[논문]Weissella cibaria가 생산하는<tex>${\\alpha}$</tex>-Galactosidase 및 <tex>${\\beta}$</tex>-Glucosidase의 특성

홍성욱; 류래균; 정병문; 김완식; 정건섭

Weissella cibaria가 생산하는${\\alpha}$-Galactosidase 및 ${\\beta}$-Glucosidase의 특성
Characterization of ${\\alpha}$-Galactosidase and ${\\beta}$-Glucosidase by Weissella cibaria 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.37 no.3, 2009년, pp.204 - 212

홍성욱 (연세대학교 생명과학기술학부) , 류래균 (연세대학교 생명과학기술학부) , 정병문 (매일유업(주) 중앙연구소) , 김완식 (매일유업(주) 중앙연구소) , 정건섭 (연세대학교 생명과학기술학부)

초록
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대두의 발효를 통하여 생리활성을 가지고 있는 이소플라본 aglycone 함량을 높이기 위한 ${\beta}$-glucosidase와 대두에 다량 함유되어 있는 stachyose, rafinose와 같은 난소화성 oligosaccharides를 분해하기 위해 ${\alpha}$-galactosidase 효소 분비 미생물을 김치로부터 ${\alpha}$-galactosidase와 ${\beta}$-glucosidase를 생산하는 미생물을 탐색하였다. 탐색과정을 위해서 선별한 미생물을 16S rDNA sequencing 동정한 결과, Weissella cibaria 동정되어 Weissella cibaria K-M1-4로 명명하였다. Weissella cibaria K-Ml-4를 대두 액체배지에서 18시간동안 배양한 후, 생산한 효소는 배양액을 에탄을 침전, DEAE sepharose, sephacryl S-100HR column chromatography 통하여 ${\alpha}$-galactosidase의 경우, 정제도 5.3배, 수율 3.5% 그리고 ${\beta}$-glucosidase의 경우, 정제도 4.4배, 수율 2.9%로 정제되었다. ${\alpha}$-Galactosidase 효소특성은 $60^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며, $80^{\circ}C$에서 30분 처리시 43% 잔존활성을 보였다. pH 8.0에서 최대 활성을 나타내었으며, pH 5.0-9.0에서 안정하였다. 금속이온에 대한 영향에서 $Fe^{2+}$과 $Cu^{2+}$을 첨가하였을 때 효소 활성이 증가하였다. p-Nitrophenyl-${\alpha}$-D-galacto-pyranoside (PNPG) 기질에 대한 Km은 0.98 mM이었고, Vmax는 $1.81{\mu}$mole/min 이었다. ${\beta}$-Glucosidase 효소 특성은 $50^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며, $80^{\circ}C$에서 30분 처리시 46% 잔존활성을 보였다. pH 7.0에서 최대 활성을 나타내었으며, pH 5.0-9.0에서 안정하였다. 금속이온에 대한 영향에서 $Fe^{2+},\;Co^{2+},\;Cu^{2+}$을 첨가하였을 때 효소 활성이 증가하였다. p-Nitrophenyl-${\beta}$-D-gluco-pyranoside (PNPG)에 대한 Km값은 1.24mM이었고, Vmax는 $6.81{\mu}$mole/min 이었다.

