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문제 정의
- 따라서 본 연구에는 제주산 토종 호박, 단호박 및 애호박을 건조분말로 한 후, 이들을 여러 종류의 탄수화물 분해효소로 분해․추출하여 이들 추출물에 의한 항산화 활성을 측정함으로써 호박의 기능성을 검토하였다.
제안 방법
- 이들 분해물은 농도를 2 mg/mL로 맞추어 효소 분해물 시료로 사용하였다. 각 효소 가수분해물의 수율은 사용된 효소의 종류에 따라 호박 분말양에 대한 가수분해물의 최종 획득된 양을 %로 계산하였다.
- 본 연구는 늙은호박, 단호박 및 애호박을 다양한 탄수화물 분해효소로 소화하여 조제한 효소가수분해물의 총 폴리페놀 함량과 항산화 활성을 측정하였다. 조회분, 조단백질 및 조섬유는 애호박이 높았으며, 탄수화물은 단호박이 높았고,조지방은 서로 비슷하였다.
- 즉 96 microwell plate에 시료구와 공시험구, 대조구를 구분하여 각 효소별 시료 80 μL에 인산완충용액(0.1 M, pH 5.0)과 10 mM의 H2O2 20μL를 혼합하여 37oC의 incubator에서 5분간 반응시켰으며, 시료구에는 1.25 mM ABTS 30 μL, 공시험구에는 증류수 30 μL를 첨가한 후 peroxidase(1 μU/mL) 30 μL를 시료구와 공시험구에 첨가하여 37oC의 incubator에서 10분 반응시킨 다음 ELISA reader(Sunrise, Tecan Co. Ltd., Grödig, Austria)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denissml 방법(23)을 변형하여 측정하였다. 즉 시험관에 각 효소별 가수분해물 1 mL, 95% ethanol 1 mL, 증류수 5 mL, 50% Foiln-Ciocalteu re-agent 0.5 mL를 가하여 실온에 5분간 방치하여 반응시킨 후, 5% Na2CO3 1 mL를 가하고 어두운 곳(실온)에서 1시간 반응시킨 다음 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 (+)catechin 표준액에 의하여 작성한 검량선에 따라 계산하였다.
- 5 mL를 가하여 실온에 5분간 방치하여 반응시킨 후, 5% Na2CO3 1 mL를 가하고 어두운 곳(실온)에서 1시간 반응시킨 다음 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 (+)catechin 표준액에 의하여 작성한 검량선에 따라 계산하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denissml 방법(23)을 변형하여 측정하였다. 즉 시험관에 각 효소별 가수분해물 1 mL, 95% ethanol 1 mL, 증류수 5 mL, 50% Foiln-Ciocalteu re-agent 0.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서, 그리고 N-1-naphthylethylene diamine dihydrochloride는 Hayashi Pure Chemical Industries Ltd.(Osaka, Japan), ethylinediamine tetra-acetic acid(EDTA), peroxidase, 2,3-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonic acid(ABTS), deoxyribose는 Fluka사(Buchs, Switzerland)에서 구입한 제품을 사용하였다.
- Nitric oxide radical(NO)의 소거활성은 Griess Illosvoy 반응(28)에 의하여 측정하였다. Griess Illosvoy 용액은 5% 1-naphthylamine 대신에 naphthylethylenediamine dihydrochoride(0.1% w/v)를 사용하였다. 즉 시료 0.
- 실험에 사용된 늙은호박(ripened pumpkin, C. moschata)은 수확 후 1～2개월 보관한 것을, 애호박(green pumpkin, C. moschata)은 수확 후 5일 경과한 것을 그리고 단호박(sweet pumpkin, C. maxima)은 수확 후 10～15일 보관한 것을 제주특별자치도 제주시 한림읍에 소재한 농가에서 구입하여 사용하였다. 구입한 호박은 4등분으로 분리하여 씨를 제거하고, 이를 껍질이 있는 채로 동결건조한 후 분쇄기를 사용하여 200 mesh 정도로 분쇄하여 실험재료로 하였다.
- 호박의 일반성분을 분석한 결과 주성분이 탄수화물과 식이섬유이므로 전분분해효소인 AMG(exo 1,4-α-d-amyloglucosidase), 섬유소 분해효소인 Celluclast, amylose와 amylopectin 분해효소인 Termamyl과 Viscozyme 및 점질 물질(gums)을 분해하는 Ultraflo를 사용하였다(NovozymeNordisk, Bagsvaed, Denmark).
