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문제 정의
- 본 연구에서는 주로 식품에서 많이 이용되지 않았던 fucoidan과 lutein의 병용에 의하여 AAPH 유도 세포 손상에 의한 손상 방어 효과를 측정하여, 이를 이용한 복합 항산화 기능성 소재로의 이용 가치를 향상시키고자 하였다.
제안 방법
- 37℃에서 1mM AAPH를 6시간 동안 처치한 후 30분간 DCFH-DA(10μM)를 반응시켰다. DCFH-DA의 존재 하에서 생성된 형광의 변화를 excitation, 485 ㎚ 및 emission, 530 ㎚에서 30분간 Fluorescence Microplate Reader FL500(Bio-Tek, Singapore)으로 측정하였다
- Lipid peroxidation의 정량 측정은 시료를 일정 시간 동안 처리한 THP-1 세포의 배양 상층액과 세포 용해액 내의 TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) 측정으로 하였다(Fraga등 1988; Oh & Lee 2008).
- THP-1 세포를 배양한 후, 후코이단 및 루테인을 각각 1 ㎍/ ㎖ 및 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 항산화능을 측정하였다(Table 3). 양성 대조군으로 10 μM의 quercetin을 처리하여 비교하였을 때 두 시료 모두 유의적으로 높은 항산화능을 나타내었다.
- THP-1 세포에서 AAPH 유도 세포 독성에 대한 지질 과산화 억제 효과를 측정하였다(Fig. 1). 후코이단과 루테인의 병용 처리 농도는 최종 농도로 각각 1 ㎍/㎖와 10 ㎍/㎖가 되도록 하였다.
- 모든 실험은 3반복을 1회로 하여 2회 이상 반복 실험하였다. 통계 처리는 SAS version 9.
- 본 연구에서는 fucoidan과 lutein의 병용에 의하여 AAPH 유도 THP-1 세포의 손상에 의한 손상 방어 효과를 지질 과산화 억제 및 세포 항산화능 측정법을 이용하여 효과를 측정하였다. 후코이단과 루테인의 병용 처리에 의한 AAPH 유도 세포 독성에 대한 보호 효과를 측정한 결과, 후코이단 1 ㎍/㎖와 10 ㎍/㎖의 농도에서 각각 37% 및 40%로 나타났고, 루테인에서는 동일 농도에서 각각 25% 및 36%로 나타났다.
- 세포 내 반응성 산소족을 측정하기 위하여 fluorescent probe (2',7'-dichloro fluorescein diacetate, DCFH-DA, Molecular Probes, Seoul, Korea)를 이용하였다(Wolfe & Liu 2007).
- THP-1 세포는 24-well cell culture plate에 각각 5 × 105 cells을 접종하여 시험에 사용하였다. 시료 처리한 세포의 배지에 MTT(5 ㎎/㎖)를 각 well당 100 ㎕씩 투여한 후 4시간 동안 정치 배양하여 formazan을 형성시킨 후, PBS 용액으로 1회 세척 후 dimethylsulfoxide를 각 well당 300 ㎕씩 넣어 형성된 formazan을 녹여 분광광도계(model 6405, Genway Ltd., England)로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포의 생존 정도는 실험군의 값을 약물 처리를 하지 않은 대조군의 비로 나누어 백분율로 나타내었다.
- 후코이단 및 루테인의 단독 처리에 의한 세포 독성 효과를 in vitro에서 측정하였다(Table 1). 후코이단은 10 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖에서 각각 96% 및 87%의 세포 생존율은 나타내었고, 루테인은 동일 농도에서 각각 99% 및 82%의 세포 생존율은 나타내었다.
- 후코이단과 루테인에 의한 AAPH 유도 세포 독성에 대한 보호 효과를 측정하였다(Table 2). THP-1 세포에 1 mM AAPH를 전처리하고 24시간 후에 후코이단과 루테인을 0.
대상 데이터
- 루테인은 금잔화로부터 정제한 식품 첨가물용 루테인을 Yixin Pharmaceutical(Zhejiang, China)에서 구입하였고, 후코이단(85% sulfated polysaccharide)은 혜원 바이오테크(완도, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. AAPH(2,2`-Azobis(2-amidinopropane)) dihydrochloride, MTT(3-[4,5 dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-di-phenyltetrazolium bromide, TBARS(thiobarbituric acid reactive substances) 및 quercetin은 Sigma(St. Louis, MO, USA)로 부터, DCFHDA(2`,7`-dichloro fluorescein diacetate)은 Molecular Probes로부터 구입하였다.
