선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 이 연구에서는 당유자 과피 추출물의 항암 활성에 관한 기전을 조사하기 위하여 다양한 암세포주를 대상으로 항암활성을 비교하였으며, 그 중 암세포 성장 억제 활성이 뛰어났던 혈액암 HL60 세포를 대상으로 apoptosis 유도에 미치는 영향을 조사하였고, 당유자의 기능성식품 소재로서 가능성을 탐색하였다.
- 당유자 과피(GGP) 80% 에탄올 추출물을 4종의 암세포에(피부암, 대장암, 유방암 및 혈액암) 처리하여 증식 억제 활성을 측정한 결과, 혈액암 HL60 세포에서 높은 증식 억제 활성을 보였다. 이에 CGP 추출물이 HL60 세포에 대한 apoptosis 유도에 따른 세포 증식 억제 활성을 조사하였다. Apoptosis 유도의 첫 단계인 막 투과성을 측정한 결과, confocal image와 flow cytometry에서 CGP를 처리하였을 때 탈분극 현상에 따른 막 투과성이 증가하였고 세포내 핵을 hoechst 33342를 이용하여 염색하였을 때 apoptosis가 일어났을 때 나타나는 전형적인 형태의 apoptotic body가 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 flow cytometry를 통하여 세포 주기를 측정하였을 때 DNA-hypodiploid 형태의 sub-G1가 CGP 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 20～30 μg의 lysate를 8～12% mini gel SDS-PAGE(Poly Acrylamaide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF 막(BIO-RAD)에 300 mA로 2시간 동안 transfer하였다.
- 24-well plate에 1×105 cell/mL로 분주한 후 CGP 추출물을 250, 500 및 750 μg/mL의 농도로 각각 처리하였다.
- 4종의 암세포(혈액암: HL60, 피부암: B-16, 대장암: HT-29, 유방암: MCF-7)에 대한 당유자 과피(CGP)의 80% 에탄올 추출물이 암세포 증식 억제 효과와 HL60 암세포에 대한 농도와 시간에 따른 증식억제 효과를 MTT 방법을 사용하여 측정하였다. 이를 위해 암세포별로 5×104 cell/mL의 농도로 세포수를 조정하여 96-well plate의 각 well에 넣고, 시료를 농도별로 첨가하였다.
- Plate를 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, DMSO 150 μL를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. CGP 추출물의 농도에 따른 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포에 대한 샘플 독성 정도를 측정하였다.
- Cells were treated with different concentration (250, 500, 750, and 1,000 μg/mL) for 48 hr and measured for cell viability by MTT assay to determine cytotoxicity of CGP extract.
- Cells were treated with different concentrations (250, 500, and 750μg/mL) for 48 hr and measured for cell viability by MTT assay to determine cell growth inhibitory activity.
- Cells were treated with various concentration (250, 500, 750, and 1,000 μg/mL) of CGP extracts and measured for cell viability by MTT assay at 24, 48, and 72 hr after the CGP extracts treatment.
- HL60 세포(1×105 cell/mL)에 CGP 추출물을 250, 500 및 750 μg/mL로 각각 처리하여 48시간 배양한 후, HL-60 세포를 수확하여 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척하였다.
- cell/mL)에 CGP 추출물을 250, 500 및 750 μg/mL로 각각 처리하여 48시간 배양한 후, HL-60 세포를 수확하여 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척하였다. HL60 세포를 4℃에서 70% 에탄올로 30분 동안 고정시킨 후 PBS로 세척하고, RNase A를 처리한 다음 propidium iodide(PI, Sigma)로 염색하고, flow cytometery로 세포주기를 분석하였다.
- J aggregate(JC-1) fluorescence를 이용한 미토콘드리아막 전위(mitocondrial membrane potential)를 측정하였다. JC-1은 미토콘드리아 막에 쉽게 들어갈 수 있는 lipophilic cation dye로서 낮은 막 전위에서는 green-fluorescent monomer(527 nm)상태로 나타나고 미토콘드리아의 전압이 증진된 막 전위에서는 red-fluorescent J aggregate(595 nm)를 형성한다.
- Vero 세포주를 1×105 cell/mL로 맞춘 후, 190 μL씩 96-well plate에 분주하였고 CGP 추출물을 250, 500, 750 및 1,000 μg/mL의 농도로 처리하였다.
