B. subtilisDJI 균주로 접종 후 천일염을 첨가하여 제조한 B. subtilis DJI 된장의 에탄올, 물 및 헥산의 용매별 항산화효과를 비교하였다. B. subtilis DJI 된장의 에탄올 추출물 수율은 15.9%, 헥산 추출물 수율은 14.9% 및 물 추출물 수율은 26.9% 범위로 물 추출물 수율이 가장 높았다. 과산화물가는 B. subtilis DJI 된장 용매별 추출물 중에서 에탄올 추출물이 300 ppm에서 600 ppm으로 농도를 증가하였을 경우 저하되어 과산화물 생성 억제효과가 있었으며, 합성항산화제인 BHT와 유사한 경향을 보였다. 아질산염 소거능은 B. subtilis DJI 된장 에탄올 추출물이 300 ppm과 600 ppm 농도에서 각각 18.26%와 23.36%로 가장 높았고, 물 추출물에서 10.23%와 12.46%였고, 헥산 추출물에서는 2.62%와 5.51%로 가장 낮아 헥산 추출물의 경우 항산화효과가 아주 미비한 것으로 나타났다. 전자공여능도 아질산염 소거능과 비슷한 경향을 보여 시료 농도가 증가할수록 항산화효과가 증가하였고, 에탄올 추출물이 가장 우수한 항산화효과를 나타내었다. 그러나 B. subtilis DJI 된장 추출물의 아질산염 소거능과 전자공여능은 합성항산화제인 BHT에 비해서는 낮은 경향이었다. Rancimat 방법으로 측정한 항산화효과도 두 농도 모두 B. subtilis DJI 된장 에탄올 추출물의 항산화효과가 가장 우수하였으나, 물과 헥산 추출물은 항산화효과에 영향을 미치지 않았다.
B. subtilis DJI 균주로 접종 후 천일염을 첨가하여 제조한 B. subtilis DJI 된장의 에탄올, 물 및 헥산의 용매별 항산화효과를 비교하였다. B. subtilis DJI 된장의 에탄올 추출물 수율은 15.9%, 헥산 추출물 수율은 14.9% 및 물 추출물 수율은 26.9% 범위로 물 추출물 수율이 가장 높았다. 과산화물가는 B. subtilis DJI 된장 용매별 추출물 중에서 에탄올 추출물이 300 ppm에서 600 ppm으로 농도를 증가하였을 경우 저하되어 과산화물 생성 억제효과가 있었으며, 합성항산화제인 BHT와 유사한 경향을 보였다. 아질산염 소거능은 B. subtilis DJI 된장 에탄올 추출물이 300 ppm과 600 ppm 농도에서 각각 18.26%와 23.36%로 가장 높았고, 물 추출물에서 10.23%와 12.46%였고, 헥산 추출물에서는 2.62%와 5.51%로 가장 낮아 헥산 추출물의 경우 항산화효과가 아주 미비한 것으로 나타났다. 전자공여능도 아질산염 소거능과 비슷한 경향을 보여 시료 농도가 증가할수록 항산화효과가 증가하였고, 에탄올 추출물이 가장 우수한 항산화효과를 나타내었다. 그러나 B. subtilis DJI 된장 추출물의 아질산염 소거능과 전자공여능은 합성항산화제인 BHT에 비해서는 낮은 경향이었다. Rancimat 방법으로 측정한 항산화효과도 두 농도 모두 B. subtilis DJI 된장 에탄올 추출물의 항산화효과가 가장 우수하였으나, 물과 헥산 추출물은 항산화효과에 영향을 미치지 않았다.
We investigated the antioxidative effects of solvent extracts of doenjang fermented using Bacillus subtilis DJI (DJI doenjang) in vitro. The solvents used for extraction were ethanol, n-hexane, and water. The antioxidative activities of DJI doenjang solvent extracts were measured by estimation of pe...