데이터처리
- 본 연구의 실험 결과는 3회 반복 측정한 후 평균과 표준편차를 나타내었으며, SPSS 11.1을 이용하여 실험군간의 유의차를 검증한 후 p<0.05 수준에서 상호 비교하였다.
이론/모형
- Hydrogen peroxide 소거활성은 Muller의 방법(26)인 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonicacid(ABTS)-peroxidase system으로 측정하였다. 즉 96 microwell plate에 시료구와 공시험구, 대조구를 구분하여 각 효소별 시료 80 μL에 인산완충용액(0.
- Hydroxyl radical의 소거활성은 Chung과 Kim(27)의 방법에 따라 ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt(EDTA)가 포함된 Fenton 반응계(Fe2+＋H2O2→․H＋OH-)에서 분석하였다.
- Nitric oxide radical(NO)의 소거활성은 Griess Illosvoy 반응(28)에 의하여 측정하였다. Griess Illosvoy 용액은 5% 1-naphthylamine 대신에 naphthylethylenediamine dihydrochoride(0.
- Superoxide anion 소거활성은 Nagai 등(25)의 방법에 따라 측정하였다. 즉 시험관에 0.
- 일반성분은 AOAC 방법(21)에 따라 수분은 105oC 상압가열건조법, 조단백질은 Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet 추출법으로 분석하였고, 회분은 550oC에서 직접회화법으로 평량하였다. 탄수화물 함량은 총 일반성분 함량 100에서 측정된 수분, 조단백질, 조지방 및 회분 함량을 뺀 수치로 나타내었다.
- 호박 분해물의 DPPH 유리기 소거 활성은 BrandWilliams 등(24)에 의해 수정된 방법으로 측정하였다. 즉 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)를 이용하여 시료구에는 시료 2 mL와 DPPH 용액(3×10-5 M in DMSO) 2 mL, 공시험구는 시료 2 mL와 MeOH 2 mL, 대조구는 DMSO 2 mL와 DPPH 용액 2 mL를 넣어 완전 혼합하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 UV-VIS spectrophotometer(Opron 3000 Hanson Tech.
성능/효과
- Nitric oxide 소거활성은 단호박 및 애호박의 Viscozyme 분해물에서 매우 효과적이었으며, 다른 효소가수분해물의 경우에도 BHT보다는 낮았으나 α-tocopherol보다 높은 활성을 나타내었다.
- 그러나 시험된 모든 품종의 호박분해물들은 BHT와 αtocopherol에 비하여 낮은 활성을 보였다.
- 늙은호박, 단호박 및 애호박 분말의 효소분해물에 의한 nitric oxide 소거 활성은 40% 전후로써 모든 효소 분해물들이 BHT보다는 낮고 α-tocopherol보다는 높은 활성을 보였다.
- 그러나 시험된 모든 품종의 호박분해물들은 BHT와 αtocopherol에 비하여 낮은 활성을 보였다. 늙은호박과 단호박을 비교해 보면 Ultraflo, Termamyl 및 AMG 처리에서는 단호박 분해물이 비교적 높은 DPPH 유리기 소거활성을 보였으나, Celluclast와 Viscozyme 처리에서는 늙은호박 분해물이 좀 더 높은 활성을 보였다. 효소별로 보면 늙은호박은 22.
- 단호박은 46.1±1.9～71.7±2.8% 범위로써 Ultraflo 분해물을 제외한 모든 효소 분해물에서 63% 이상의 높은 활성을 보였으며, 특히 Celluclast, Termamyl 및 Viscozyme 분해물은 70% 이상의 매우 높은 활성을 보였다.
- 품종별로 보면 Ultraflo 처리군을 제외하고는 전반적으로 애호박의 효소 분해물이 다른 호박 품종들에 비하여 약간 높은 활성을 보이고 있으나 큰 차이는 없었으며, 모든 효소 분해물들이 BHT나 α-tocopherol에 비하여 낮은 활성을 보였다. 또한 애호박의 Celluclast 분해물을 제외하고는 모든 호박의 효소 분해물들이 50% 미만의 활성을 보였다. 효소별로 보면 늙은호박은 34.
