍 등(2007)의 보고에서와 같이 병원균이 종자 표면에 존재하는 것으로 고려되므로 육안상 건전 종자에서도 충분히 병원균이 검출될 수 있을 것으로 생각된다. 콩 종자의 적정한 침줄 배양 시간을 확인하기 위하여 진탕 배양 시간에 따른 병원균의 검출 정도를 direct PCR 방법을 이용하여 검출한계시간을 조사하였다. 28℃에서 1 분, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간으로 구분하여 진탕 배양한 뒤 direct PCR을 실시한 결과 진탕배양 2시간부터 병원균의 검출이 확인되었으며 시간이 지날수록 증폭 밴드가 더욱 선명해 지는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
대상 데이터
- axonopodis pv. glycines를 대조균주로 사용하였다.
- axonopodis pv. vesicatoria 등을 대상으로 검정하였다. 민감도를 조사하기 위해서 X.
- 0 U AmpliTaq gold polymerase (Perkin elmer)> 포함하여 최종 부피를 25 μl로 하여 수행하였다. 모든 증폭은 ABI 9700을 이용하였다. PCR 증폭 조건은 94℃에서 10분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 35 cycle을 수행한 뒤 72℃에서 5분간 처리하여 PCR 증폭을 수행하였다.
- 이병 잎에서는 노란 달 무리 부분을 포함한 갈색병반의 괴사 부분의 조직에서 분리하였다. 분리된 균주를 107~108 cfii/mZ로 조절하여 육묘용 pot에 파종된 콩 유묘 잎에 문질러서 접종하여 콩 잎에 병징을 나타내는 병원성이 확인된 균주를 선발하였다 (Table 1). 선발된 분리 균주의 동정을 위하여 지방산 분석을 실시하였고, 분리된 균주의 균체 지방산 분석eMicrobial Identification System(MIDI : Microbial ID, Inc.
성능/효과
- 콩 종자의 적정한 침줄 배양 시간을 확인하기 위하여 진탕 배양 시간에 따른 병원균의 검출 정도를 direct PCR 방법을 이용하여 검출한계시간을 조사하였다. 28℃에서 1 분, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간으로 구분하여 진탕 배양한 뒤 direct PCR을 실시한 결과 진탕배양 2시간부터 병원균의 검출이 확인되었으며 시간이 지날수록 증폭 밴드가 더욱 선명해 지는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이는 배양 시간이 지날수록 병원균의 밀도 또한 증가하는 것으로 생각되어지며, 콩 종자를 침출액에서 2시간 정도 진탕 배양 후 direct PCR 방법을 이용하면 바로 이병 종자를 간편하게 선별해 낼 수 있을 것으로 생각된다.
- PCR을 기본으로 하는 종자 검정법에는 다른 종자 전염성 세균이나 inhibitor 의 간섭을 피하고 검정한계를 최소화하는 방법이 필요하다. Xag Fl과 Xag R1 primer를 이용한 direct PCR 분석할 경우, inhibitor의 간섭에도 불구하고 종자 검정시 특별한 DNA 추출없이 PCR 증폭이 가능하여 좀 더 간편하게 결과를 얻을 수 있었으며, 역학적 조사나, 자연 환경에서의 병원균을 검정하는데도 아주 유용할 것으로 생각된다.
- genomic DNA를 20 ng을 기준으로 희석하여 확인한 결과 200 fg 까지 증폭이 확인되어 높은 민감도를 나타내었다(Fig. 2). Genomic DNA 뿐만 아니라 병원세균 현탁액을 직접 Xag Fl과 Xag R1 primer를 이용하여 PCR 분석한 결과도 역시 X.
- axonopodis pv. glycines 균주들은 401 bp에서 PCR band가 형성됨을 확인하였다(Fig. 1). 그러나 X.
- axonopodis pv. glycines만을 특이적으로 증폭함을 확인할 수 있었다(Table 1). Glycinecin A gene이 현재까지 알려진 어느 세균에서도 유사성이 알려져 있지 않아 X axonopodis pv.
- axonopodis pv. glycines만이 증폭되는 특이적인 결과를 나타내었고, 세포현탁액을 이용한 민감도의 측정 결과 OD600nm 0.1 로 농도 조정한 뒤, 10mM Tris-HCl을 이용하여 10-8까지 희석하여 실시한 결과 10-6인 1.8xl03 cfu/ml까지 증폭이 확인되었다.
- 자연 감염된 종자에서 병원균의 검출을 확인하기위하여 2007년에 수확한 태광콩 종자를 육안상 건전종자와 변색 종자로 구분하여 콩 종자를 완충용액에 넣고 배양한 뒤 DNA 추출 없이 2008년도에 PCR 분석하였다. 실험한 결과 다른 처리나 DNA의 추출 없이 direct PCR 방법으로 병원균의 검출이 가능하다는 것을 확인하였으며 홍 등(2007)이 보고한 자연 감염된 종자의 변색립, 파쇄립, 피해립 등에서 PCR 방법을 통해 병원균을 검출한 결과와 일치함을 확인하였다(Fig. 3). 육안상 건전 종자에서의 병원균의 검출은 수확한 포장의 병 발생 정도에 따라 다르게 나타나는 것으로 생각되며, 본 실험의 결과는 전년도에 수확한 포장의 병 발생정도가 미비하여 육안상 건전종자에서는 검출되지 않은 것으로 생각된다.
- 3). 육안상 건전 종자에서의 병원균의 검출은 수확한 포장의 병 발생 정도에 따라 다르게 나타나는 것으로 생각되며, 본 실험의 결과는 전년도에 수확한 포장의 병 발생정도가 미비하여 육안상 건전종자에서는 검출되지 않은 것으로 생각된다. 또한 홍 등(2007)의 보고에서와 같이 병원균이 종자 표면에 존재하는 것으로 고려되므로 육안상 건전 종자에서도 충분히 병원균이 검출될 수 있을 것으로 생각된다.
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