Abstract ▼ AI-Helper

A strain producing ${\alpha}$-galactosidase and ${\beta}$-glucosidase was isolated from Kimchi. The isolated strain was identified as Weissella cibaria by 16S rDNA analysis and designated as Weissella cibaria K-M1-4. The enzyme activity of ${\alpha}$-galactosidase and ${\beta}$-glucosidase reached the maximum in the soy medium at $37^{\circ}C$ for 24 hr. The enzymes were purified by ethanol fractionation, DEAE sepharose fast flow, and sephacryl S-100HR column chromatography. ${\alpha}$-Galactosidase specific activity was shown by 576 Units/mg protein and the yield was 3.5% of the total activity of crude extracts. ${\beta}$-glucosidase specific activity was shown by 480 Units/mg protein and the yield was 2.9% of the total activity of crude extracts. The optimum temperature for ${\alpha}$-galactosidase was $60^{\circ}C$ and 43% of its original activity remained when it was treated at $80^{\circ}C$ for 30 min. For ${\alpha}$-galactosidase shows the optimum pH of 8.0 and is fairly stable between pH5.0 and pH9.0. The enzyme activity was increased in the presence of $Fe^{2+}$ and $Cu^{2+}$. The value of Km and Vmax for the enzyme were 0.98 mM and $1.81{\mu}$mole/min, respectively. The ${\beta}$-glucosidase has the optimum temperature of $50^{\circ}C$ and 46% of its original activity remained when it was treated at $80^{\circ}C$ for 30min. Its optimum pH of 7.0 and is fairly stable between pH5.0 and pH9.0. The enzyme activity was increased in the presence of $Fe^{2+},\;Co^{2+}$ and $Cu^{2+}$. The value of Km and Vmax for the enzyme were 1.24 mM and $6.81{\mu}$mole/min, respectively.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

.따라서 본 연구에서는 대두의 발효를 통하여 생리활성을 가지고 있는 이소플라본 aglycone 함량을 높이기 위한 0-glucosidase와 대두에 다량 함유되어 있는 stachyose, raffinos巳와 같은 난소화성 oligosaccharides를 분해하기 위한 a-galactosidase를 생산하는 미생물을 선발 및 동정하였으며, 선발미생물이 생산하는 효소를 분리, 정제하여 이화학적 특성을 확인하고자 본 연구를 수행하였다.

