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문제 정의
- 그러나, Origanum majorana 추출물의 항산화 효과 및 기전에 관한 연구결과는 많이 보고되지 않고 있다. 따라서, 본 연구에서는 Origanum majorana 에탄올추출물의 유리 라디칼 소거활성과 지질과산화에 미치는 영향 등 항산화 효과를 조사하고자 한다.
- 본 연구의 목적은 오레가노 추출물의 유리 라디칼 소거 및 지질과산화 억제 등 항산화 효과를 조사하기 위함이다. Pyrogallol의 억제율을 100%로 기준하였을 때, DPPH 라디칼을 50% 억제시키는데 필요한 오레가노 함량은 21.
제안 방법
- (1993)의 방법에 따라 측정하였다. DPPH 용액(45 ㎍･ml-1 methanol)을 추출물과 혼합한 다음 515 nm에서 흡광도의 감소를 30초 간격으로 5분간 측정하였다. Free radical 소거활성은 pyrogallol 용액(125 ㎍･ml-1 DMSO)의 흡광도 감소를 100%로 기준하여 표기하였다.
- Rat liver mitochondria were incubated with FeSO4/ascorbic acid in the absence or presence of oregano extracts. Lipid peroxidation was determined by measuring the release of TBARS. Each bar represents the mean±SD of triplicate determinations.
- 미토콘드리아 배양액의 지질과산화는 Stacey and Klaassen(1981)의 방법에 따라 excitation 파장 530 nm와 emission 파장 590 nm에서 형광도를 측정함하여 결정하였다. TBARS 농도 측정을 위해 1,1,3,3,-tetraethoxypropane을 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다. 또한, 양성 대조군으로 butylated hydroxytoluene(BHT)를 사용하여 지질과산화 억제를 비교 조사하였다.
- 44 mM H2O2 용액들을 첨가하고 혼합한 뒤 5분 후에 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. Trolox를 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였고, TAC 활성은 nmol Trolox equivalent로 표기하였다. 또한, 양성 대조군으로 α-tocopherol을 사용하여 총항산화능을 비교 조사하였다.
- 또한, 양성 대조군으로 α-tocopherol을 사용하여 DPPH 소거활성을 비교 조사하였다.
- 또한, 양성 대조군으로 α-tocopherol을 사용하여 총항산화능을 비교 조사하였다.
- TBARS 농도 측정을 위해 1,1,3,3,-tetraethoxypropane을 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다. 또한, 양성 대조군으로 butylated hydroxytoluene(BHT)를 사용하여 지질과산화 억제를 비교 조사하였다.
- ORAC은 표준시약 함량과 AUC 간의 회귀곡선을 이용하여 nmol gallic acid equivalent로 표기하였다. 또한, 양성 대조군으로 catechin을 사용하여 peroxyl radical 소거활성을 비교 조사하였다.
- 랫드 간 미토콘드리아(0.5 mg 단백질･ml-1)를 이용하여 오레가노 추출물의 지질과산화에 미치는 영향을 조사하였다. 지질과산화는 hydroxyl radical을 생성하는 FeSO4/ascorbic acid로 유발시켰으며, TBARS 농도를 측정함으로써 결정하였다.
- (주)오리엔트바이오로부터 구입한 6주령 수컷 Sprague-Dawley 랫드를 실험동물로 사용하였다. 본 실험실에서 사료와 물은 무제한 공급하였고, 사육실 온도는 20-25℃를 유지하였으며, 명암은 12시간 주기로 조절하였다. 1주일의 적응기간을 거친 다음 간을 절제한 후 Hovius et al.
- 5 mg 단백질･ml-1)를 이용하여 오레가노 추출물의 지질과산화에 미치는 영향을 조사하였다. 지질과산화는 hydroxyl radical을 생성하는 FeSO4/ascorbic acid로 유발시켰으며, TBARS 농도를 측정함으로써 결정하였다. 표준시약 함량과 excitation 파장 530 nm/emission 파장 590 nm에서의 형광도 간의 회귀방정식은 Y=7.
- 9 nmol gallic acid와 대등한 수준이었다. 지질과산화에 대한 억제효과는 이황화철/아스코르빈산에 의해 유도된 랫드 간 미토콘드리아를 이용하여 조사하였다. 오레가노 추출물 20 및 50 μg은 TBARS 수준을 각각 20 및 64% 억제시켰다.
- 8 μg이었다. 총항산화 활성은 강력한 자유라디칼에 대한 총항산화능으로 측정하였다. 오레가노 추출물 7.