- , Winooski Vermont, WI, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 증식억제 정도를 조사하였다.
- 1% Tween20)용액을 상온에서 2시간 동안 실시하였다. 단백질 발현량을 검토하기 위한 항체로는 Cell Signaling(Cell Signaling Inc., MA, USA)사의 Bcl-2, Bax, Caspase-3 및 PARP를 사용하였으며, TTBS 용액에서 1:1,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(Amersham Pharmacia Peroxidase)가 결합된 antimouse IgG(Amersham Pharmacia Biotech.
- Apoptosis 유도 기전에 대하여는 확실하게 증명된 바는 없지만 세포질 내 칼슘치가 증가되어 칼슘 의존성 endo-nuclease가 활성화 되어 핵 내 DNA 분절이 일어나며, transglutaminase가 활성화되어 세포질 내 단백질의 cross-linking이 일어나면서 세포질 농축이 일어나고 수액이 세포 밖으로 빠져나가면서 apoptosis body를 형성하는 것으로 알려져 있다(21-23). 따라서 CGP 추출물 처리하였을 때 HL60세포가 apoptosis의 유도에 따른 형태적 변화를 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. Fig.
- 이들 플라보노이드 성분들이 항산화, 항염 및 항암 활성을 나타낸다고 보고되어져 있으며(16-18) 특히 당유자 과피에는 naringin, neohesperidin 및 hesperidin이 많이 함유되어 있다(19). 따라서 CGP 추출물의 암세포 증식 억제 활성을 4종의 암세포를 대상으로 MTT 방법을 통하여 측정하였다. Fig.
- 혈액암 HL60 세포에 CGP 추출물은 농도와 시간 의존적으로 세포 증식을 억제하였는데 이는 이전 연구결과(16,18,19)와 비교하여 보았을 때 CGP 추출물 안에 함유되어진 플라보노이드 성분의 증가에 따른 결과라 사료된다. 따라서 혈액암 HL60 세포를 선정하여 apoptosis 유도 과정을 조사하였다. 그리고 CGP 추출물의 독성을 측정하기 위하여 정상 세포인 Vero 세포에 CGP 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양한 결과(Fig.
- 6을 보면 무처리구인 control은 원형의 온전한 핵 모양을 나타내고 있는 반면 CGP 250, 500 및 750 μg/mL을 처리한 경우에는 농도가 증가할수록 세포 밀도는 감소하였고 더불어 apoptosis 유도 시 특이적인 핵 내 DNA 단편화에 의한 염색질 응축에 의해 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 apoptotic body가 처리 농도에 따라 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 CGP에 의한 apoptosis 유도의 정도를 정량적으로 비교하기 위하여 DNA flow cytometry 분석을 이용하였다. 이는 CGP 추출물이 HL60 세포에 apoptosis 유도를 통하여 sub-G1 hypodiploid 세포가 증가하는지를 측정하는 방법이다.
- JC-1은 막 전위(membrane potential)에 따라 red와 green fluorescent의 비율은 막의 탈분극 정도를 나타낼 수 있다. 이를 이용하여 공촛점 현미경(Laser Scanning Microscope 5 PASCAL program(Carl Zeiss, Jena, Germany))과 BD FACSCaliburTM Flow Cytometery(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 방법을 통하여 CGP 추출물에 대한 HL60 세포의 막 위차에 따른 투과성을 분석하였다.
- 5μL씩 첨가하여 10분 동안 37℃ incubator에서 반응시켰다. 이를 형광현미경(IX-70, Olympus optical Co. GmbH, Hamburg, Germany)를 이용하여 세포 형태를 분석하였다.
- 이전 결과에서 확인된 CGP 처리에 따른 HL60 세포의 apoptosis 유도에 관여하는 기전의 해석을 위하여 Bcl-2 family, caspase 및 PARP의 발현 변화를 western blot을 통하여 조사하였다.
- 이는 CGP 추출물이 HL60 세포에 apoptosis 유도를 통하여 sub-G1 hypodiploid 세포가 증가하는지를 측정하는 방법이다. 즉, DNA에 특이적으로 결합하여 형광을 나타나내는 물질인 PI(propidium iodide)로 염색한 후 flow cytometry를 이용하여 세포 주기를 분석하였고 sub-G1 구간을 세포내 DNA 함량에서 환산하여 apoptotic cell을 백분율로 나타내었다. 그 결과, Fig.
