한국산 장류콩 종자로부터 최종적으로 Sephadex G-100상에서 분리한 lectin의 분자량, 적혈구 응집력, 온도, 열 안정성, 및 pH의 생화학적 특성을 조사하였다. 분리된 lectin을 SDS-PAGE한 결과, 분자량이 32 kDa와 22 kDa인 2개의 band가 나타났으며, Native PAGE에 의해서 108 kDa의 tetramer임을 알 수 있었다. Lectin은 trypsin을 처리한 사람의 A, B, AB, O 혈액과 쥐 혈액에서 혈구응집 반응이 일어나지 않았으나 토끼에서는 응집 반응이 일어났으며, trypsin을 처리하지 않은 모든 혈액에서는 응집반응이 일어나지 않았다. 이 lectin은 최적온도가 20-$50^{\circ}C$이며, 10-$60^{\circ}C$ 에서 열 안정성을 보였다. 최적 pH는 7.2로서 6.2 이하와 8.0 이상에서는 활성이 상설되었다.
한국산 장류콩 종자로부터 최종적으로 Sephadex G-100상에서 분리한 lectin의 분자량, 적혈구 응집력, 온도, 열 안정성, 및 pH의 생화학적 특성을 조사하였다. 분리된 lectin을 SDS-PAGE한 결과, 분자량이 32 kDa와 22 kDa인 2개의 band가 나타났으며, Native PAGE에 의해서 108 kDa의 tetramer임을 알 수 있었다. Lectin은 trypsin을 처리한 사람의 A, B, AB, O 혈액과 쥐 혈액에서 혈구응집 반응이 일어나지 않았으나 토끼에서는 응집 반응이 일어났으며, trypsin을 처리하지 않은 모든 혈액에서는 응집반응이 일어나지 않았다. 이 lectin은 최적온도가 20-$50^{\circ}C$이며, 10-$60^{\circ}C$ 에서 열 안정성을 보였다. 최적 pH는 7.2로서 6.2 이하와 8.0 이상에서는 활성이 상설되었다.
Lectin was finally isolated on Sephadex G-100 from Korean soybean cultivars developed for soy source and investigated its some biochemical properties. Native PAGE pattern of this lectin revealed a molecular weight of 108 kDa as tetramer. The molecular weight of this lectin isolated as double protein...
Lectin was finally isolated on Sephadex G-100 from Korean soybean cultivars developed for soy source and investigated its some biochemical properties. Native PAGE pattern of this lectin revealed a molecular weight of 108 kDa as tetramer. The molecular weight of this lectin isolated as double protein band by SDS-PAGE was calculated to be 32 and 22 kDa from the relative mobilities compared with those of the standard proteins. Among the tested red blood cell, the isolated lectin agglutinated rabbit red blood cell treated with trypsin, but did not agglutinated human red blood cells (A, B, AB, O), rat, and untreated rabbit red blood cell. The optimal temperature and thermal stability of isolated lectin was at 20-$50^{\circ}C$ and 10-$60^{\circ}C$, respectively. This lectin was stable at 7.2, and showed complete loss in its activity below pH 6.2 and above pH 8.0.
Lectin was finally isolated on Sephadex G-100 from Korean soybean cultivars developed for soy source and investigated its some biochemical properties. Native PAGE pattern of this lectin revealed a molecular weight of 108 kDa as tetramer. The molecular weight of this lectin isolated as double protein band by SDS-PAGE was calculated to be 32 and 22 kDa from the relative mobilities compared with those of the standard proteins. Among the tested red blood cell, the isolated lectin agglutinated rabbit red blood cell treated with trypsin, but did not agglutinated human red blood cells (A, B, AB, O), rat, and untreated rabbit red blood cell. The optimal temperature and thermal stability of isolated lectin was at 20-$50^{\circ}C$ and 10-$60^{\circ}C$, respectively. This lectin was stable at 7.2, and showed complete loss in its activity below pH 6.2 and above pH 8.0.
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문제 정의
본 연구에서는 약용으로서의 기능을 지닌 실용성 식물로서 뿐만 아니라 식생활에 이용하기 위해 개발된 한국산 장류 콩 종자로부터 분리한 lectin의 분자량 적혈구 응집력, 온도, 열 안정성, 및 pH의 생화학적 특성을 조사하였다.
제안 방법
Trypsin 미처리구와 trypsin을 처리한 사람의 ABO 혈액, 쥐 및 토끼의 혈액을 neutral saline으로 세척한 후, 2% 적혈구 부유액을 만든 다음, 이들을 분리한 lectin 용액과 반응 시켜 적혈구 응집 여부로서 혈액의 특이성을 측정하고 또한 혈액 응집반응에 따른 응집 여부를 조사하였다.
