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문제 정의
- 본 연구에서는 SCE가 카드뮴으로 유도된 세포독성을 억제하는 in vitro에서의 연구결과를 바탕으로, in vivo에서 rat에서의 간손상에 대한 SCE의 보호효과를 평가하였다. 일반적으로 카드뮴 중독성 간손상은 조직병리학적으로 소엽 중심성 괴사와 함께 괴사 조직 주변성 충·출혈이 인정되므로56,57), 이러한 조직병리학적 변화를 통해 다양한 해독물질들의 약리작용이 평가되어 왔다57-60).
- 본 연구에서는 계혈등 물추출물 (SCE; Spatholobi Caulis Extract)의 카드뮴 중독에 대한 간세포보호효과를 평가하고자, in vitro에서 카드뮴에 의해 유도되는 H4IIE cell의 세포독성에 대한 SCE의 세포독성억제효과를 평가하고, in vivo에서 카드뮴에 의해 유발되는 rat의 간손상에 대한 SCE의 간보호효과를 평가하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 계혈등 물추출물의 카드뮴 독성에 대한 간세포 보호효과를 평가하고자 in vitro에서 카드뮴에 의해 유도되는 세포독성에 대한 SCE의 억제효과를 평가하고, in vivo에서 카드뮴에 의해 유발되는 간손상에 대한 SCE의 간보호 효과를 평가하였다.
- 이에 본 연구에서는 계혈등 물추출물 (SCE)의 카드뮴 독성에 대한 간세포 보호효과를 평가하고자 in vitro에서 카드뮴에 의해 유도되는 세포독성에 대한 SCE의 억제효과를 평가하고, in vivo에서 카드뮴에 의해 유발되는 간손상에 대한 SCE의 간보호 효과를 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 12시간 동안 serum을 제거한 배지에서 H4IIE cell을 배양한 후, SCE를 12시간 동안 농도별로 처치하고, 이후 카드뮴을 10 μM로 12, 24시간 동안 처치하였다.
- H4ⅡE cell을 96 well plate에 5×104 cells/well로 분주한 다음 SCE를 농도별로 처치하여, 세포의 생존율을 구하였다.
- SCE가 카드뮴으로 유도되는 세포독성을 억제함을 확인하고, 카드뮴 유도 간독성에 대한 SCE의 효과를 동물모델에서 평가하였다.
- 2 μm filter로 여과하여 rat의 꼬리정맥을 통해 카드뮴 4 mg/kg을 주입하였으며, 양성대조군인 Sm군은 카드뮴 처치 전 Srivastava 등26)과 같이 silymarin을 100 mg/kg로 투여하였다. SCE의 효능을 평가하기 위해서는 카드뮴 처치 전 SCE를 30, 50 mg/kg로 투여하고 카드뮴을 처치하였고, Control군은 카드뮴 대신 꼬리 정맥으로 생리식염수를 주입하고, silymarin이나 SCE 대신 물을 투여 하였다. (Scheme.
- 간 실질조직의 일부를 샘플로 채취하여 10% 중성포르말린에 고정시킨 다음, 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3~4 μm의 절편을 제작하여 Hematoxylin-eosin 염색을 실시한 후 광학 현미경 (Nikon, Japan)하에서 관찰하였다. 간 실질 중 변성부위의 비율 (%/mm2 of hepatic parenchyma) 및 변성 간세포의 수 (N/1000 hepatocytes)를 자동영상분석장치 (DMI-300 Image Processing; DMI, Korea)를 이용하여 각각 평가하였다.
- 간 실질조직의 일부를 샘플로 채취하여 10% 중성포르말린에 고정시킨 다음, 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3~4 μm의 절편을 제작하여 Hematoxylin-eosin 염색을 실시한 후 광학 현미경 (Nikon, Japan)하에서 관찰하였다.
- 간독성을 유발하기 위하여 카드뮴을 saline에 녹인 후 0.2 μm filter로 여과하여 rat의 꼬리정맥을 통해 카드뮴 4 mg/kg을 주입하였으며, 양성대조군인 Sm군은 카드뮴 처치 전 Srivastava 등26)과 같이 silymarin을 100 mg/kg로 투여하였다.
- 세포에 10, 30, 100, 300 μg/ml의 농도로 SCE를 12시간 전처치한 후, 카드뮴 10 uM을 처치하여 12, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2의 환경이 유지되는 배양기 (Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 배양 후 생존세포에 MTT (0.1 mg/ml)를 50 ㎕넣고 4시간 배양한 후 배지를 조심스럽게 제거하고 생성된 formazan crystals를 dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 control cell에 대한 백분율로 나타내었다.
- 세포에 10, 30, 100, 300 μg/ml의 농도로 SCE를 12시간 전처치한 후, 카드뮴 10 uM을 처치하여 12, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2의 환경이 유지되는 배양기 (Sanyo, Japan)에서 배양하였다.
