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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 치콘 추출물의 항산화 활성 및 정상 신경세포를 이용한 치콘 추출물의 신경세포 보호 효능을 살펴 치콘을 이용한 식·의약 기능성 소재 개발을 위한 기초자료로 사용하고자 한다.
- 자연계에 널리 분포되어 있는 페놀성 물질은 생리활성 중 항산화, 항염, 항균 활성 등이 보고되어지고 있으며 또한 페놀성 물질과 항산화 활성 간의 상관관계에 대한 많은 연구들이 진행되어지는 추세이다. 따라서 치콘의 총 폴리페놀과총 플라보노이드 함량을 분석함으로써 항산화 활성에 대한 기초 자료로 이용하고자 하였다. 치콘의 열수 및 에탄올 추출물의 수율은 35.
- 본 연구는 치콘 추출물의 항산화 효능을 확인하고자 물과 에탄올로 추출하였다. 치콘에 포함된 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 에탄올 추출물(37.
- 이렇게 분해된 산소와 물은 생체 대사에 이용 되는 것으로 보고되어지고 있다. 본 연구에서는 이러한 SOD 와 CAT를 신경 세포에서 치콘 추출물을 처리하여 확인하였다. SOD의 경우 약 70%의 활성을 나타냈던 과산화수소 손상군에 비하여 치콘 추출물 처리군에서 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며 열수와 에탄올 추출물의 유사한 결과를 확인하였다.
제안 방법
- ABTS 라디칼을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리 라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Park과 Kim(12)의 방법을 응용하여 7.0 mM ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12～16시간 동안 반응시켰다. 이를 410 nm에서 흡광도가 1.
- Gallic acid(Sigma Chemical Co.)를 0～200 μg/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였고 gallic acid equivalents (mg GAE/g extract)로 나타내었다.
- 그리고 RNase A 10 μg/mL와 프로피디움 요오드화물 0.05 mg/mL를 1 mL의 PBS에 넣어서 세포에 넣고 30분간 37℃에서 방치 후 분석기로 측정을 하였다(FACS-caliber, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).
- 본 연구에서는 항산화 활성을 측정하기 위해치콘의 열수 및 에탄올 추출물에 대하여 각각 0.43±0.9와 0.92±0.1 mM FeSO4 eq.
- 세포를 24-well plates에 5×104 cells/mL 농도로 1.0 mL씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양하고 각 시료를 최종 농도(0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 그리고 2.0 mg/mL)가 되도록 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 신경 세포를 이용하여 치콘의 열수 및 에탄올 추출물을 처리한 후 세포의 생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. 치콘 추출물을 농도별로 처리한 결과 열수 및에탄올 추출물 모두에서 1.
- 11, Whatman, Maidstone, England)로 잔여물을 제거한 후 rotary vacuum evaporator(EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고 동결건조 하였다. 에탄올 추출은 치콘 건조 분말 시료 20 g에 에탄올 200 mL를 첨가하여 상온에서 120 rpm의 진탕기로 24시간씩 3회 추출한 후 동일한 방법으로 여과와 농축을 하고 동결건조 하였다.
- 이는 버섯이 포함하고 있는 생리활성 유효물질의 성분이 차이가 있기 때문에 각각의 버섯이 다양한 세포 및 동물모델에서 효능의 차이가 나는 것으로 판단된다. 이러한 결과로 본 연구에서는 이후 세포 단계에서의 치콘 추출물의 최고 농도를 0.5 mg/mL로 결정하였다.
- 즉, 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ 및 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1: (v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(11)을 응용하여 추출물 1.0 mL에 1.0 N Folin-Ciocalteau 시약 및 20% Na2CO3용액을 각 1.0 mL씩 각각 처리한 후 25～26℃에서 30분 방치한 후 분광광도계(SECOMAM, Ales, France)를 이용하여 705 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid(Sigma Chemical Co.
- 물 추출은 치콘 건조 분말 시료 10 g을 3차 증류수 500 mL의 95℃에서 150분 동안 추출하였다. 추출물은 여과지(No. 11, Whatman, Maidstone, England)로 잔여물을 제거한 후 rotary vacuum evaporator(EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고 동결건조 하였다. 에탄올 추출은 치콘 건조 분말 시료 20 g에 에탄올 200 mL를 첨가하여 상온에서 120 rpm의 진탕기로 24시간씩 3회 추출한 후 동일한 방법으로 여과와 농축을 하고 동결건조 하였다.
대상 데이터
- 신경 세포의 배양은 DMEM 배지에 10% 불활성시킨 FBS 를 첨가하고 항생제를 mL당 10 μg 넣은 것을 사용하였다. 10～12번의 계대배양을 통해 세포가 안정된 상태에서 실험을 진행하였다. 배양기의 온도는 37℃였으며 5%의 농도로 CO2를 사용하였다.