We investigated the antioxidative effects of solvent extracts of doenjang fermented using Bacillus subtilis DJI (DJI doenjang) in vitro. The solvents used for extraction were ethanol, n-hexane, and water. The antioxidative activities of DJI doenjang solvent extracts were measured by estimation of peroxide value, the presence of linoleic acid level, and nitrite scavenging activity, the Rancimat test, and 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) free-radical generation, in comparison with the commercial antioxidant butylated hydroxytoluene (BHT). The peroxide value of an ethanol extract was lower than those obtained using n-hexane and water extracts. Furthermore, the peroxide value of the ethanol extract was similar to that obtained after BHT treatment. The nitrite scavenging activity was 23.36% after addition of 600 ppm DJI doenjang ethanol extract, and the DPPH free-radical scavenging activity was 19.06% under same condition, which shows that DJI doenjang ethanol extract exhibited lower antioxidative capacities than did BHT. In the Rancimat test, the ethanol extract (11.20 min induction time), n-hexane extract (7.58 min induction time), and water extract (8.26 min induction time) after treatment with 600 ppm DJI doenjang extracts demonstrated longer induction periods than did BHT (6.94 min). These results indicate that DJI doenjang has potential anti-oxidative activity.
We investigated the antioxidative effects of solvent extracts of doenjang fermented using Bacillus subtilis DJI (DJI doenjang) in vitro. The solvents used for extraction were ethanol, n-hexane, and water. The antioxidative activities of DJI doenjang solvent extracts were measured by estimation of peroxide value, the presence of linoleic acid level, and nitrite scavenging activity, the Rancimat test, and 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) free-radical generation, in comparison with the commercial antioxidant butylated hydroxytoluene (BHT). The peroxide value of an ethanol extract was lower than those obtained using n-hexane and water extracts. Furthermore, the peroxide value of the ethanol extract was similar to that obtained after BHT treatment. The nitrite scavenging activity was 23.36% after addition of 600 ppm DJI doenjang ethanol extract, and the DPPH free-radical scavenging activity was 19.06% under same condition, which shows that DJI doenjang ethanol extract exhibited lower antioxidative capacities than did BHT. In the Rancimat test, the ethanol extract (11.20 min induction time), n-hexane extract (7.58 min induction time), and water extract (8.26 min induction time) after treatment with 600 ppm DJI doenjang extracts demonstrated longer induction periods than did BHT (6.94 min). These results indicate that DJI doenjang has potential anti-oxidative activity.
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문제 정의
따라서 본 연구는 Chang과 Chang(15)이 제조한 B. subtilis DJI 된장의 항산화효과를 검토하기 위하여 에탄올, 물 및 헥산 용매별 추출물에 대한 항산화 효능을 측정하였다.
제안 방법
B. subtilis DJI 균주로 접종 후 천일염을 첨가하여 제조한 B. subtilis DJI 된장의 에탄올, 물 및 헥산의 용매별 항산화 효과를 비교하였다. B.
4) 25 mL를 취하여 50℃ 에서 72 시간 동안 반응시킨 후 이 반응액에 chlorofam 25 mL을 가하여 3회 반복 추출하였다. Chloroform 추출액에 acetic acid 25 mL 및 KI 포화용액 1 mL를 첨가하여 5 분간 방치한 다음 증류수 50 mL를 첨가한 후 1% 가용성전분을, 지시약으로 하여 0.01N Na2S2O3 용액으로 적정하여과산화물가(pe oxide value, POV)를'측정하였다.
8 mL을 첨가한 후 실온에서 10 분 정도 방치한 분광광도계 (UV-1650PC, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 525 nm에서 흡광도르 측정하였다. 결과는 시료첨가구와 무첨가 구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 계산하였으며 무 첨가 구는 추출물 대신 추출 용매를 넣어 측정하였다.
4 mL를 가하여 15 분간 방치한 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 증류수를 가하여 상기와 동일한 방법으로 측정하였으며, 아질산염 소거능은 추출물을 첨가하기 천콰 후의 아질산염 백분율(%)로 표시하였다
subtilis DJI를 가수하기 전 원료 콩의 l%(w/w) 비율로 접종하였으며, 접종 후 39~50℃ 온도에서 12~14시간 배양하였다. 이를 항온항습 장치에서 온도 20℃, 습도 30%로 유지하면서 24시간 풍건시켜 수분 함량이 15-18% 되도록 건조하려 세균형 코지로 사용하였다 B. subtilis DJI 된장은 세균 형 코지에 삶은 콩(원료 콩을 기준으로 코지와 같은 양)을 가하고 철일염 (Shinsn-docho, Korea)으로 소금물을 만들어 섞었으며, 소금의 농도는 최종 제조 된장의 소금 농도가 12%(Ww)가 되도록 하여 20℃에서 2 개월간 숙성시킨 것을 사용하였다. 제조한 B.