- 추출물에 0.35 M acetate 완충용액과 0.89 mM 2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt 용액 및 0.44 mM H2O2 용액들을 첨가하고 혼합한 뒤 5분 후에 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출물의 지질과산화 억제 효과는 간 미토콘드리아 배양액의 thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) 농도를 측정함으로써 결정하였다. 간 미토콘드리아(0.
- (2002)의 방법에 따라 추출물에 6×10-5 mM fluorescein 용액을 첨가하고 37℃에서 10분간 가열한 다음 19 mM 2,2'-azobis(2-methyl-propionamidine) dihydrochloride(AAPH) 용액을 첨가한 뒤, excitation 파장 485 nm와 emission 파장 530 nm에서 2분 간격으로 36분간 측정하였다. 표준시약으로 gallic acid를 사용하였으며, 표준시약과 추출물의 area under the curve(AUC)를 측정하였다. ORAC은 표준시약 함량과 AUC 간의 회귀곡선을 이용하여 nmol gallic acid equivalent로 표기하였다.
대상 데이터
- (주)오리엔트바이오로부터 구입한 6주령 수컷 Sprague-Dawley 랫드를 실험동물로 사용하였다. 본 실험실에서 사료와 물은 무제한 공급하였고, 사육실 온도는 20-25℃를 유지하였으며, 명암은 12시간 주기로 조절하였다.
- 간 미토콘드리아(0.5 mg･ml-1)를 10 μM FeSO4와 100 μM ascorbic acid와 함께 추출물 농도별로 37℃에서 60분간 배양하였다.
- 오레가노(Origanum majorana L.)는 경기도 양주의 재배농가에서 구입하여 본 연구의 시료로 사용하였다. 분쇄한 시료 50 g을 95% 에탄올(HPLC-grade)과 혼합한 후 4시간 가열하여 추출하였다.
- 항산화 활성 분석에 사용된 시약들은 Sigma사(MO, USA)로부터 구입하였고, dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Cambrex사(USA)로부터 구입하였다. 본 연구에 사용된 모든 화합물과 용매들은 분석급 이상으로 사용하였다.
데이터처리
- 추출물 농도별 항산화에 미치는 효과는 일원 분산분석을 사용하여 조사하였으며, 농도별 평균값의 차이는 Duncan’s multiple range test(Steel and Torrie, 1980)를 사용하여 p＜0.05에서 유의성을 조사하였다.
이론/모형
- DPPH free radical 소거활성은 Malterud et al.(1993)의 방법에 따라 측정하였다. DPPH 용액(45 ㎍･ml-1 methanol)을 추출물과 혼합한 다음 515 nm에서 흡광도의 감소를 30초 간격으로 5분간 측정하였다.
- (2002)의 방법에 따라 추출물에 6×10-5 mM fluorescein 용액을 첨가하고 37℃에서 10분간 가열한 다음 19 mM 2,2'-azobis(2-methyl-propionamidine) dihydrochloride(AAPH) 용액을 첨가한 뒤, excitation 파장 485 nm와 emission 파장 530 nm에서 2분 간격으로 36분간 측정하였다.
- Total antioxidant status(총항산화능)는 Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC) 방법을 수정한 Erel(2004)의 방법에 따라 TAC를 측정하였다. 추출물에 0.
- 단백질 함량은 bovine serum albumin(BSA)을 표준시약으로 사용하여 Bradford(1976)의 방법에 따라 측정하였다.
- 5 mg･ml-1)를 10 μM FeSO4와 100 μM ascorbic acid와 함께 추출물 농도별로 37℃에서 60분간 배양하였다. 미토콘드리아 배양액의 지질과산화는 Stacey and Klaassen(1981)의 방법에 따라 excitation 파장 530 nm와 emission 파장 590 nm에서 형광도를 측정함하여 결정하였다. TBARS 농도 측정을 위해 1,1,3,3,-tetraethoxypropane을 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
- 추출물내 총페놀 함량은 Singleton and Orthofer(1999)의 방법에 따라 추출물에 0.08 N Folin-Ciocalteu 시약을 첨가하고 실온에서 6분간 방치한 다음 3% Na2CO3 용액을 첨가하고 90분간 방치한 뒤 760 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 표준시약으로 gallic acid를 사용하여 표준곡선을 작성하였고, 총페놀 함량은 nmol gallic acid equivalent로 표기하였다.