- 늙은호박, 단호박 및 애호박 분말의 효소분해물에 의한 nitric oxide 소거 활성은 40% 전후로써 모든 효소 분해물들이 BHT보다는 낮고 α-tocopherol보다는 높은 활성을 보였다. 또한, 다른 효소의 처리군에서는 호박의 품종에 따른 큰 차이를 보이지 않았으나, 특이하게 단호박과 애호박의 Viscozyme 분해물은 80% 전후의 매우 높은 nitric oxide 소거활성을 나타내었다. 호박 품종별로 보면 늙은호박은 28.
- 한편,Visozyme 처리 가수분해물을 제외한 늙은호박과 단호박의 대부분 가수분해물은 애호박보다 더 높은 superoxide anion 소거활성을 나타내었다. 애호박 가수분해물(Ultraflo 예외) 의 hydrogen peroxide 소거활성은 다른 호박의 효소 분해물보다 약간 높았으나, hydroxyl radical 소거활성은 모든 호박품종에서 14% 미만으로 낮았다. Nitric oxide 소거활성은 단호박 및 애호박의 Viscozyme 분해물에서 매우 효과적이었으며, 다른 효소가수분해물의 경우에도 BHT보다는 낮았으나 α-tocopherol보다 높은 활성을 나타내었다.
- 애호박 분말의 모든 효소처리군의 총 폴리페놀 함량은 늙은호박과 단호박의 가수분해물에 비하여 좀 더 높았다. 애호박 분말의 AMG와 Termamyl 소화로 조제된 효소가수분해물의 DPPH 유리기 소거활성 또한 늙은호박 및 단호박에 비하여 매우 높게 나타났다. 한편,Visozyme 처리 가수분해물을 제외한 늙은호박과 단호박의 대부분 가수분해물은 애호박보다 더 높은 superoxide anion 소거활성을 나타내었다.
- 조회분, 조단백질 및 조섬유는 애호박이 높았으며, 탄수화물은 단호박이 높았고,조지방은 서로 비슷하였다. 애호박 분말의 모든 효소처리군의 총 폴리페놀 함량은 늙은호박과 단호박의 가수분해물에 비하여 좀 더 높았다. 애호박 분말의 AMG와 Termamyl 소화로 조제된 효소가수분해물의 DPPH 유리기 소거활성 또한 늙은호박 및 단호박에 비하여 매우 높게 나타났다.
- 애호박은 42.1±0.3～79.9±2.8% 범위로써 Viscozyme 분해물에서 가장 높은 소거활성을 보였으며, 나머지 효소 분해물들은 42.1～46.0% 범위의 활성을 보였다.
- 애호박은 43.5±1.1～53.4±0.8% 범위로써 Celluclast 분해물에서 가장 높은 활성을 보였다.
- 애호박은 45.1±2.8～74.6±4.7% 범위로써 AMG 분해물에서 가장 높은 활성을 보였다.
- 8% 범위로써 Viscozyme 분해물에서 가장 높은 소거활성을 보였다. 이상의 결과로 볼 때 늙은호박 및 단호박 분말의 모든 효소 분해물과 애호박의 Viscozyme분해물은 superoxise anion을 활성적으로 소거하는 항산화제로서의 기능성이 매우 높다는 것을 알 수 있었다. 한편,82개의 재료에 대하여 extraction buffer를 사용하여 superoxide anion radical(˙O2)의 소거활성을 측정한 결과 오가피 13.
- 8% 범위로써 Celluclast 분해물에서 가장 높은 활성을 보였다. 이상의 결과로 볼 때 이들 호박의 효소 분해물들은 어느 정도 hydrogen peroxide 소거활성이 있음을 알 수 있었다.
- 7% 범위로써 AMG 분해물에서 가장 높은 활성을 보였다. 이상의 결과로 볼 때 호박 분말의 효소 분해물은 산화 유리기의 활성산소의 소거(10,30)에서 어느 정도 유용성을 인정할 수 있었으며, 특히 애호박의 효소 분해물은 늙은호박과 단호박에 비하여 모든 효소 분해물에서 매우 효과적인 DPPH 유리기 소거활성제임을 알 수 있었다.