- 실험동물은 각 군당 5마리씩 아무런 처치를 하지 않은 군을 Normal군으로, 카드뮴으로 간독성을 유발한 군은 Cd군으로, silymarin을 투여하고 카드뮴을 처치한 군을 Sm군으로, SCE를 30, 50 mg/kg로 투여하고 카드뮴를 처치한 군을 각각 SCE 30군, SCE 50군으로, 카드뮴 대신 꼬리 정맥으로 생리식염수를 주입하고 silymarin이나 SCE 대신 물을 투여한 군을 Control군으로 하여 진행하였다.
- 카드뮴에 의한 간독성을 유발하기 위하여 Lee 등53)과 같이 카드뮴을 4 mg/kg 으로 rat의 꼬리정맥을 통해 주입하여 간독성을 유발하였으며, 양성대조군인 Sm은 Srivastava 등26)과 같이 silymarin을 100 mg/kg로 투여하였다.
- 카드뮴에 의해 유도된 간독성에 미치는 SCE의 효과를 평가하기 위하여 조직학적 평가를 하였다. 간 변성율은 Normal군과 Control군에서 각각 2.
- 혈청중 alanine amino- transferase(ALT), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH)는 Analysis kits (Pointe Scientific Inc., Canton, MI, USA)와 Automated blood chemistry analyzer (Photometer 5010, Robert Riele GmbH & Co KG, Berlin, Germany)를 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoleu m (MTT)은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, DMEM과 fetal bovine serum (FBS)는 BioWhittaker사 (Walkersville, MD, USA)와 Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하였으며, penicillin 및 streptomycin은 Gibco/BRL(Eggenstein, Germany)로부터 구입하였으며, silymarin은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- Rat 유래 hepatocyte cell line인 H4IIE cell은 American Type Culture Collection (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, DMEM에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Sanyo, Japan)에서 배양하였다.
- SCE의 수율은 7.68%였으며 in vitro 처치시에는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 녹여 사용하였고, in vivo 실험에서는 H2O에 녹여 사용하였다.
- 실험동물은 6주령 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(140-160 g)를 효창사이언스 (대구, 한국)로부터 공급받아 1주일 동안 동물실험실환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 20-23℃, 습도 60%, 12시간 light/dark cycle을 유지하고, 사료(Nestle Purina Petcare Korea, Seoul, Korea)와 음료는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±S.D.로 나타내었으며, 처치군 간의 유의성은 one way analysis of varience (ANOVA)로 검정한 후 Newman-Kleuls test로 검정하였다.
이론/모형
- H4IIE cells pre-treated with SCE for 12 and further incubated with SCE+Cd (10 μM) for the next 12 hr (A) 24 hr (B). Cell viability was assessed by MTT assay. Data represent the mean±SD of eight separate experiments.
- 카드뮴으로 유발되는 세포독성에 대한 SCE의 보호효과를 MTT assay로 관찰하였다. 12시간 동안 serum을 제거한 배지에서 H4IIE cell을 배양한 후, SCE를 12시간 동안 농도별로 처치하고, 이후 카드뮴을 10 μM로 12, 24시간 동안 처치하였다.
성능/효과
- 12시간에서 Normal군은 100.00±16.71%였으며, Cd군은 39.99±8.36%로 유의한 세포독성이 유도되었다.
- 24시간에서 Cd군은 4.62±0.07%로 유의하게 세포독성이 유도되었으며, SCE를 10, 30, 100, 300 μ g/ml을 처치한 군에서는 각각 5.28±0.03, 6.49±0.15, 9.25±0.65, 15.11±2.43 (%)를 나타내어 실험에 사용된 SCE 전 농도에서 유의하게 세포독성이 억제되었다(Fig. 1A, 1B).
- 간 변성율은 Normal군과 Control군에서 각각 2.69±1.03, 2.77±1.23%를 나타내었으며, 카드뮴에 의해서는 간 변성율이 65.53±9.54%로 유의하게 증가되었다.
- 그 결과 in vitro에서는 계혈등물추출물 30, 100, 300 μg/ml의 농도에서 유의한 세포독성 억제를 나타내었으며, in vivo에서는 계혈등 30 mg/kg에서 silymarin 투여군과 유사한 효과를 나타내었고, 계혈 등 50 mg/kg에서 silymarin 투여군보다 더 우수한 간보호효과를 나타내었다.
- 그러나 이러한 ALT의 증가는 Sm군에서 345.59±217.24 U/L로 유의하게 감소하였으며, SCE 30, 50 군에서는 각각 315.27±166.25, 182.48±25.85 U/L로 유의하게 감소하여 양성대조군인 SM군과 유사한 감소를 나타내었다(Fig. 2).
- 그러나 이러한 변성 간세포 수의 증가는 Sm군에서 169.00±49.61개 (-76.26%)로 유의하게 감소되었고, SCE 30, 50 mg/kg는 142.00±55.64, 77.40±31.10개 (-80.05 및 -89.13%)로 유의하게 감소되었으며, 이는 양성대조군인 Sm군보다 더 적은 변성 간세포의 수를 나타낸 것이다.
- 그러나 이러한 세포독성은 SCE 30, 100, 300 μg/ml을 처치한 군에서는 각각 57.39±6.82, 62.68±7.21, 92.40±5.98 (%)로 유의하게 억제되었다.