Microtiter plate에 neutral saline과 분리한 lectin 용액을 넣어 2배 연속 희석법으로 희석하였다. Trypsin을 처리한 토끼의 혈액을 가하여 30℃에서 10분간 반응시킨 후 응집 여부를 확인하였다 토끼의 혈액은 neutral saline에 0.25% trypsin을 가하여 활성화 시킨 2% 적혈구 부유액을 사용하였다
따른 활성을 측정하였다. 분리한 lectin을 2배 연속 희석법으로 연속 희석하고, 활성화 시킨 토끼의 2% 적혈구 부유액을 넣은 다음, 10-90℃ 사이의 각 온도에서 혈구 응집 반응을 측정하였다. 최대 희석 배수의 residual activity를 100%로 하여 잔존하는 lectin의 상대적인 활성을 계산하였다.
분리한 lectin의 열 안정성을 알아보기 위하여, 분리한 lectin을 2배 연속 희석법으로 희석한 다음, 10-90℃ 사이의 온도에서 각 10분간 열처리한 후, 적혈구 응집 반응을 통해 잔존하는 상대적 lectin의 활성을 측정하였다.
분리한 lectin의 최적 반응온도를 알아보기 위하여 온도변화에 따른 활성을 측정하였다. 분리한 lectin을 2배 연속 희석법으로 연속 희석하고, 활성화 시킨 토끼의 2% 적혈구 부유액을 넣은 다음, 10-90℃ 사이의 각 온도에서 혈구 응집 반응을 측정하였다.
적혈구 응집 반응은 육안으로 선행 확인한 다음, 현미경을 사용하여 최종적으로 확인하였다. Lectin의 활성은 혈구 최종응집을 나타내는 희석 배수를 역수로 계산하여 나타내었다.
적혈구 응집반응의 측정은 Takatsy(17)의 방법을 변형하여 사용하였다. Microtiter plate에 neutral saline과 분리한 lectin 용액을 넣어 2배 연속 희석법으로 희석하였다.
분리한 lectin을 2배 연속 희석법으로 연속 희석하고, 활성화 시킨 토끼의 2% 적혈구 부유액을 넣은 다음, 10-90℃ 사이의 각 온도에서 혈구 응집 반응을 측정하였다. 최대 희석 배수의 residual activity를 100%로 하여 잔존하는 lectin의 상대적인 활성을 계산하였다.
이에 50%의 (NH4)2SO4를 서서히 넣어 완전히 용해시켜밤새 교반한 다음, 40, 000x g에서 1시간 원심분리 하였다. 침전물을 소량의 neutral saline (NazHPQ를 사용하여 pH 7.0 으로 조절된 0.9% NaCl 용액)에 용해시킨 다음, neutral saline으로 24시간 마다 교환하면서 48시간 투석하였다.
한국산 장류콩 종자로부터 최종적으로 Sephadex G-100 상에서 분리한 lectin의 분자량, 적혈구 응집려 온도 열 안정성, 및 pH의 생화학적 특성을 조사하였다. 분리된 lectin을 SDS-PAGE한 결과, .
때문에(7). 혈구응집반응은 적혈구 또는 효소로 활성화시킨 적혈구를 사용하여 2-fold serial dilution법으로 최종점을 즉정하는데(32), 본 실험에서는 lectin의 활성 즉정에 trypsin으로 처리된 적혈구를 이용하여 응집여부를 육안으로 검색한 후, 현미경 하에서 최종 확인하였다
대상 데이터
대한 대수값을 통해 계산하였다. rabbit muscle phosphorylase b (97 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), chicken egg white ovalbumin (45 kDa), bovine erythrocyte carbonic anhydrase (30 kDa), soybean trypsin inhibitor (20.1 kDa) 및 a-lactalbumin (14.4 kDa)을 표준 단백질로 사용하였다.
건국대 정우석 교수 연구실에서 개발한 한국산 장류 콩 종자를 본 실험의 재료로 사용하였다
한국산 장류콩 종자로부터 PBS를 이용하여 추출하고, ammonium sulfhte를 이용하여 침전시킨 후 Sephadex G-100 상에서 lectin을 분리하였다(Fig. 1). Native 전기영동의 결과, 단일 band로 나타났으며, 이의 분자량은 108 kDa로서 측정되었다(Fig.
이론/모형
Kilpatrick(15)의 방법으로 lectin을 분리하였다. 한국산 장류 콩 종자를 분쇄기에 넣고 분쇄한 후 0.
Native 전기영동은 Williams와 Reisfeld(18)의 방법에 의해, 7.5% polyacrylamide gel을 사용하여 20 mA에서 2시간 전기영동한 후 amido black 10B로 염색하고 acetic acid로 탈색시켰다.
