본 연구에서는 며느리배꼽 추출물들의 항산화 효능 및 tyrosinase, elastase 저해 효과에 관한 조사를 수행하였다. 며느리배꼽 추출물의 free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성($FSC_{50}$)은 aglycon 분획($12.38{\mu}g$/mL)에서 가장 큰 활성을 나타내었고, 또한 luminol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 며느리배꼽 추출물의 총항산화능은 추출물의 ethyl acetate 분획($0.35{\mu}g$/mL)에서 가장 큰 활성을 나타내었다. 며느리배꼽 추출물에 대하여 광증감제인 rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였을 때, 추출물의 aglycon 분획을 제외하고 다른 추출물들은 농도 의존적($1{\sim}50{\mu}g$/mL)으로 세포보호 효과를 나타내었다. Tyrosinase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)는 며느리배꼽 추출물의 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획이 각각 $136.00{\mu}g$/mL, $68.10{\mu}g$/mL으로 나타났으며, elastase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)는 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획이 각각 $67.20{\mu}g$/mL, $43.50{\mu}g$/mL으로 나타났다. 이상의 며느리배꼽 추출물이 $^1O_2$ 혹은 다른 ROS를 소광시키거나 소거함으로써 그리고 ROS에 대항하여 세포막을 보호함으로써 생체계, 특히 태양 자외선에 노출된 피부에서 항산화제로서 작용할 수 있음을 가리키며, 며느리배꼽 추출물의 tyrosinase 및 elastase 저해 활성으로 부터 항산화, 항노화 화장품 소재로서의 응용 가능성을 확인하였다.
본 연구에서는 며느리배꼽 추출물들의 항산화 효능 및 tyrosinase, elastase 저해 효과에 관한 조사를 수행하였다. 며느리배꼽 추출물의 free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성($FSC_{50}$)은 aglycon 분획($12.38{\mu}g$/mL)에서 가장 큰 활성을 나타내었고, 또한 luminol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 며느리배꼽 추출물의 총항산화능은 추출물의 ethyl acetate 분획($0.35{\mu}g$/mL)에서 가장 큰 활성을 나타내었다. 며느리배꼽 추출물에 대하여 광증감제인 rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였을 때, 추출물의 aglycon 분획을 제외하고 다른 추출물들은 농도 의존적($1{\sim}50{\mu}g$/mL)으로 세포보호 효과를 나타내었다. Tyrosinase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)는 며느리배꼽 추출물의 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획이 각각 $136.00{\mu}g$/mL, $68.10{\mu}g$/mL으로 나타났으며, elastase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)는 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획이 각각 $67.20{\mu}g$/mL, $43.50{\mu}g$/mL으로 나타났다. 이상의 며느리배꼽 추출물이 $^1O_2$ 혹은 다른 ROS를 소광시키거나 소거함으로써 그리고 ROS에 대항하여 세포막을 보호함으로써 생체계, 특히 태양 자외선에 노출된 피부에서 항산화제로서 작용할 수 있음을 가리키며, 며느리배꼽 추출물의 tyrosinase 및 elastase 저해 활성으로 부터 항산화, 항노화 화장품 소재로서의 응용 가능성을 확인하였다.
In this study, the antioxidative effects, inhibitory effects on tyrosinase, elastase of Persicaria perfoliata extracts were investigated. The deglycosylated fraction of extract ($12.38{\mu}g$/mL) showed the most prominent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activ...
In this study, the antioxidative effects, inhibitory effects on tyrosinase, elastase of Persicaria perfoliata extracts were investigated. The deglycosylated fraction of extract ($12.38{\mu}g$/mL) showed the most prominent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity ($FSC_{50}$). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of P. perfoliata extracts on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system were investigated using the luminol-dependent chemiluminescence assay. The ethyl acetate fraction of extract ($0.35{\mu}g$/mL) showed the most prominent ROS scavenging activity. The protective effects of P. perfoliata extract/fractions on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The P. perfoliata extracts suppressed photohemolysis in a concentration dependent manner ($1{\sim}50{\mu}g$/mL) except the deglycosylated fraction of extract. The inhibitory effect of P. perfoliata extracts on tyrosinase was investigated to assess their whitening efficacy. Inhibitory effects ($IC_{50}$) on tyrosinase were determined with ethyl acetate fraction of P. perfoliata extract ($136.00{\mu}g$/mL) and deglycosylated fraction of extract ($68.10{\mu}g$/mL). Finally, their anti-elastase activities were measured to predict the anti-wrinkle efficacy in the human skin. Inhibitory effects ($IC_{50}$) on elastase were determined with ethyl acetate fraction of P. perfoliata extract ($67.20{\mu}g$/mL) and deglycosylated fraction of extract ($43.50{\mu}g$/mL). These results indicate that extract/fractions of P. perfoliata can function as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by scavenging $^1O_2$ and other ROS, and protect cellular membranes against ROS. Extract/fractions of P. perfoliata can be applicable to new functional cosmetics for antioxidant, antiaging.