대상 데이터
- HL60(human promyelocytic leukemia cells), B-16(murine melanoma cells), HT-29(human colon cancer cells), MCF-7(human breast cancer cells) 및 Vero(monkey kidney cells) 세포주를 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양 받아 100 units/mL의 penicillin-streptomycin(GIBCO, Grand Island, NY, USA)과 10%의 fetal bovine serum(FBS; GIBCO, Grand Island, NY, USA)이 함유된 RPMI 1640 또는 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 계대 배양은 2～3일에 한 번씩 시행하였다.
- 제주 재래 감귤인 당유자(Citrus grandis Osbeck)는 2009년 3월에 채집한 과피를 제주도 서귀포시 대정읍에 있는 금산건강원에서 구입하였다. 당유자 과피 1 kg을 증류수로 세척 후, 습식분쇄기로 분쇄하여 -80℃에서 냉동 보관한 후 동결건조기를 이용하여 48시간 건조하였다.
이론/모형
- Apoptosis가 유도되는 과정 중의 하나인 미토콘드리아 막의 투과성을 조사하기 위하여 dual-emission potentialsensitive probe JC-1을 사용하였다. JC-1은 막 전위(membrane potential)에 따라 red와 green fluorescent의 비율은 막의 탈분극 정도를 나타낼 수 있다.
- CGP 추출물의 세포 독성을 측정하기 위한 방법으로 MTT 분석을 실시하였다. Vero 세포주를 1×105 cell/mL로 맞춘 후, 190 μL씩 96-well plate에 분주하였고 CGP 추출물을 250, 500, 750 및 1,000 μg/mL의 농도로 처리하였다.
- 이는 CGP 추출물에 의해서 미토콘드리아 막 투과성이 증가 하였음을 나타낸다. 막의 투과성 정도를 알아보고자 flow cytometry 방법을 이용하여 측정하였다. Fig.
성능/효과
- Apoptosis 유도의 첫 단계인 막 투과성을 측정한 결과, confocal image와 flow cytometry에서 CGP를 처리하였을 때 탈분극 현상에 따른 막 투과성이 증가하였고 세포내 핵을 hoechst 33342를 이용하여 염색하였을 때 apoptosis가 일어났을 때 나타나는 전형적인 형태의 apoptotic body가 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 flow cytometry를 통하여 세포 주기를 측정하였을 때 DNA-hypodiploid 형태의 sub-G1가 CGP 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Apoptosis 유도 기전을 western blot으로 측정한 결과를 보면, CGP 추출물을 혈액암 HL60 세포에 처리하였을 때 Bcl family의 anti-apoptotic Bcl-2 단백질의 감소와 pro-apoptotic Bax 단백질의 증가로 인하여 하위기전인 caspase-3가 활성화되었으며, 이 활성화로 인하여 apoptosis 유도에 직접적으로 관여하는 PARP 단백질을 활성화시키면서 apoptosis를 유도하였다. 따라서 당유자 과피는 항암과 관련되어진 기능성식품 및 소재 개발 원료로서 개발이 가능하리라고 사료된다.
- 이에 CGP 추출물이 HL60 세포에 대한 apoptosis 유도에 따른 세포 증식 억제 활성을 조사하였다. Apoptosis 유도의 첫 단계인 막 투과성을 측정한 결과, confocal image와 flow cytometry에서 CGP를 처리하였을 때 탈분극 현상에 따른 막 투과성이 증가하였고 세포내 핵을 hoechst 33342를 이용하여 염색하였을 때 apoptosis가 일어났을 때 나타나는 전형적인 형태의 apoptotic body가 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 flow cytometry를 통하여 세포 주기를 측정하였을 때 DNA-hypodiploid 형태의 sub-G1가 CGP 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Apoptosis 유도 기전을 western blot으로 측정한 결과를 보면, CGP 추출물을 혈액암 HL60 세포에 처리하였을 때 Bcl family의 anti-apoptotic Bcl-2 단백질의 감소와 pro-apoptotic Bax 단백질의 증가로 인하여 하위기전인 caspase-3가 활성화되었으며, 이 활성화로 인하여 apoptosis 유도에 직접적으로 관여하는 PARP 단백질을 활성화시키면서 apoptosis를 유도하였다.