- 루테인은 금잔화로부터 정제한 식품 첨가물용 루테인을 Yixin Pharmaceutical(Zhejiang, China)에서 구입하였고, 후코이단(85% sulfated polysaccharide)은 혜원 바이오테크(완도, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. AAPH(2,2`-Azobis(2-amidinopropane)) dihydrochloride, MTT(3-[4,5 dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-di-phenyltetrazolium bromide, TBARS(thiobarbituric acid reactive substances) 및 quercetin은 Sigma(St.
- 인체 단핵구 세포의 대표적 실험 모델인 THP-1 세포주(ATCC TIB-202)는 RPMI 1640(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지에 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, Gibco BRL), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 U/㎖ 페니실린을 첨가한 배지로 배양하였다. 배양은 37℃, 5% CO2 배양기에서 유지하였다.
데이터처리
- 24-well plate에 배양한 THP-1 세포 (5 × 10 5 cells/well)에 1 mM AAPH을 첨가하여 24시간 동안 추가 배양 후, 배양 상층액 200 ㎕와 TBARS 용액 400 ㎕를95℃에서 30분간 반응하여 532 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 기준으로 표준곡선에 따라 TBARS 값을 ㎎malondialdehydes/㎏ 시료로 계산하였다.
- 모든 실험은 3반복을 1회로 하여 2회 이상 반복 실험하였다. 통계 처리는 SAS version 9.1(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 평균과 표준오차를 구하였다.
이론/모형
- 세포의 생존율 측정은 MTT assay를 이용하였다(Carmichael 등 1987). THP-1 세포는 24-well cell culture plate에 각각 5 × 105 cells을 접종하여 시험에 사용하였다.
성능/효과
- 1 mM AAPH 전처리후, 후코이단 및 루테인의 각각 단독 처리에 의한 TBARS 값은 각각 0.6±0.05 및 0.5±0.02 nM MDA을 나타내었으며, 후코이단과 루테인의 병용 처리에 의한 TBARS 값은 0.2±0.05 nM MDA을 나타내어, 후코이단 및 루테인 각각 단독 처리보다 병용 처리에 의한 지질 과산화 억제 효과가 높게 나타났다.
- 후코이단과 루테인에 의한 AAPH 유도 세포 독성에 대한 보호 효과를 측정하였다(Table 2). THP-1 세포에 1 mM AAPH를 전처리하고 24시간 후에 후코이단과 루테인을 0.1, 1 및 10 ㎍/㎖로 처리한 후, 24시간 추가 배양하여 AAPH 유도 세포 독성에 대한 보호 효과를 측정한 결과, 두 시료 모두 농도 의존적으로 생존율이 증가하였다. 즉, 후코이단 1 ㎍/㎖와 10 ㎍/㎖의 농도에서 각각 37% 및 40%로 나타났고, 루테인에서는 동일 농도에서 각각 25% 및 36%로 나타났다.
- THP-1 세포에서 AAPH 유도에 의한 지질 과산화 정도는 1 mM AAPH 단독 처리 시의 TBARS 값은 0.8±0.03 nM MDA이었고, AAPH 전처리 후, 후코이단 및 루테인의 각각 단독 처리에 의한 TBARS 값은 각각 0.6±0.05 및 0.5±0.02 nM MDA을 나타내었으며, 후코이단과 루테인의 병용 처리에 의한 TBARS 값은 0.2±0.05nM MDA을 나타내었다.
- 5nM MDA을 나타내어 루테인이 높게 나타났고, 세포 항산화능 역시 동일 농도에서는 각각 40%와 56%로 루테인이 높게 나타났다. 따라서 두 시료의 처리에 있어서 전체적인 항산화능은 단독 투여 시 보다 높게 나타났으며, 주요한 항산화능을 선도하는 물질은 비록 후코이단 대비 10배 정도 높게 처리되었으나 루테인으로 사료된다.
- 두 시료의 병용 처리에 의한 세포 항산화능은 76%로 나타났다. 따라서 본 실험의 결과는 이를 이용한 복합 기능성 소재로의 이용에 기초적인 결과라고 사료된다.
- 양성 대조군으로 10 μM의 quercetin을 처리하여 비교하였을 때 두 시료 모두 유의적으로 높은 항산화능을 나타내었다.
- 두 시료의 병용 처리에 의한 세포 항산화능은 76%로 나타났다. 이의 결과로 볼 때, 두 시료의 병용 처리에 의한 지질 과산화 효능은 주로 루테인에 의하여 나타나는 것으로 사료된다. 즉, AAPH 유도에 의한 세포 독성 보호 효과에 있어서, 후코이단 1 ㎍/㎖ 및 루테인 10 ㎍/㎖에서 각각 37%와 36%로 서로 비슷하였고, 지질 과산화 억제 효능은 동일 농도에서 각각 0.