In this study, the antioxidative effects, inhibitory effects on tyrosinase, elastase of Persicaria perfoliata extracts were investigated. The deglycosylated fraction of extract ($12.38{\mu}g$/mL) showed the most prominent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity ($FSC_{50}$). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of P. perfoliata extracts on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system were investigated using the luminol-dependent chemiluminescence assay. The ethyl acetate fraction of extract ($0.35{\mu}g$/mL) showed the most prominent ROS scavenging activity. The protective effects of P. perfoliata extract/fractions on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The P. perfoliata extracts suppressed photohemolysis in a concentration dependent manner ($1{\sim}50{\mu}g$/mL) except the deglycosylated fraction of extract. The inhibitory effect of P. perfoliata extracts on tyrosinase was investigated to assess their whitening efficacy. Inhibitory effects ($IC_{50}$) on tyrosinase were determined with ethyl acetate fraction of P. perfoliata extract ($136.00{\mu}g$/mL) and deglycosylated fraction of extract ($68.10{\mu}g$/mL). Finally, their anti-elastase activities were measured to predict the anti-wrinkle efficacy in the human skin. Inhibitory effects ($IC_{50}$) on elastase were determined with ethyl acetate fraction of P. perfoliata extract ($67.20{\mu}g$/mL) and deglycosylated fraction of extract ($43.50{\mu}g$/mL). These results indicate that extract/fractions of P. perfoliata can function as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by scavenging $^1O_2$ and other ROS, and protect cellular membranes against ROS. Extract/fractions of P. perfoliata can be applicable to new functional cosmetics for antioxidant, antiaging.
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문제 정의
, · OH 등)가 생성되는 계에서의 이들 ROS에 대한 총항산화능에 관한 연구는 아직 되어 있지 않다. 따라서 며느리배꼽을 구입하여 며느리배꼽 추출물과 분획을 제조하고 이들 추출물(혹은 분획)의 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 보호활성과 free radical 소거활성, Fe3+-EDTA/ H2O2 계에서 생성된 활성산소에 대한 총항산화능, tyrosinase 활성 저해 효과, 피부 주름 생성에서 중요한 역할을 하는 elastase 활성 저해 효과를 측정하여 ROS에 의한 피부 노화를 방지하는데 효과가 있는 항산화, 항노화 화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다.
제안 방법
공시험(blank)은 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 가 용해된 완충용액 대신 0.12 M tris-Cl buffer 1,300 µL 를 첨가하였으며, 농도는 실험군과 동일하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm ×20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm ×20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 EtOH 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 다음 식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다. 소거 활성은 DPPH의 농도가 50 % 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였다.
대조군(control)은 시료 대신 시료용액으로 사용된 용매를 100 µL 첨가하였다.
대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이동일하나 H2O2와 FeCl3 · 6H2O를 첨가하지 않은 것으로 하였다.
며느리배꼽 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50 %가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
따라서 이 계를 이용하면 ROS에 대한 총항산화능을 측정할 수 있다. 총항산화능은 luminol이 ROS에 의해 산화되어 나타나는 빛을 화학발광기로 검출하여 측정하였다.
추출물을 농도별로 각각 50 µL씩 첨가하고 암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사 하였다.
사람 적혈구를 대상으로 활성산소에 의한 세포손상 및 파괴 실험은 활성산소에 의한 세포손상 모델로 적합한 점이 많다. 활성산소에 의한 지질 과산화반응, 단백질 산화 그리고 항산화제의 파괴 및 세포의 파괴 등을 이 실험법을 이용하여 조사할 수 있다. 무엇보다 자외선에 의한 피부노화를 방어할 수 있는 피부 보호물질을 검색하는데 있어서 유익할 것으로 생각된다.