성능/효과
- 50% DPPH radical 소거활성에 필요한 α-tocopherol의 함량이 10.9 μg인 것과 비교해 볼 때, 오레가노 추출물의 DPPH radical 소거활성이 매우 높은 것을 알 수 있었다.
- 0226X(Y는 660 nm에서의 흡광도이며, X는 Trolox nmol)이었다. Trolox의 함량이 증가함에 따라 660 nm에서의 흡광도가 유의적으로(r2=0.996, p＜0.05) 감소하였다. 오레가노 추출물의 함량별 TAC는 Fig.
- 따라서, 본 연구 결과들은 오레가노 추출물의 강력한 항산화 효능을 나타내 보이고 있으며, 이러한 항산화 효과는 적어도 자유라디칼의 산화 억제와 지질과산화 억제에 기인하는 것으로 사료된다. 향후 오레가노 추출물의 항산화 성분 분석 및 동정 및 항산화 기전 연구와 더불어 천연 항산화제로써 개발 가능성을 시사하고 있다.
- 양성 대조군으로 사용한 α-tocopherol 7.5 μg의 TAC는 15.4 nmol Trolox equivalent로 나타나, 오레가노의 총항산화능은 α-tocopherol과 동등한 수준으로 매우 높음을 알 수 있었다.
- 양성 대조군으로 사용한 BHT 15 및 50 μg의 지질과산화 억제율은 각각 21 및 71%로 나타나, 오레가노의 지질과산화 억제효과는 BHT와 동등한 수준으로 매우 높음을 알 수 있었다.
- 양성 대조군으로 사용한 catechin 0.2 및 2 μg의 ORAC는 각각 0.72 및 2.37 nmol gallic acid equivalent로 나타나, 오레가노 추출물의 AAPH에 의해 생성된 peroxyl radical에 대한 소거활성이 매우 높음을 알 수 있었다.
- 오레가노 추출물 0.1 μg 함량의 ORAC는 0.92 nmol gallic acid equivalent이었으며, 추출물 함량이 증가함에 따라 ORAC도 증가하여, 0.2 및 0.4 μg의 오레가노 추출물의 ORAC는 각각 1.43 및 2.35 nmol gallic acid equivalent로 나타났다.
- 오레가노 추출물 1.5 μg 함량의 TAC는 6.6 nmol Trolox equivalent이었으며, 추출물 함량이 증가함에 따라 TAC도 비례적으로 증가하여 7.5, 15 및 37.5 μg 함량에서는 각각 15.1, 31.4 및 53.1 nmol Trolox equivalent를 나타내었다.
- 오레가노 추출물 2 μg 첨가는 TBARS 함량이 1.019 nmol로 나타나, 지질과산화를 약 14% 감소시켰다.
- 오레가노 추출물 3.75 μg의 총페놀 함량은 6.6 nmol gallic acid equivalent이었으며, 추출물 함량이 증가함에 따라 총페놀 함량도 비례적으로 증가하여, 30, 75 및 93.75 μg 함량에서는 각각 40.5, 83.9 및 116.4 nmol gallic acid equivalent 로 나타나, 오레가노 추출물의 총페놀 함량이 매우 높은 것으로 관찰되었다.
- 추출물 1 μg의 radical 소거활성은 9.8%이었고, 추출물 함량이 증가할수록 소거활성도 증가하여, 10, 25 및 125 μg의 추출물은 각각 36.6, 53.1 및 82.7%의 소거활성을 나타내었다.
- 추출물 함량과 free radical 소거활성 간의 회귀분석 결과(Y=12.33+1.73X, Y는 radical 억제%이며, X는 추출물 함량), 50%의 radical 소거활성에 필요한 오레가노 추출물의 함량은 21.8 μg으로 나타났다.
- 추출물 함량이 증가함에 따라 TBARS 함량도 유의적으로 감소하여, 20 및 50 μg의 추출물 첨가는 지질과산화를 각각 약 20% 및 64% 정도 억제시켰으며, 200 μg의 추출물 첨가는 지질과산화를 98% 정도까지 억제시켰다.
후속연구
- 따라서, 본 연구 결과들은 오레가노 추출물의 강력한 항산화 효능을 나타내 보이고 있으며, 이러한 항산화 효과는 적어도 자유라디칼의 산화 억제와 지질과산화 억제에 기인하는 것으로 사료된다. 향후 오레가노 추출물의 항산화 성분 분석 및 동정 및 항산화 기전 연구와 더불어 천연 항산화제로써 개발 가능성을 시사하고 있다.
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