제안 방법

37。0에서 배양한 후, 12시간 간격으로 배지 중 당의 종류별 함량 변화를 HPLC로 분석하였다. Soy broth medium에 는 sucrose(1.
보다 더 정확한 동정을 위하여 선발미생물의 16S ribosomal DNA 분석을 실시하였다. 16S rDNA gene sequence를 BLASTNel 데 이터와 비교하여 분자 생물학적 연관성을 나타내는 계통도를 얻었다(Fig. 1). 이 결과에 따르면 선발 미생물은 Weissella cibaria LMG17699T4 가장 가까운 유연 관계로 보였다.
통성혐기성 균주 422주와 혐기성 균주 69주의 효소활성은 p- nitrophen이의 표준곡선에서 정량하였으며, cz-galactosidase 및 P-glucosidase 효소활성이 높은 균주 192주를 1차 선발하였고 동일한 방법으로 1차 선발균주들의 호소활성을 비교하여 균주 48주를 2차 선발하였다(Data not shown). 3차 선발은 채소류에서 분리한 isolate 89, virginal tract에서 분리한 isolate V13-4, 김치에서 분리한 isolate K-M1-4 및 isolate K-AP3, 유아분변에서 분리한 isolate BF-BW-31, 청국장에서 분리한 isolate CMB 16 및 isolate S2C₅ 등 분리 균주 7주를 선발하였는데 (Table 1), 그 중에서 a-galac- tosidase 활성 (26.3 unit/mL) 및 P-glucosidase 활성 (27.1 unit/mL)을 나타낸 isolate K-M1-4을 최종선 발하여 a- galactosidase 및 P-glucosidase 효소특성을 비교하였다. 대부분의 균주들이 intracellular 효소활성보다는 extracellular 효소 활성이 더 높은 것으로 나타났다.
형태학적 특성을 조사하였다. API 50 CHL kit(bio- Merieux Co., France)로 49개의 탄소원에 대한 이용성을 조사하고 이 결과를 API 50 CHL database V3.0(http://apiweb. biomerieux.com)을 이용하여 잠정적으로 동정하였다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S ribosomal DNA gene sequencing 분석을 통하여 동정하였다.
2 |im membrane filter(Advantec, Japan)로 여과하여 HPLC(Agilent 1100 series, USA) 분석을 수행하였다. Columne Eclipse XDB- C₁₈(4.6x150 mm), mobile phase A는 0.1% phosphoric acid, mobile phase B 는 acetonitrile을 linear gradient하게 0.8 mL/min의 flow rate으로 용출하였으며, UV detector (255nm)으로 검출하였다. 탄수화물 분석은 동결건조 시료 0.
Weissella cibaria K-M1-4의 배양상등액을 에탄올 침전하고 DEAE Sepharose ion-exchange chromatography (Fig. 2)를 행하였다. NaCl의 농도를 0-1 M linear gradien하게 용출시켰을 때, 효소활성은 fraction number 49에서부터 61 사이에서 나타났다.
以-galactosidase 의 p-nitrophenyl-cc-D-galacto-pyranoside (PNPG)에 대한 기질 친화력을 측정하기 위해 농도별 기질 용액의 반응 정도를 측정한 후 Lineweaver-Burk pl아에 의하여 Km과 Vmax를 계산하였다. 이 plot으로부터 산출된 a- galactosidase의 Km값은 0.
oc- Galactosidase 및 |3-glucosidase의 활성은 fraction에 전부 포함되었고 각 효소의 활성은 거의 중첩되었다(日如 3). 각 fractioire 동결건조하여 농축하였다. 이때 cc-galactosidasee] 배 양액 비 활성은 108 units/mg이 었고, 마지 막 gel filtration 정제에 의하여 5.
5 g에 70% 메탄올을 20mL 가하여 10분간 sonication 시키고 20분간 진탕하였다. 그리고 10, 000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 0.2 |im membrane filter(Advantec, Japan)로 여과하여 HPLC(Agilent 1100 series, USA) 분석을 수행하였다. Columne Eclipse XDB- C₁₈(4.
5 g에 증류수 4mL을 첨가하고 80℃ 항온수조에서 2시간 진탕한 후 에탄올 10 mM을 첨가하여 80℃ 항온수조에서 30 분간 시료내의 당을 추출하였다. 그리고 10, 000xg에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 0.2 |im membrane filter 로 여과하여 HPLC 분석을 수행하였다. Columne Sugar- Pak TMl(6.
5)에 현탁하였다. 그리고 나서 효소활성 분획은 Sephacryl S-100HR을 사용한 gel filtration을 수행하여 효소활성 분획인 fraction number 26에서부터 33사이를 모았다. oc- Galactosidase 및 |3-glucosidase의 활성은 fraction에 전부 포함되었고 각 효소의 활성은 거의 중첩되었다(日如 3).
대두의 발효를 통하여 생리활성을 가지고 있는 이소플라본 aglycone 함량을 높이기 위한glucosidase와 대두에 다량 함유되어 있는 stachyose, raffinose와 같은 난소화성 oligosaccharides를 분해하기 위해 cx-galactosidase 휸仝 분비 미생물을 김치로부터 a-galactosidase와 p-glucosidasee 생산하는 미생물을 탐색하였다. 탐색과정을 위해서 선별한 미생물을 16S rDNA sequencing 동정한 결과, Weissella cibariae- 동정되어 Weissella cibaria K-M1-4로 명명하였다.
미생물 분리시료에서 각각 1 g을 채취하여 멸균 생리식염수로 연속 희석을 하였다. 0.
com)을 이용하여 잠정적으로 동정하였다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S ribosomal DNA gene sequencing 분석을 통하여 동정하였다. 선발미생물의 chromosomal DNA 를 분리한 다음 16S rDNA sequencing0]] 일반적으로 사용줌} 는 27F(5, -AGAGTTTGArCATGGCTCAG-3, )4 1492R(5'- GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer# 사용하여 94℃ 에서 1분간 denaturation, 51。(2에서 1분간 annealing, 72℃ 에서 1분30초동안 polymerization을 시키는 조건에서 PCR(Minicycler™, MJ research Inc.
3%의 상동성을 나타내었다(Data not shown). 보다 더 정확한 동정을 위하여 선발미생물의 16S ribosomal DNA 분석을 실시하였다. 16S rDNA gene sequence를 BLASTNel 데 이터와 비교하여 분자 생물학적 연관성을 나타내는 계통도를 얻었다(Fig.
분리 선발한 미생물의 동정은 Gram 염색과 현미경 관찰을 통해 형태학적 특성을 조사하였다. API 50 CHL kit(bio- Merieux Co.
유제품, 김치, 돼지와 소의 장 내용물, 채소류, virginal tract, 유아분변, 청국장 등에서 각각 시료 1 g을 채취하여 멸균 생리식염수를 이용하여 순차적2로 십진희석한 후 soy agar medium에 도말하여 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 노란색을 띠는 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다. 혐기성 미생물의 분리를 위해 anaerobic system Gaspack(BBL, Becton Dickinson, USA)을 이용한 혐기 배양기에 37也에서 24시간동안 배양하였다.
5)를 첨가하여 현탁하였다. 이 시료를 DEAE Sepharose Fast Flow(Pharmacia, Sweden) column(25x350 mm)에 적용하여 DEAE Sepharose에 결합시킨 후, 0-1 M NaCl를 linear gradient하게 3 mL/min 유속으로 용출하여 5 mL씩 80개 분획을 받았다. 효소활성을 측정하여 활성분획만을 모아 dialysis 장치 (6-8 kDa cut-off)를 사용하여 4。(2에서 18시간동안 투석하였다.
최적반응 pH 및 pH 안정성 측정