subtilis DJI> 37℃에서 24시간 전 배양하여 LB 액체배지에 1% 접종한 후 9시간, 배양하였다. 준비된 B. subtilis DJI을, 4℃ 9, 950 X g에서 15분간 원심분리하여 균체를 회수하고 회수된 균체를 멸균된 3차 증류수로 2회 수세하였다. 정선한 콩 1 kg을 20℃에서 20 시간 침지한 후 121℃에서 40분간 증자하였다.
정선한 콩 1 kg을 20℃에서 20 시간 침지한 후 121℃에서 40분간 증자하였다. 증자 후 4CTC로 냉각시키고 미리 준비해둔 B. subtilis DJI를 가수하기 전 원료 콩의 l%(w/w) 비율로 접종하였으며, 접종 후 39~50℃ 온도에서 12~14시간 배양하였다. 이를 항온항습 장치에서 온도 20℃, 습도 30%로 유지하면서 24시간 풍건시켜 수분 함량이 15-18% 되도록 건조하려 세균형 코지로 사용하였다 B.
항산화 지수
지질산패도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Rancimat 으로 항산화 지수를 측정하였는데, Rmcimat에 의한 항산화 지수는 시료를 첨가 후 유지의 복잡한 산화과정 중 유도 기간 마지막에 저분자량인 휘발성 카보닐산이 유리되는 양으로 측정한다(39). B.
이용하여 측정하였다. 측정조건은 반응 관에 각 추출물의 함량이 300 ppm과 600 ppm이 되도록 넣은 후 soybean oil(Sigma Co., USA)로 3.0 g 이 되게 맞춘 다음 초음파기 기 (VCX750, Sonics, USA)> 이용하여 용매 추출물과 유지가 잘 혼합되도록 한 후 증류수 70 mL를 측정 용기에 넣고 반응온도 120℃ 에서 air flow rate 20 L/hr로 하여 산화 안정성을 비교하였다. 항산화지 수는 추출물을 첨가한 실험군의 유도시간을 추출물을 첨가하지 않은 대조 군의 유도 시간으로 나눈 값을 구하였으며 모든 측정치는 3회 반복 실험하여 얻은, 값의 평균치로 표시하였다.
항산화지 수는 추출물을 첨가한 실험군의 유도시간을 추출물을 첨가하지 않은 대조 군의 유도 시간으로 나눈 값을 구하였으며 모든 측정치는 3회 반복 실험하여 얻은, 값의 평균치로 표시하였다. 합성항산화제인 BHH도 같은 농도로 유지에 첨가하여 양성대조군으로 비교 실험하였다.
대상 데이터
B. subtilis DJI 균주를 분리하고 동정하여 그 측성을 규명하고 이를 이용한 세균형 코지제조와 이 세균형 코지 제조를 이용하여 제조한 B. subtilis DJI 된장은 조선대학교 식품영양학과 식품미생물실험실에서 Chang과 Chang(15)이 제조한 것을 사용하였다. 세균형 코지의 제조과정은 B.
subtilis DJI 된장은 세균 형 코지에 삶은 콩(원료 콩을 기준으로 코지와 같은 양)을 가하고 철일염 (Shinsn-docho, Korea)으로 소금물을 만들어 섞었으며, 소금의 농도는 최종 제조 된장의 소금 농도가 12%(Ww)가 되도록 하여 20℃에서 2 개월간 숙성시킨 것을 사용하였다. 제조한 B. subtilis DJI 된장은 동결건조한 후 분쇄하여 진공 포장한 다음 -7CTC 에 보관하면서 이후 실험에 사용하였다.