- 또한, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin은 Invitrogen사(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 치콘은 재래시장(Busan, Korea)에서 구입하여 건조하여 분쇄 후 사용하였다. 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), potassium persulfate, 2,4,6-tripyridyl-S-triazine(TPTZ)은 Sigma Chemical Co.
- 그 외의 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용된 시료 추출을 위한 용매는 물과 에탄올을 사용하였다. 물 추출은 치콘 건조 분말 시료 10 g을 3차 증류수 500 mL의 95℃에서 150분 동안 추출하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 항산화활성 측정에 사용된 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)과 catalase assay kit, superoxide dismutase assay kit는 Sigma에서 구입하였으며, 세포 배양계에서 항산화 작용을 측정하기 위해 사용한 정상 신경세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 또한, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin은 Invitrogen사(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 Graph Pad Prism(Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 Student t-test one way를 이용하였으며 Duncan’s new multiple range test 으로 사후검증 하였다.
이론/모형
- FRAP 측정은 Benzie와 Strain(13)의 방법을 응용하여 진행하였다. 즉, 300 mM acetate buffer(pH 3.
- 세포의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 세포를 24-well plates에 5×104 cells/mL 농도로 1.
성능/효과
- 10 mM FeSO4 eq./mg extract를 나타내었으며 본 연구에서 사용한 치콘 추출물이 돼지감자잎보다 항산화 효능이 우수함을 확인하였다.
- 227 mM Trolox eq./mg extract와 비교하였을 때 치콘 추출물이 고추잎 추출물보다 우수한 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 것을 확인하였다. 또한, 치콘의 항산화 활성을 분석하기 위하여 Lee 등(15)은 엽색이 노란색인 Kibora, Metafora, Vintor, Halifax 4종과 붉은색의 Redoria의 DPPH 라디칼 소거활성을 분석한 결과 1.
- 1 mM FeSO4 eq./mg extract의 활성을 확인하였으며 마찬가지로 양성대조군인 BHT와 비교하였을 때 치콘에탄올 추출물이 유사한 활성을 나타낸 것으로 확인되었다 (Table 2). 소재는 다르지만 실험의 방법이 같고 유사한 생리활성을 나타내는 기존의 연구 중 Kim 등(10)의 보고에 따르면 돼지감자잎 에탄올 추출물의 경우 0.
- 5 mg/mL 농도에서 발현량이 과산화수소 손상군과 비교하였을 때 증가한 것을 확인하였고 반대로 세포사를 유도하는 단백질인 Bax의 경우 치콘 추출물에서 유의적으로 발현량이 감소하였으며 특히 에탄올 추출물의 경우 동일 농도에서 열수 추출물보다 감소한 것을 확인하였다. Bcl-2 대비 Bax의 비율을 확인하였을 때 정상군에 비해 산화적 손상군에서 단백질 발현량이 증가한 것을 확인하였고 산화적 손상군에 치콘 추출물을 같이 처리하였을 때 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. Lee 등(18)의 연구에서는 노루궁뎅이 버섯 가수 분해 추출물의 경우 0.
- Fig. 4에서 확인한 Bcl-2와 Bax 단백질은 발현량에 따라 세포사를 조절하는 역할을 하는데 세포사를 억제하는 단백질인 Bcl-2의 경우 치콘 열수와 에탄올 추출물 0.5 mg/mL 농도에서 발현량이 과산화수소 손상군과 비교하였을 때 증가한 것을 확인하였고 반대로 세포사를 유도하는 단백질인 Bax의 경우 치콘 추출물에서 유의적으로 발현량이 감소하였으며 특히 에탄올 추출물의 경우 동일 농도에서 열수 추출물보다 감소한 것을 확인하였다. Bcl-2 대비 Bax의 비율을 확인하였을 때 정상군에 비해 산화적 손상군에서 단백질 발현량이 증가한 것을 확인하였고 산화적 손상군에 치콘 추출물을 같이 처리하였을 때 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.
- 본 연구에서는 이러한 SOD 와 CAT를 신경 세포에서 치콘 추출물을 처리하여 확인하였다. SOD의 경우 약 70%의 활성을 나타냈던 과산화수소 손상군에 비하여 치콘 추출물 처리군에서 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며 열수와 에탄올 추출물의 유사한 결과를 확인하였다. 최고 농도인 0.
- 3A). 그리고 CAT의 경우에서도과산화수소 손상군에 비하여 치콘 추출물 처리군에서 농도의존적인 증가를 확인하였다(Fig. 3B). 기존 연구에서는 세포단계에서 항산화 효소 활성을 분석하였을 때 정상군에 비해 손상군의 효소 활성이 증가하는 결과를 확인하였다고 보고되어지는데 이는 효소계에서 외부로부터 받은 자극이나 독성에 대하여 세포 자체적으로 보호하기 위해 방어기작적인 요소로 항산화 효소가 활성화되어지는 것을 확인하였고 천연물 유래의 물질을 처리하였을 때 활성이 증가한다고 보고하였다(17).