대상 데이터
EDTA, luminol, 증감제로 사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 FeCl3 · 6H2O는 Junsei Chemical Co.
Ethyl acetate 분획으로부터 aglycone 제조: ethyl acetate 분획에서 얻은 파우더 일부는 산 가수분해 반응을 이용하여 당을 제거시킨 후 얻은 aglycone 파우더를 실험에 사용하였다. 실험 방법은 ethyl acetate 가용분 일정량에 H2SO4 및 acetone 용액을 넣고, 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류 · 냉각시킨다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany)의 6-channel LB9505 LT를, pH meter는 Istek (Korea) 제품을 사용하였다.
완충용액제조에 사용된 Na2HPO4 · 12H2O, NaH2PO4 · 2H2O, NaCl, trizma base, HCl 그리고 ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetate (EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 기질로 사용된 L-tyrosine과 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, 효소로 사용된 tyrosinase (9.3 mg solid, 5,370 units/mg solid), elastase (4.5 mg protein/mL, 6.5 units/mg protein)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol, L-ascorbic acid, arbutin, oleanolic acid는 Sigma (USA)에서 구입하였다.
기타 FeCl3 · 6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea) 제품을 사용하였다.
비교물질은 대표적인 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid를 사용하였으며 L-ascorbic acid의 총항산화능은 1.50 µg/mL 로 나타났다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 107 cells/ mL이었다.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol, L-ascorbic acid, arbutin, oleanolic acid는 Sigma (USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 며느리배꼽은 2008년 12월 청량리 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
완충용액제조에 사용된 Na2HPO4 · 12H2O, NaH2PO4 · 2H2O, NaCl, trizma base, HCl 그리고 ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetate (EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student’s t-test를 행하였다.
이론/모형
DPPH 실험법은 매우 간편하고 짧은 시간에 결과를 알 수 있기 때문에, 천연물 추출물의 항산화 물질을 검색하는 경우나 항노화 화장품 원료들의 비교 평가 시에 이용하기 적합하다. 며느리배꼽 추출물 대한 이러한 free radical 소거활성 측정은 DPPH법을 통하여 확인하였다. 실험방법은 MeOH에 용해시킨 0.
성능/효과
1) 며느리배꼽 추출물의 free radical 소거능력(FSC50)은 50 % EtOH 추출물인 경우 39.94 µg/mL, ethyl acetate 분획은 16.25 µg/mL, ethyl acetate 분획에서 당 제거시킨 aglycon 분획은 12.38 µg/mL으로 aglycone 분획이 가장 우수한 free radical 소거능력을 나타냈다.
3) 1O2으로 유도된 적혈구의 광용혈 현상에 있어서, 며느리배꼽 추출물 중에서 50 % EtOH 추출물과 ethyl acetate 분획은 농도 범위(1 ~ 50 µg/mL)에서 농도-의존적으로 1O2으로 유도된 용혈을 억제하였으며, 며느리 배꼽 추출물의 aglycon 분획은 1~ 10 µg/mL의 농도범위에서 다른 추출물 및 분획보다 1O2으로 유도된 용혈을 더 크게 억제하였다.
4) 며느리배꼽 추출물 중 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획은 tyrosinase 저해활성(IC50)이 각각 136.00 µg/ mL, 68.10 µg/mL로 나타났다.
대조군(control)은 τ50이 30 min으로 오차범위 ± 2.8 min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
며느리배꼽 추출물들의 세포보호 효과는 10µg/mL에서 ethyl acetate 분획 (43.70 min) < 50 % EtOH 추출물 (44.30 min) < aglycon 분획 (129.20 min) 순으로 증가하였고, 비교물질로 사용한 지용성 항산화제 (+)-α-tocopherol의 세포 보호효과는 10 µg/mL에서 38.00 min으로 나타났다.
50 µg/mL 로 나타났다. 며느리배꼽의 50 % EtOH 추출물과 ethyl acetate 분획 및 aglycon 분획 모두 L-ascorbic acid 보다 훨씬 뛰어난 활성산소 소거활성을 나타내었다.