정제한 효소액 은 p-nitrophenyl-ot-D-galacto-pyranoside (PNPG)와 p-nitrophenyl-P-D-gluco-pyranoside(PNPG)^- 사용하여 각각의 oc-galactosidase 활성과 (glucosidase 활성을 측정하였다. 효소에 대한 pH의 영향을 알아보기 위해 pH별로 적합한 buffer# 이용하였는데 pH 2。는 citrate HC₁ buffer, pH 3.
효소에 대한 온도의 영향은 10。(2부터 9CTC까지 10。(2간격으로 측정하였다. 최적반응 온도는 효소액과 기질 용액을 10분간 반응시킨 후, 활성을 측정하였고, 온도 안정성은 효소액을 각 온도에서 30분간 처리한 후 잔존효소 활성 을 p-nitrophenyl-a-D-galacto-pyranoside(PNPG)와 p- nitrophenyl-G-D-gluco-pyranoside(PNPG)를 사용하여 45℃ 에서 10분간 반응하여 측정하였다.
8 mL/min의 flow rate으로 용출하였으며, UV detector (255nm)으로 검출하였다. 탄수화물 분석은 동결건조 시료 0.5 g에 증류수 4mL을 첨가하고 80℃ 항온수조에서 2시간 진탕한 후 에탄올 10 mM을 첨가하여 80℃ 항온수조에서 30 분간 시료내의 당을 추출하였다. 그리고 10, 000xg에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 0.
0 mL/min房로 2mL씩 분획하였다. 효소활성 분획만을 모아 동결건조하여 정제하였다.