- Fig. 1의 결과를 보면 CGP 추출물을 250, 500 및 750 μg/mL의 농도로 처리하고 48시간을 배양하였을 때 대장암 HT29, 유방암 MCF-7 및 피부암 B16 암세포에서는 40% 미만의 증식 억제 활성을 보였지만 혈액암 HL60 암세포에서는 농도가 증가할수록 세포 증식 억제 활성이 증가하는 경향을 볼 수 있었고, 750 μg/mL의 농도에서는 60% 이상의 세포 증식 억제 활성을 보였다.
- Fig. 6을 보면 무처리구인 control은 원형의 온전한 핵 모양을 나타내고 있는 반면 CGP 250, 500 및 750 μg/mL을 처리한 경우에는 농도가 증가할수록 세포 밀도는 감소하였고 더불어 apoptosis 유도 시 특이적인 핵 내 DNA 단편화에 의한 염색질 응축에 의해 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 apoptotic body가 처리 농도에 따라 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다.
- 또한 caspase의 활성화에 동반된 apoptosis가 유도되었을 때 특이하게 분해가 일어나는 몇 가지 표적 단백질 중 poly (ADP-ribose) polymerase(PARP) 단백질은 DNA repair나 genomic stability의 유지에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 활성화된 caspase-3에 의하여 단백질의 분해가 일어나면 PARP의 기능이 상실하게 되며, 정상적인 세포의 경우 PARP 단백질은 116 kDa의 분자량을 가지지만 apoptosis가 일어난 경우 85 kDa 크기의 단편의 관찰되거나 주 band의 발현이 감소된다고 보고되었다(27). Fig. 8을 보면 cleaved caspase-3의 단백질 발현량이 CGP를 농도별로 처리하였을때 무처리구에 비하여 농도 의존적으로 증가하진 않았으나 발현되었다는 것을 알 수 있었으며 또한 caspase-3에 의해 활성화된 cleaved PARP 형태의 단백질 역시 농도 의존적으로 발현량이 증가하는 것을 알 수 있었다.
- HL60 세포에 CGP를 처리하였을 때 막 투과성에 의한 apoptosis 유도가 일어나는지 단백질 발현을 통하여 확인해본 결과, Fig. 8을 보면 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현은 CGP를 농도별로 처리하였을 때 무처리구에 비하여 농도 의존적으로 감소하였으며 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 경우 무처리구에 비하여 CGP 농도가 증가함(250, 500 및 750 μg/mL)에 따라 확연히 증가하는 것을 볼 수 있었다.
- 그 결과, Fig. 7을 보면 무처리구인 control은 2.3% 정도의 sub-G1 함량을 나타내었으나 CGP 250, 500 및 750 μg/mL을 처리하였을 경우 28.4, 38.4 및 49.9%로 sub-G1 함량이 농도 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다.
- 따라서 혈액암 HL60 세포를 선정하여 apoptosis 유도 과정을 조사하였다. 그리고 CGP 추출물의 독성을 측정하기 위하여 정상 세포인 Vero 세포에 CGP 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양한 결과(Fig. 3), CGP 추출물을 처리하지 않은 control을 100%로 하였을 때 모든 농도에서 4% 미만으로 세포 증식을 억제하였기에 CGP 추출물은 정상 세포에 독성이 없다고 사료된다. 위의 결과를 토대로 보면 HL60 세포에 대하여 CGP 추출물이 apoptosis 유도와 연계성이 있을 것으로 예측되어, CGP 추출물이 HL60 세포를 대상으로 apoptosis 유도에 따른 세포의 형태적 변화 및 세포 주기 변화를 관찰하였다.
- 4는 공촛점 현미경을 이용하여 측정한 데이터로서 무처리구인 control과 CGP 추출물 750 μg/mL을 처리한 구를 보면 분극화 현상이 나타나는 red dye에서는 control 구의 모든 세포가 염색이 되어 있으나 CGP를 처리한 구는 염색되어진 세포가 거의 나타나지 않았다. 그리고 탈분극화 현상이 나타나는 green dye에서는 CGP를 처리한 구에서만 세포가 전반적으로 염색된 것을 확인할 수 있었다. 이는 CGP 추출물에 의해서 미토콘드리아 막 투과성이 증가 하였음을 나타낸다.
- 당유자 과피(GGP) 80% 에탄올 추출물을 4종의 암세포에(피부암, 대장암, 유방암 및 혈액암) 처리하여 증식 억제 활성을 측정한 결과, 혈액암 HL60 세포에서 높은 증식 억제 활성을 보였다. 이에 CGP 추출물이 HL60 세포에 대한 apoptosis 유도에 따른 세포 증식 억제 활성을 조사하였다.