데이터처리
본 실험은 독립적으로 4회 이상 반복 실시하여 얻은 결과를 실험군당 평균으로 나타내었고, SPSS 통계 package를 이용하여 일원배 치 분산분석 (one-way analysis of variance) 흘 한 후 p<0.05 수준에서 Tufey's test에 의하여 각 실험군의 평균치간의 유의성을 검정하였다.
방법(22) 에 준하여 실시하였으며 수분은 105℃ 상압가열건조법, 조단백질은 micro十jekdl법, 조지방은 soxhlet 추출법 및 조회분은 회화법으 분석하였다. 탄수화물은 100에서 수분, 조단백질, 조지방 및 조회분량을 제외한 값으로 나타냈으며 모든 측정치는 3회 반복하여 측정한 수치의 평균값으로 나타내었다.
0 g 이 되게 맞춘 다음 초음파기 기 (VCX750, Sonics, USA)> 이용하여 용매 추출물과 유지가 잘 혼합되도록 한 후 증류수 70 mL를 측정 용기에 넣고 반응온도 120℃ 에서 air flow rate 20 L/hr로 하여 산화 안정성을 비교하였다. 항산화지 수는 추출물을 첨가한 실험군의 유도시간을 추출물을 첨가하지 않은 대조 군의 유도 시간으로 나눈 값을 구하였으며 모든 측정치는 3회 반복 실험하여 얻은, 값의 평균치로 표시하였다. 합성항산화제인 BHH도 같은 농도로 유지에 첨가하여 양성대조군으로 비교 실험하였다.
이론/모형
과산화물가의 측정은 Hayase오+ Kato의 방법(23)에 따라 linoleic acid 1 mL, 에탄올 20 mL, 용매별 추출물 시료 0.1 mL 및 0.2 M phosphate buffer(pH 7.4) 25 mL를 취하여 50℃ 에서 72 시간 동안 반응시킨 후 이 반응액에 chlorofam 25 mL을 가하여 3회 반복 추출하였다. Chloroform 추출액에 acetic acid 25 mL 및 KI 포화용액 1 mL를 첨가하여 5 분간 방치한 다음 증류수 50 mL를 첨가한 후 1% 가용성전분을, 지시약으로 하여 0.
OAC.방법(22) 에 준하여 실시하였으며 수분은 105℃ 상압가열건조법, 조단백질은 micro十jekdl법, 조지방은 soxhlet 추출법 및 조회분은 회화법으 분석하였다. 탄수화물은 100에서 수분, 조단백질, 조지방 및 조회분량을 제외한 값으로 나타냈으며 모든 측정치는 3회 반복하여 측정한 수치의 평균값으로 나타내었다.
아질산염 소거능(nitrite scavenging ability, NSA) 측정은 Kato 등의 방법 (24) 에 준하여 1 mM NaNO2 용액 1 mL, 용매별 추출 시료 0.02 mL# 혼합한 다음 0.1 N HCl(pH 1.2)용액과 0.2 M citrate phosphate buffer(pH 4.2, pH 6.0)로 pH를 보정한 다음 10 mL로 정용한 후, 37℃ 에서 1 시간 반응시킨 다음 1 mL 씩 취하여 2% 초산 5 mL와 30% 초산에 용해한 Griess 시약(1% sulfanylic acid : 1% naphthylamine = 1:1) 0.4 mL를 가하여 15 분간 방치한 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 증류수를 가하여 상기와 동일한 방법으로 측정하였으며, 아질산염 소거능은 추출물을 첨가하기 천콰 후의 아질산염 백분율(%)로 표시하였다
전자공여능(electron donating ability, EDA %) 측정은 Blois의 방법(26)에 준하여 DPPH에 대한 전자공여능을 측정하였으며 용매 별 추출 시료 0.2 mL에 4x104 M DPPH 용액 0.8 mL을 첨가한 후 실온에서 10 분 정도 방치한 분광광도계 (UV-1650PC, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 525 nm에서 흡광도르 측정하였다. 결과는 시료첨가구와 무첨가 구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 계산하였으며 무 첨가 구는 추출물 대신 추출 용매를 넣어 측정하였다.