- 2A). 또한 에탄올 추출물에서도 유사한 결과를 확인하였는데 동일한 농도 조건에서 각각 35.8, 28.7, 22.1 그리고 17.1%를 나타내었다(Fig. 2B). 이와 같은 결과는 치콘 추출물이 2.
- 5 mg/mL 농도에서 95% 이상의 활성과 CAT는 손상그룹에 비해 2배 이상의 활성을 각각 확인하였다. 또한 치콘 추출물이 세포사와 관련이 있는 단백질인 Bax와 Bcl-2의 발현을 조절하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 치콘 추출물이 산화적 손상의 억제를 통해 세포를 보호하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 기존 연구에서는 세포단계에서 항산화 효소 활성을 분석하였을 때 정상군에 비해 손상군의 효소 활성이 증가하는 결과를 확인하였다고 보고되어지는데 이는 효소계에서 외부로부터 받은 자극이나 독성에 대하여 세포 자체적으로 보호하기 위해 방어기작적인 요소로 항산화 효소가 활성화되어지는 것을 확인하였고 천연물 유래의 물질을 처리하였을 때 활성이 증가한다고 보고하였다(17). 본 연구 결과를 바탕으로 치콘을 이용한 에탄올 추출물과 열수 추출물이 두 종류의 항산화 효소 활성이 우수한 것을 확인하였으며, 결과적으로 치콘 추출물이 세포 내에서 항산화 효소계에 작용하며 그 활성이 산화적 손상에 대하여 증가시키는 것을 확인하였다.
- 신경 세포에 총 2.5 mM 과산화수소 처리에 의해 사멸된 세포사 수준이 대조군에서는 40% 이상을 나타내었지만, 치콘 열수추출물을 처리한 경우 농도 의존적으로 그 수준이 감소하는 것을 확인하였고 0.0625, 0.125, 0.25 그리고 0.5 mg/mL의 농도에서 각각 33.5, 26.2, 19.8 그리고 12.3%를 나타내었다(Fig. 2A). 또한 에탄올 추출물에서도 유사한 결과를 확인하였는데 동일한 농도 조건에서 각각 35.
- 0 mM의 H2O2만을 처리하였을 때 세포사는 약 30% 미만이라고 보고 하였다. 이는 본 연구의 치콘 추출물의 세포 보호효능이 우수하다는 결과를 확인하였다.
- 0 mM의 과산화수소보다 증가한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 사용한 치콘 열수(Fig. 4A) 및 에탄올 (Fig. 4B) 추출물이 세포사와 관련된 단백질 발현을 조절하는 것을 의미한다.
- 신경 세포를 이용하여 치콘의 열수 및 에탄올 추출물을 처리한 후 세포의 생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. 치콘 추출물을 농도별로 처리한 결과 열수 및에탄올 추출물 모두에서 1.0 mg/mL 농도 이상에서 특이적으로 세포 생존에 기인하지 않는 것을 확인하였다(Fig. 1). Lee 등(16)의 연구에 따르면 능이버섯 추출물의 신경세포에서 2.
- 치콘에 포함된 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 에탄올 추출물(37.3±5.2 mg/GAE/g extract) 과 열수 추출물(36.3±1.0 mg/GAE/g extract)이 유사한 총 폴리페놀 함량을 포함하고 있었으며, 총 플라보노이드 함량은 물 추출물이 47.0±3.8 mg CE/g extract 그리고 에탄올 추출물이 53.9±5.1 mg CE/g extract를 나타내었다.
- ABTS 를 이용한 라디칼 소거활성, FRAP를 이용한 환원력을 통한 항산화 활성을 측정한 결과에서도 치콘 추출물이 항산화 효과를 나타내었다. 한편, 세포 독성을 살펴보기 위하여 신경세포를 이용하여 MTT assay를 수행한 결과, 세포의 생존율은 1.0 mg/mL의 농도 이상에서는 생존에 영향을 미치지 않았고 신경세포 보호효능 실험에서는 2.5 mM의 H2O2로 유발 시킨 산화적 손상에 대해 농도 의존적인 신경세포 보호 효과가 있었으며, 항산화 효소 활성을 SOD와 CAT로 분석한 결과 SOD는 0.5 mg/mL 농도에서 95% 이상의 활성과 CAT는 손상그룹에 비해 2배 이상의 활성을 각각 확인하였다. 또한 치콘 추출물이 세포사와 관련이 있는 단백질인 Bax와 Bcl-2의 발현을 조절하는 것을 확인하였다.
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