- 9%로 sub-G1 함량이 농도 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다. 따라서 CGP 추출물에 의한 HL60 세포의 형태와 주기의 변화는 apoptosis 유도와 연관이 있음을 알 수 있었다.
- 따라서 막 전위차에(JC-1 staining) 따른 confocal image와 flow cytometry 결과가 일치하는 것으로 보아 막의 투과성 변화로 인한 apoptosis의 유도가 일어났으리라 사료된다.
- 또한 HL60 세포에 CGP 추출물을 처리 시간에 따른 증식 억제 활성을 측정한 결과인 Fig. 2를 보면 24, 48 및 72시간 동안 CGP 추출물을 처리하였을 때 증식 억제 활성이 시간 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었으며 그리고 농도별로 250, 500, 750 및 1,000 μg/mL 처리하였을 때 역시 농도 의존적으로 암세포 증식 억제 활성이 증가하는 것을 볼 수 있었다.
- 위의 결과를 보면 CGP 추출물은 HL60 세포에서 apoptosis를 유도한다는 것을 알 수 있었다. 세포의 증식을 억제하고 apoptosis의 유도 단계인 막 전위의 탈분극 현상으로 인한 투과성 증가, apoptosis의 전형적 형태를 띠는 apoptotic body 생성 및 DNA-hypodiploid 상태인 sub-G1의 생성을 확인하였고 western blot을 통하여 CGP 추출물이 HL60 세포를 apoptosis를 유도하여 증식을 억제하는 기전을 확인할 수 있었다. 이렇게 CGP가 HL60 세포를 apoptosis 유도를 통한 증식을 억제할 수 있는 요인은 플라보노이드라고 사료된다.
- 위의 결과를 보면 CGP 추출물은 HL60 세포에서 apoptosis를 유도한다는 것을 알 수 있었다. 세포의 증식을 억제하고 apoptosis의 유도 단계인 막 전위의 탈분극 현상으로 인한 투과성 증가, apoptosis의 전형적 형태를 띠는 apoptotic body 생성 및 DNA-hypodiploid 상태인 sub-G1의 생성을 확인하였고 western blot을 통하여 CGP 추출물이 HL60 세포를 apoptosis를 유도하여 증식을 억제하는 기전을 확인할 수 있었다.
- 3), CGP 추출물을 처리하지 않은 control을 100%로 하였을 때 모든 농도에서 4% 미만으로 세포 증식을 억제하였기에 CGP 추출물은 정상 세포에 독성이 없다고 사료된다. 위의 결과를 토대로 보면 HL60 세포에 대하여 CGP 추출물이 apoptosis 유도와 연계성이 있을 것으로 예측되어, CGP 추출물이 HL60 세포를 대상으로 apoptosis 유도에 따른 세포의 형태적 변화 및 세포 주기 변화를 관찰하였다.
- 이는 CGP 추출물의 농도가 증가함에 따라 막의 전위차가 낮아지게 되면서 막 투과성이 증가하는 것을 알 수 있었다. 이로서 CGP 추출물은 HL60 세포의 미토콘드리아 막 투과성을 변화시킴으로서 apoptosis 유도한다는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- Apoptosis 유도 기전을 western blot으로 측정한 결과를 보면, CGP 추출물을 혈액암 HL60 세포에 처리하였을 때 Bcl family의 anti-apoptotic Bcl-2 단백질의 감소와 pro-apoptotic Bax 단백질의 증가로 인하여 하위기전인 caspase-3가 활성화되었으며, 이 활성화로 인하여 apoptosis 유도에 직접적으로 관여하는 PARP 단백질을 활성화시키면서 apoptosis를 유도하였다. 따라서 당유자 과피는 항암과 관련되어진 기능성식품 및 소재 개발 원료로서 개발이 가능하리라고 사료된다.
- 위 결과와 이전 연구를 토대로 보면 당유자 과피(CGP)추출물에 함유되어진 플라보노이드는 HL60 혈액암 세포에서 apoptosis를 유도하여 세포 증식을 효과적으로 억제하였기에 항암과 관련되어진 기능성식품 및 소재 개발 원료로서 이용 가능성이 높다고 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.