항산화 지수(antioxidant index, AI) 는 Joo 와 Kim의 방법 (25)에 의하여 Rancimat(Metrohm model 679, Herisan, Switzerland)을 이용하여 측정하였다. 측정조건은 반응 관에 각 추출물의 함량이 300 ppm과 600 ppm이 되도록 넣은 후 soybean oil(Sigma Co.
성능/효과
subtilis DJI 된장은 에탄올, 헥산 및 물 추출물 모두 600 ppm 농도에서는 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비하여 과산화물가가 낮았으나, 300 ppm 농도에서는 에탄올과 물 추출물만이 대조군에 비하여 과산화 물가가 낮았다. B. subtilis DJI 된장의 용매별 과산화물가 S" 비교해보면 300 ppm과 600 ppm 투 농도 모두 에탄올, 물, 헥산 추출물 순으로 높아 에탄올 추출물의 항산화력 이 가장 우수하였으며, 헥산 추출물은 가장 낮은 것으로 나타났다. B.
subtilis DJI 된장의 에탄올, 헥산 및 물 추출물을 각각 300 ppm과 600 ppm 농도에서 아질산염 소거능을 측정한결괴는 Table 4와 같다. 300 ppm에서 600 ppm으로 B. subtilis DJI 된장 추출물의 농도가 증가하였을 경우 아질산염 소거능도 증가하여 니트로사민 생성이 억제되어지는것으로 나타났다. 즉 아질산염 소거능은 B.
측정한다(39). B. subtilis DJI 된장 용매별 추출물의 항산화 지수는 Table 5와 같이 300 ppm에서 600 ppm으로 농도가 증가할수록 항산화 지수도 증가하는 것으로 나타났다. 600 ppm 농도에서 대조군의 유도기간은 6.
subtilis DJI 된장의 에탄올, 물 및 헥산의 용매별 추출물을 300 ppm과 600 ppm 농도로 첨가하여 5CTC 에서 72 시간 산화시킨 후 과산화물가를 측정한 결과는 Table 3과 같다. B. subtilis DJI 된장은 에탄올, 헥산 및 물 추출물 모두 600 ppm 농도에서는 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비하여 과산화물가가 낮았으나, 300 ppm 농도에서는 에탄올과 물 추출물만이 대조군에 비하여 과산화 물가가 낮았다. B.
62분으로 동일 시료 농도에서 에탄올 추출물이 가장 높게 나타났으나 BHH에 비해서는, 항산화효과가 낮게 나타났다. B. subtilis DJI 된장의 물과 헥산 추출물은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 거의 유사한 경향으로 항산화 효과가 나타나지 않았다.
subtilis DJI 된장의 항산화효과를 비교 검토하기 위하여 동결 건조한 후 마쇄한 시료를 에탄올과 헥산 및 물로 추출한 용매별 수율은 Table 2와 같다. B. subtilis DJI 된장의 에탄올 추출 수율은 15.9%, 헥산 추출 수율은 15.3% 및 물 추출 수율은 26.9% 범위로 물 추출 수율이 가장 높게 나타났다. Lee와 Kim(28)의 연구에 의하면 된장 및 콩을 5종의 용매 즉, 석유에테르* 에틸아세테이트, 클로르포름, 메탄올 및 물로 추출한 결과 된장의 경우 물 추출 수율이 27.
subtilis DJI 된장의 에탄올, 물 및 헥산의 용매별 항산화 효과를 비교하였다. B. subtilis DJI 된장의 에탄올 추출물 수율은 15.9%, 헥산 추출물 수율은 14.9% 및 물 추출물 수율은 26.9% 범위로 물 추출물 수율이 가장 높았다 과산화물가는 B. subtilis DJI 된장 용매별 추출물 중에서 에탄올 추출물이 300 ppm에서 600 ppm으로 농도를 증가하였을 경우 저하되어 과산화물 생성 억제효과가 있었으며, 합성항산화제인 BHT와 유사한 경향을 보였다. 아질산염 소거능은 B.
subtilis DJI 된장의 용매 별 추출물을 300 ppm과 600 ppm 농도에서의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 Table 6과 같다. DPPH radical 소거능은 300 ppm과 600 ppm 농도에서 BHT는 각각 29.36%와 42.63%로 가장 높았고, 다음으로 B. subtilis DJI 된장 에탄올 추출물이 10.89%오+ 19.06%이었고, 물 추출물은 6.32와 9.63%, 헥산 추출물은 4.13%와 5.26%로 가장 낮아 과산화물가 측정 결과와 마찬가지로 헥산 추출물의 경우 항산화효과가 거의 나타나지 않았다. 따라서 본 연구- 결과 B.