- 그리고 SCE 30, 50 mg/kg군에서는 각각 14.62±3.74% (77.69% 감소) 및 8.37±2.10% (87.22% 감소)로 유의하게 감소되었으며, 이는 양성대조군인 Sm군보다 더 낮은 변성율을 나타낸 것이다.
- 그리고 SCE 30군, SCE 50군에서는 각각 142.00±55.64개 (80.05% 감소) 및 77.40±31.10 (89.13% 감소)로 유의하게 감소되어, 양성대조군인 Sm군보다 더 낮은 변성 간세포의 수를 나타내었다.
- 74 μg/L를 나타낸 것으로 보고되었다. 또한 이러한 섭취량과 혈중 농도를 동아시아 국가들과 비교해볼 때, 카드뮴 섭취량의 경우는 일본에 비해 2/3수준을 나타내었고, 중국이나 타이완에 비해서는 약 2배 정도 높게 섭취되고 있는 것으로 나타났다. 혈중 카드뮴농도 역시 카드뮴섭취량에 대응하는 농도를 나타내어, 비교된 동아시아 국가 7개국 중 일본에 이어서 2위를 나타내었다.
- 변성 간세포의 수는 Normal군과 Control군에서 잘 나타나지 않았으며, 카드뮴에 의해서 변성된 간세포의 수가 711.80±116.11개로 유의하게 증가되었다.
- 변성 간세포의 수에 있어서도, Normal군이나 Control군에서는 잘 나타나지 않았으나 카드뮴에 의해서는 711.80±116.11개로 유의하게 증가되었고, Sm군에서는 169.00±49.61개로 76.26% 감소하였다.
- 본 연구에서 Normal군과 Control군은 각각 50.18±12.53, 42.42±4.35 (U/L)를 나타내었으며, Cd군은 1597.77±374.48 U/L을 나타내어 유의한 간독성이 유발되었다.
- 본 연구에서 Normal군과 Control군은 각각 58.37±14.44, 54.49±15.56 (U/L)를 나타내었으며, Cd군은 3559.17±617.62 U/L을 나타내어 유의한 간독성이 유발되었다.
- 본 연구에서 Normal군과 Control군은 각각 96.50±31.37, 75.75±17.21 (U/L)를 나타내었으며, Cd군은 2744.33±591.79 U/L을 나타내어 유의한 간독성이 유발되었다.
- 본 연구에서 카드뮴으로 유도되는 간독성은 이전의 연구들과28,39,61,62) 같이 유의한 ALT, AST, LDH의 상승을 동반한 간손상을 유발하였으며, 카드뮴에 의하여 유의성 있게 증가된 ALT는 SCE의 전처치로 유의성 있게 감소되었다. ALT는 aminotransferase 중의 하나로, 혈청 ALT는 여러 장기들 중에서도 간세포변성과 괴사를 가장 민감하게 반영하기 때문에 간담도 질환의 특징적 지표로 다용되고 있다28,63).
- . 본 연구에서도 카드뮴은 LDH의 수준을 유의하게 증가시켰으며, 이러한 증가는 SCE에 의하여 유의하게 감소하였다. 특히 SCE는 조추출물 (crude extract)로서, 30 또는 50 mg/kg를 투여하였음에도 양성대조군으로 사용된 silymarin 100 mg/kg 처치군인 Sm군과 유사한 정도의 감소를 나타내어, 뛰어난 간보호효과를 나타내었다.
- 본 연구의 결과, in vitro에서 카드뮴을 12시간 처치한 경우 Normal군은 100.00± 16.71%이었으나 Cd군은 39.99±8.36%로 유의한 세포독성이 유도되었고, SCE는 30, 100, 300 μg/ml에서 유의하게 세포독성을 억제하였다.
- 조직학적 변화로는 Cd군과 control군에서는 괴사 조직 주변의 충혈과 출혈을 동반한 소엽중심성 괴사가 관찰되지만 SCE 30, 50 군에서는 괴사억제효과가 관찰되었다(Fig. 5A, 5B, Fig. 6).
후속연구
- 이러한 in vitro 및 in vivo의 결과는 계혈등이 카드뮴 독성에 대한 간세포 보호효과가 있음을 객관적으로 제시하는 결과이다. 따라서 향후 계혈등을 활용한 카드뮴 독성 완화에 대한 방제의 개발 및 임상 연구, 치료 기전의 연구, 효과적인 치료물질의 개발 등이 함께 수행되어야 할 것으로 생각된다.
- 그 결과 in vitro에서는 계혈등물추출물 30, 100, 300 μg/ml의 농도에서 유의한 세포독성 억제를 나타내었으며, in vivo에서는 계혈등 30 mg/kg에서 silymarin 투여군과 유사한 효과를 나타내었고, 계혈 등 50 mg/kg에서 silymarin 투여군보다 더 우수한 간보호효과를 나타내었다. 이러한 결과는 계혈등이 카드뮴 독성에 대한 간세포 보호효과가 있음을 말해준다고 볼 수 있으며, 향후 계혈등의 간세포 보호기전에 대한 연구와 유효 치료 물질 개발에 대한 연구가 있어야 할 것으로 생각된다.
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