88 µg/mL에 비해서도 큰 tyrosinase 저해활성을 보였다(Figure 5). 비교물질인 arbutin에 비해 며느리배꼽 추출물의 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획의 tyrosinase 저해활성은 각각 1.67배, 3.33배 더 크다는 것을 알 수 있다. 따라서 며느리배꼽 추출물의 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획을 화장품에 응용할 경우 미백효과가 클 것으로 사료된다.
특히 며느리배꼽의 aglycon 분획은 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol와 비교하여 볼 때 동일 농도에서 우수한 세포보호 활성을 나타내었다.
후속연구
활성산소에 의한 지질 과산화반응, 단백질 산화 그리고 항산화제의 파괴 및 세포의 파괴 등을 이 실험법을 이용하여 조사할 수 있다. 무엇보다 자외선에 의한 피부노화를 방어할 수 있는 피부 보호물질을 검색하는데 있어서 유익할 것으로 생각된다. 따라서 이 실험법을 이용하여 활성산소에 대한 천연물 추출물의 세포보호 효과를 측정할 수 있다.
이상의 결과들로부터 며느리배꼽 추출물의 항산화 활성과 항균 활성 그리고 ethyl acetate 분획과 aglycon 분획의 tyrosinase와 elastase의 저해활성으로부터 며느리 배꼽 추출물의 항산화, 항노화 및 항균 화장품으로의 응용 가능성을 시사한다.
이는 광노화를 방어하고 자외선으로부터 보호제를 개발하는데 있어서 1O2의 중요한 역할을 시사하는 것이다[4,5]. 주로 UVA에 의해 유도되는 1O2을 비롯한 ROS가 광노화의 원인이 되기 때문에 자외선 노출 후 항산화제에 의한 ROS의 감소는 피부 광노화를 예방하고 최소화시키기 위해서 계속적으로 연구되어야할 것이다. 즉, 항산화 물질들은 활성산소를 제거시키거나 생성을 억제시킴으로써 과량 생성된 활성산소에 의해 발생한 각종 질병의 예방 및 치료와 피부 노화억제를 목적으로 이용될 수 있을 것으로 추정되고 있다[6].
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
산소의 위험한 성질은 무엇인가?
대기 중에 존재하는 산소는 생명유지에 필수불가결한 요소이나 그 이면에 산화변성이라는 위험한 성질을 지니고 있어 이를 잘 제어하는 것이 중요하다. 아울러 현재 노화연구 분야에서 가장 주목을 받고 있는 free radical 설[1]에 의하면 생물은 나이에 따라 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 손상이 증가하는데, 이들 ROS는 생체가 외부로부터의 방사선, 자외선 등에의 노출, 대기오염 물질, 항생제의 남용과 더불어 체내의 생화학적 반응에 의해 생성되며, 여러 가지 문제를 야기시킨다고 알려져 있다[2,3].
활성산소종은 어떻게 생성되는가?
대기 중에 존재하는 산소는 생명유지에 필수불가결한 요소이나 그 이면에 산화변성이라는 위험한 성질을 지니고 있어 이를 잘 제어하는 것이 중요하다. 아울러 현재 노화연구 분야에서 가장 주목을 받고 있는 free radical 설[1]에 의하면 생물은 나이에 따라 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 손상이 증가하는데, 이들 ROS는 생체가 외부로부터의 방사선, 자외선 등에의 노출, 대기오염 물질, 항생제의 남용과 더불어 체내의 생화학적 반응에 의해 생성되며, 여러 가지 문제를 야기시킨다고 알려져 있다[2,3]. 광노화는 특히 태양광선에 노출되는 신체 부위에서 자외선에 의해 야기될 수 있다.
Persicaria perfoliata는 전통적으로 무엇으로 사용되어 왔는가?
며느리배꼽(Persicaria perfoliata)은 원산지가 아시아지역인 마디풀과의 한 종류이다. 며느리배꼽은 전통적으로 해독제, 해열제, 이뇨제 등으로 사용되어 왔으며, 기침이나 백일해 등 호흡기 질환에도 사용되어 왔다[9,10]. 며느리배꼽 추출물의 주요 성분으로는 ferulic acid, vanillic acid, quercetin, caffeic acid, protocatechuic acid 등이 함유되어 있다고 알려져 있다[11-13].
참고문헌 (14)
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