26%로 가장 낮아 과산화물가 측정 결과와 마찬가지로 헥산 추출물의 경우 항산화효과가 거의 나타나지 않았다. 따라서 본 연구- 결과 B. subtilis DJI 된장 용매 중 에탄올 추출물의 경우 추출물의 농도가 증가할수록 전자공여 능이 우수하였으나, 합성항산화제인 BHT에 비흐[서는 항산화 효과가 떨어 지는 것으로 나타났다. Kwon과 Shon(31) 은 된장의 수용성 색소 추출물이 지용성 색소 추출물에 비하여 수소공여능이 높게 나타났으며 된장의 숙성기간이 길어질수록 오히려 항산화능은 저하되었다호: 하였다.
된장 용매 별 추출물 중 헥산의 항산화 효능에 관한 연구는 본 연구 결과와 마찬가지로 다른 연구에서도 가장 낮게 나타났다고 보고되었다(29, 33). 또한 BHH의 경우 300 ppm과 600 ppm 농도에서 아질산염 소거능은 각각 68.26% 와 78.63 %로 나타나 B. subtilis DJI 된장 에탄올 추출물은 BHH에 비해서는 항산화효과가 떨어지는것으로 나타났다. Oh와 Kim(29)의 연구 결과도 된장의 메탄올 추출물이 물 추출물에 비하여 아질산염 소거능이 우수하였으며, BHT에비해서는 낮은 경향을 보였다.
본 실험에서 사용한 B. subtilis DJI 된장 건조 분말의 일반성분 분석 결과Qable 1), 수분 함량이 2.89%, 조단백질 36.28%, 조지방 17.40%, 조회분 22.56% 및 탄수화물 20.87% 이었다. Kwai 등(27)도 2년간 숙성된 된장의 경우 조단백질 31.
subtilis DJI 된장 용매별 추출물 중에서 에탄올 추출물이 300 ppm에서 600 ppm으로 농도를 증가하였을 경우 저하되어 과산화물 생성 억제효과가 있었으며, 합성항산화제인 BHT와 유사한 경향을 보였다. 아질산염 소거능은 B. subtilis DJI 된장 에탄올 추출물이 300 ppm과 600 ppm 농도에서 깍각 18.26%와 23.36%로 :차장 높았고, 물 추출물에서 10.23%와 12.46%였고, 헥산 추출물에서는 2.62%와 5.51% 로 가장 낮아 헥산 추출물의 경우 항산화효과가 아주 미비한 것으로 나타났다. 전자공여능도 아질산염 소거눙과 비슷한 경향을 보여 시료 농도가 증가할수록 항산화 효과가 증가하였고, 에탄올 추출물이 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
51% 로 가장 낮아 헥산 추출물의 경우 항산화효과가 아주 미비한 것으로 나타났다. 전자공여능도 아질산염 소거눙과 비슷한 경향을 보여 시료 농도가 증가할수록 항산화 효과가 증가하였고, 에탄올 추출물이 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 그러나 B.
subtilis DJI 된장 추출물의 농도가 증가하였을 경우 아질산염 소거능도 증가하여 니트로사민 생성이 억제되어지는것으로 나타났다. 즉 아질산염 소거능은 B. subtilis DJI 된장 에탄올 추출물이 300 ppm과 600 ppm 농도에서 각칵' 18.26%오+ 23.36%로 가장 높았고, 물 추출물에서 10.23%오+ 12.46%였고, 헥산 분획에서는 2.62%와 5.51%로 가장 낮아 헥산 추출물의 경우 항산화효과가 아주 미비한 것으로 나타났다. 된장 용매 별 추출물 중 헥산의 항산화 효능에 관한 연구는 본 연구 결과와 마찬가지로 다른 연구에서도 가장 낮게 나타났다고 보고되었다(29, 33).
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