대상 데이터

표준균주와 분리 균주는 효소 생산용 soy medium을 사용하여 3742에서 24 시간동안 계대배양하여 실험에 사용하였다. (X-Galactosidase 및 6-ghicosidase를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 대두를 원료로 한 soy medium을 제조하여 사용하였다. Soy medium 제조는 대두(충북 괴산군 2005산)와 증류수(1:4>를 121。<2에서 15분간 열처리한 후, 여과망을 이용하여 대두를 제거하고 그 여과액의 pH를 3.
그 후에 25 J1L의 foHn and ciocalteu's phenol reagent(Sigma, USA)를 넣고 실온에 30哓동안 방치한 후, 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량곡선 작성을 위한 표준물질은 bovine serum albumin (Sigma, USA)을 사용중였다.
oc-Galactosidase 및 fJ-glucosidase가 기질인 PNPGf- 분해하면 p-nitrophenol(PNP)이 분리되면서 노란색을 나타내므로 역가가 높을수록 진한 노란색을 나타낸다. 통성혐기성 균주 422주와 혐기성 균주 69주의 효소활성은 p- nitrophen이의 표준곡선에서 정량하였으며, cz-galactosidase 및 P-glucosidase 효소활성이 높은 균주 192주를 1차 선발하였고 동일한 방법으로 1차 선발균주들의 호소활성을 비교하여 균주 48주를 2차 선발하였다(Data not shown). 3차 선발은 채소류에서 분리한 isolate 89, virginal tract에서 분리한 isolate V13-4, 김치에서 분리한 isolate K-M1-4 및 isolate K-AP3, 유아분변에서 분리한 isolate BF-BW-31, 청국장에서 분리한 isolate CMB 16 및 isolate S2C₅ 등 분리 균주 7주를 선발하였는데 (Table 1), 그 중에서 a-galac- tosidase 활성 (26.
혐기성 미생물의 분리를 위해 anaerobic system Gaspack(BBL, Becton Dickinson, USA)을 이용한 혐기 배양기에 37也에서 24시간동안 배양하였다. 표준균주와 분리 균주는 효소 생산용 soy medium을 사용하여 3742에서 24 시간동안 계대배양하여 실험에 사용하였다. (X-Galactosidase 및 6-ghicosidase를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 대두를 원료로 한 soy medium을 제조하여 사용하였다.

데이터처리

증폭된 으扌 1400 bp의 fragmente T vector (Invitrogen, USA) 에 결합시킨 후 형질전환하였다. T vector sequencing primer 를 이용하여 염기서열 결정을 수행하였으며 그 결과는 BLAST search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) program을 이 용하여 GENBANK(NCBI, USA)의 ribosomal DNA gene sequencinge]- 비교하여 동정하였다.

이론/모형

단백질의 정량은 Ohnishi 등[2이의 정량법에 따라 실시하였다. 시료용액 (50 piL)에 550 |1L의 biuret reagent(0.
그리고 다시 원심분리 (10, 000xg, 5 min)하여 회수한 상등액을 intracellular 조효소액으로 사용하였다. 효소 활성은 Yeo 등의 방법[2이에 따라 수행하였다. 기질은 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.
효소의 Km 및 Vmax를 측정하기 위해 농도별 기질 용액 [s]의 반응정도[v]를 측정한 후 l/[s]에 대해 1/v를 plot 하는 방법인 Lineweaver-Burk plot을 그렸고 이를 통하여 Km 값과 Vmax 값을 계산하였다. 이때, 각 기질 농도에서의 호소 활성을 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.