SDS-PAGE는 Laemmli(19)의 방법에 따라, 12% gel 을 사용하여 30 mA에서 1시간 동안 실행한 후, gel을 Coomassie brilliant blue R-250으로 염색하고, acetic acid 로 탈색시켰다.
Weber와 Osbom(20)의 방법에 의해, 분자량은 전기영동한 lectin과 표준 단백질에 대한 상대이동도 (Rf)와 단백질분자량에 대한 대수값을 통해 계산하였다. rabbit muscle phosphorylase b (97 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), chicken egg white ovalbumin (45 kDa), bovine erythrocyte carbonic anhydrase (30 kDa), soybean trypsin inhibitor (20.
2 mL/min의 유속으로 각 분획 당 3 mL를 용출하였다 활성이 높은 분획을 0℃ 에 보관하였다 언급이 없는 과정은 단백질의 변성을 막기 위하여 4℃ 에서 수행하였다. 단백질 함량의 측정은 BSA를 표준물질로 하여 Bradford (16)방법에 따라, microplate reader (Bio-Rad)를 사용하여 595 nm의 단일파장에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.
성능/효과
SDS-PAGE한 결과, 2개의 band로 나타났으며(Fig. 3), 이 각 band에 대한 분자량은 각각 32 kDa와 22 kDa로측정되 어 tetramer임을 알 수 있었다(Fig. 4). 이 결과는 장류콩 종자 lectin이 2종류의 subunit로 구성된 tetramer 로서, subunit간에 S-S bond들에 의해 공유적으로 결합되어있음을 의미한다(28).
℃ 에서 활성이 완전 소멸된다(36). 본 실험에서 10-90 ℃ 에서 10 분간 열처리 후 상대적인 활성을 측정한 결과, 40℃ 이상에서 불안정한 다른 lectin들과는(37) 달리, 정제된 lectine 10-60℃ 에서 활성이 80% 이상 유지되어, 비교적 넓은 온도 범위에서 열에 안정한 열 안정성 당단백질이다. 그러나 70℃ 부터 활성이 현저히 감소하여 80℃ 이상에서는 전혀 응집반응이 나타나지 않았다(Fig.
분리된 lectin을 SDS-PAGE한 결과, .분자량이 32 kDa와 22 kDa인 2개의 band가 나타났으며, Native PAGE에 의해서 108 kDa의 tetramer임을 알 수 있었다. Lectine tr町psin을 처리한 사람의 A, B, AB, O 혈액과 쥐 혈액에서 혈구응집 반응이 일어나지 않았으나 토끼에서는 응집 반응이 일어났으며, trypsin 을 처리하지 않은 모든 혈액에서는 응집반응이 일어나지 않았다.
작두콩 종자 lectin(23)에서도 토끼 혈액의 적혈구에서만 혈액 특이성을 나타냈으나, 방울토마토 열매(35)와 토마토의 locular fluid lectin(30)은 사람 혈액의 적혈구에 모두 혈구응집 반응을 나타냈으며, 특히 B형 혈액의 적혈구에서 가장 양호한 반응을 나타냈다. 이와 같이 lectitie 적혈구의 종류에 따라 혈구응집 반응이 다르게 일어나는 적혈구에 대한 당 특이성과, trypsin 처리의 유무에 따라 적혈구 응집반응이 다르게 나타나는 혈액 활성에 따른 특이성이 있음을 알 수 있었다.
상실을 유도하게 된다(39). 장류콩 종자 lectin을 pH 2.2-10에서 상대적인 활성을 측정한 결과, 최적 pH는 7.2로 나타났다(Fig. 8). 이는 pH 7.
장류콩 종자 lectin의 최적 반응 온도를 조사하기 위해 10-9(fC의 범위에서 상대적인 활성을 측정한 결과, 20-50℃ 에서 가장 높은 적혈구 응집 반응을 보여 이 온도의 범위가 정제된 lectin의 가장 안정적인 반응 온도임을 알 수 있었으며, 이는 Himalayan Cobra lily 괴경 lectin의 최적 온도와 일치하였다(33). 10℃에서는 80%, 60℃와 70℃ 에서는 60% 의 응집 반응을 보였으며, 80℃ 이상에서는 활성이 떨어져 응집반응을 전혀 보이지 않았다(Fig.
장류콩 종자에서 분리된 lectin에 trypsin으로 처리된 사람의 ABO형 혈액, 쥐 및 토끼의 혈액과 tiypsiii을 처리하지 않은 혈액들을 가하여 각각의 혈구 응집반응을 측정한 결과, t町psin을 처리하지 않은 혈액들에서는 전혀 응집반응이 일어 .지 않았으며, trypsin을 처리한 혈액 중 사람의 적혈구 (A, B, AB, O형)와 쥐의 적혈구에서도 아무런 반응을 보이지 않은 반면, 토끼 적혈구에서만 강한 혈구 응집반응을 일으키는 MFig.
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