- 이의 결과로 볼 때, 두 시료의 병용 처리에 의한 지질 과산화 효능은 주로 루테인에 의하여 나타나는 것으로 사료된다. 즉, AAPH 유도에 의한 세포 독성 보호 효과에 있어서, 후코이단 1 ㎍/㎖ 및 루테인 10 ㎍/㎖에서 각각 37%와 36%로 서로 비슷하였고, 지질 과산화 억제 효능은 동일 농도에서 각각 0.6 nM 및 0.5nM MDA을 나타내어 루테인이 높게 나타났고, 세포 항산화능 역시 동일 농도에서는 각각 40%와 56%로 루테인이 높게 나타났다. 따라서 두 시료의 처리에 있어서 전체적인 항산화능은 단독 투여 시 보다 높게 나타났으며, 주요한 항산화능을 선도하는 물질은 비록 후코이단 대비 10배 정도 높게 처리되었으나 루테인으로 사료된다.
- 즉, 두 시료의 병용 처리에 의하여 정상세포 수준의 TBARS 값의 75% 수준까지 회복이 관찰되었다.
- 1, 1 및 10 ㎍/㎖로 처리한 후, 24시간 추가 배양하여 AAPH 유도 세포 독성에 대한 보호 효과를 측정한 결과, 두 시료 모두 농도 의존적으로 생존율이 증가하였다. 즉, 후코이단 1 ㎍/㎖와 10 ㎍/㎖의 농도에서 각각 37% 및 40%로 나타났고, 루테인에서는 동일 농도에서 각각 25% 및 36%로 나타났다.
- 후코이단은 10 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖에서 각각 96% 및 87%의 세포 생존율은 나타내었고, 루테인은 동일 농도에서 각각 99% 및 82%의 세포 생존율은 나타내었다. 즉, 후코이단과 루테인은 100 ㎍/㎖에서부터 THP-1 세포의 생존율에 영향을 미치기 시작하는 것으로 나타났다.
- 후코이단 및 루테인을 각각 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 항산화능을 측정한 결과, 양성 대조군으로 10 μM의 quercetin을 처리하여 비교하였을 때 두 시료 모두 유의적으로 높은 항산화능을 나타내었다.
- 본 연구에서는 fucoidan과 lutein의 병용에 의하여 AAPH 유도 THP-1 세포의 손상에 의한 손상 방어 효과를 지질 과산화 억제 및 세포 항산화능 측정법을 이용하여 효과를 측정하였다. 후코이단과 루테인의 병용 처리에 의한 AAPH 유도 세포 독성에 대한 보호 효과를 측정한 결과, 후코이단 1 ㎍/㎖와 10 ㎍/㎖의 농도에서 각각 37% 및 40%로 나타났고, 루테인에서는 동일 농도에서 각각 25% 및 36%로 나타났다. THP-1 세포에서 AAPH 유도에 의한 지질 과산화 정도는 1 mM AAPH 단독 처리 시의 TBARS 값은 0.
- 후코이단 및 루테인의 단독 처리에 의한 세포 독성 효과를 in vitro에서 측정하였다(Table 1). 후코이단은 10 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖에서 각각 96% 및 87%의 세포 생존율은 나타내었고, 루테인은 동일 농도에서 각각 99% 및 82%의 세포 생존율은 나타내었다. 즉, 후코이단과 루테인은 100 ㎍/㎖에서부터 THP-1 세포의 생존율에 영향을 미치기 시작하는 것으로 나타났다.
- 양성 대조군으로 10 μM의 quercetin을 처리하여 비교하였을 때 두 시료 모두 유의적으로 높은 항산화능을 나타내었다. 후코이단의 세포 항산화능은 40%이었고, 루테인은 56%를 나타내었다. 10 μM의 quercetin과 같은 정도의 항산화능을 나타내는 농도로 환산하였을 때, 후코이단의 경우는 0.
- 후코이단 및 루테인을 각각 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 항산화능을 측정한 결과, 양성 대조군으로 10 μM의 quercetin을 처리하여 비교하였을 때 두 시료 모두 유의적으로 높은 항산화능을 나타내었다. 후코이단의 세포 항산화능은 40%이었고, 루테인은 56%을 나타내었다. 10 μM의 quercetin과 같은 정도의 항산화능을 나타내는 농도로 환산하였을 때, 후코이단의 경우는 0.
후속연구
- 그러나 이 두 가지를 이용한 효과는 알려지지 않아, 본 실험의 결과를 이를 이용한 복합 기능성 소재로의 이용에 기초적인 결과라고 사료된다. 따라서 본 실험의 결과는 이를 이용한 복합 기능성 소재로의 이용에 기초적인 결과라고 사료되며, 향후 라디칼 소거의 의한 과산화물의 감소가 DNA 및 RNA 변화에 어떠한 영향을 미치는가에 대한 추가적인 연구가 필요하리라 사료된다.
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