성능/효과

9). Soy broth medium의 이소플라본을 분석한 결과, glucoside 형태 인 daidzin(66.7 jig/mL), glycitin (28.1 |ig/mL), genistin(65.8 eig/mL)°] 주종을 이루며 함유되어 있음을 나타내었다. 미생물 배양 48시간 이후에는 p- 읺ucosidase의 활성 으로 daidzin(53.
p- ghicosidase의 경우, Zn2+, Ca2+, ML을 첨가하였을 때는 효소 활성이 감소하였으며 , Cu2+, Co气 F/+을 첨가하였을 때는 효소 활성이 증가함을 보였다(Fig. 8). Yeo 등[26]은 금속이 온에 대한 영향에서 Co2+가 33%, Ci『+가 21%의(X- galactosidase 활성이 저해됨을 보고하였다.
03% 북}에 감소하지 않았다. 감소하지 않은 이유는 Weissella cibaria K-M1-4가 탄소원으로 sucrose 와 fructose를 이용한다는 것을 나타내고, sucrose를 모두 소비한 후에 a-galactosidase의 작용으로 stachyose와 raffinose 를 분해하여 최종산물인 sucrose를 생산하고 이용할 것으로 사료된다(Fig. 9). Soy broth medium의 이소플라본을 분석한 결과, glucoside 형태 인 daidzin(66.
1 unit/mL)을 나타낸 isolate K-M1-4을 최종선 발하여 a- galactosidase 및 P-glucosidase 효소특성을 비교하였다. 대부분의 균주들이 intracellular 효소활성보다는 extracellular 효소 활성이 더 높은 것으로 나타났다.
이 결과에 따르면 선발 미생물은 Weissella cibaria LMG17699T4 가장 가까운 유연 관계로 보였다. 따라서 선발미생물을 Weissella cibaria 로 동정하고 Weissella cibaria K-M1-4이라 명명하였다.
8 eig/mL)°] 주종을 이루며 함유되어 있음을 나타내었다. 미생물 배양 48시간 이후에는 p- 읺ucosidase의 활성 으로 daidzin(53.9 |ig/mL), glycitin(25.4 gg/mL), genistin(25.6 jig/mL)0] 감소하였고 aglycone 형 태의 daidzein(8.4 |ig/mL), 이ycitein(1.3 pig/mL), genistein(18.8 μg/mD의 이소플라본으로전환됨이 확인되었다. 특히 이소플라본 중에서 genistin에서 genistein으로의 전환율이 우수한 것으로 나타났다(Fig.
0에서 안정하다고 보고하였다[26]. 본 실험결과와 이들 결과 사이에는 근소한 차이가 있는 것으로 보아 균종간의 차이에서 비롯된 것이라고 사료되며, 대체적으로 pH가 중성일때 호소의 활성이 높았다. 게다가 Weissella cibaria K-M1-4의 a-galactosidase 및 P-glucosidase 효소활성의 pH 안정폭이 넓기 때문에 산업적으로 효소를 이용하는데 효율적이라 사료된다.
1). 이 결과에 따르면 선발 미생물은 Weissella cibaria LMG17699T4 가장 가까운 유연 관계로 보였다. 따라서 선발미생물을 Weissella cibaria 로 동정하고 Weissella cibaria K-M1-4이라 명명하였다.
미생물을 탐색하였다. 탐색과정을 위해서 선별한 미생물을 16S rDNA sequencing 동정한 결과, Weissella cibariae- 동정되어 Weissella cibaria K-M1-4로 명명하였다. Weissella cibaria K-M1-4를 대두 액체배지에서 18시간 동안 배양한 후, 생산한 효소는 배양액을 에탄올 침전, DEAE sepharose, sephacryl S-100HR column chromatography# 통하여 a-galactosidase의 경우, 정제도 53州, 수율 3.
8 μg/mD의 이소플라본으로전환됨이 확인되었다. 특히 이소플라본 중에서 genistin에서 genistein으로의 전환율이 우수한 것으로 나타났다(Fig. 10).
효소의 금속이온에 대한 영향을 알아보기 위해 기질인 p- nitrophenyl-oc-D-galacto-pyranoside(PNPG) 용액과 p-nitro- phenyl-P-D-gluco-pyranoside(PNPG) 용액에 각각의 금속 이온들을 최종 농도가 2mM이 되도록 첨가하여 효소 활성을 측정한 결과, a-galactosidase의 경우, Zn2+, Mn2+, Mg2+, C°2+을 첨가하였을 때는 효소활성이 감소하였으며, 以产와 F/+을 첨가하였을 때는 효소 활성이 증가함을 보였다. p- ghicosidase의 경우, Zn2+, Ca2+, ML을 첨가하였을 때는 효소 활성이 감소하였으며 , Cu2+, Co气 F/+을 첨가하였을 때는 효소 활성이 증가함을 보였다(Fig.
효소활성이 가장 높은 isolate K-M1-4를 현미경으로 관찰한 결과 Gram 양성 간균이었으며 당이용성 검토를 위하여 API 50 CHL kit test를 실시하여 동정한 결과 Lactobacillus coprophilus와 92.3%의 상동성을 나타내었다(Data not shown). 보다 더 정확한 동정을 위하여 선발미생물의 16S ribosomal DNA 분석을 실시하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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