- 효소별로 보면 늙은호박은 Viscozyme, Celluclast, Ultraflo, AMG, Termamyl의 순서로, 단호박은 Celluclast, Viscozyme, AMG, Ultraflo, Termamyl의 순서로, 그리고 애호박은 AMG, Viscozyme, Celluclast, Termamyl, Ultraflo의 순서로 높았다. 이상의 결과로부터 애호박에는 늙은호박과 단호박에 비하여 항산화 작용을 하는 폴리페놀 화합물이 좀 더 많이 함유되어 있었으며, 늙은호박과 단호박 간의 함량 차이는 거의 없었다. 한편, 늙은호박의 부위별 성분을 비교한 연구(29)에 의하면 총 폴리페놀 함량은 내부섬유상 부위에 379.
- 3 범위로써 전반적으로 활성이 매우 낮은 편이었다. 이상의 결과로부터 이들 호박의 효소 분해물들은 hydroxyl radical 소거활성을 크게 기대할 수 없는 것으로 판단된다.
- 호박 종류별 일반성분 함량은 Table 2에 나타내었다. 조회분, 조단백질 및 조섬유는 애호박, 늙은호박, 단호박 순서로 높았으며, 탄수화물은 단호박, 늙은호박, 애호박 순서로 높았고, 조지방은 호박 종류들 간에 거의 함량 차이를 보이지 않았다.
- 본 연구는 늙은호박, 단호박 및 애호박을 다양한 탄수화물 분해효소로 소화하여 조제한 효소가수분해물의 총 폴리페놀 함량과 항산화 활성을 측정하였다. 조회분, 조단백질 및 조섬유는 애호박이 높았으며, 탄수화물은 단호박이 높았고,조지방은 서로 비슷하였다. 애호박 분말의 모든 효소처리군의 총 폴리페놀 함량은 늙은호박과 단호박의 가수분해물에 비하여 좀 더 높았다.
- 총 폴리페놀 함량은 애호박의 모든 효소 분해물에서 629.4±45.0 mg/100 g 이상의 높은 함량을 나타내었으나, 늙은호박과 단호박은 애호박에 비하여 함량이 낮아 446.9±32.0～520.7±37.3 mg/100 g의 범위를 보였다.
- C에서 직접회화법으로 평량하였다. 탄수화물 함량은 총 일반성분 함량 100에서 측정된 수분, 조단백질, 조지방 및 회분 함량을 뺀 수치로 나타내었다.
- 7%의 소거효과를 나타낸다는 연구결과(32)와 비슷한 결과를 나타내었다. 특이하게 본 연구의 경우 늙은호박과 단호박 분말의 Viscozyme 분해물은 이들의 연구 결과보다 매우 높은 소거활성을 보였다. 이는 니트로사민 생성을 억제하는 것으로 알려지고 있는 폴리페놀 화합물, 플라보노이드 화합물, 페놀산 등의 페놀성 화합물이라는 것이라는 보고(33,34)와 폴리페놀, 페놀산, 플라보노이드 등 페놀성 화합물의 전자공여능이 크고(35), 특히 식물의 플라보노이드가 항산화성이 강한 편으로 free radical terminator 또는 금속의 chelator로 작용한다는 보고(36,37)들에 비추어 볼 때 호박에 다량 함유되어 있는 페놀성 화합물에 의한 효과라고 할 수 있다.
- 품종별로 보면 Ultraflo 처리군을 제외하고는 전반적으로 애호박의 효소 분해물이 다른 호박 품종들에 비하여 약간 높은 활성을 보이고 있으나 큰 차이는 없었으며, 모든 효소 분해물들이 BHT나 α-tocopherol에 비하여 낮은 활성을 보였다.
- 호박분말의 효소 분해물의 농도가 2 mg/mL가 함유되도록 반응용액을 제조하여 분해물에 의한 hydroxyl radical의 소거활성을 측정한 결과는 Table 8에 나타내었다. 품종별로 보면 실험에 사용된 모든 호박 품종에서 14% 미만의 낮은 활성을 보이는 것으로 보아 늙은 호박, 단호박 및 애호박의 효소 분해물들은 hydroxyl radical의 효과적인 소거활성능이 거의 없는 것으로 판단된다. 효소별로 보면 늙은호박은 -3.
- 이상의 결과로 볼 때 늙은호박 및 단호박 분말의 모든 효소 분해물과 애호박의 Viscozyme분해물은 superoxise anion을 활성적으로 소거하는 항산화제로서의 기능성이 매우 높다는 것을 알 수 있었다. 한편,82개의 재료에 대하여 extraction buffer를 사용하여 superoxide anion radical(˙O2)의 소거활성을 측정한 결과 오가피 13.5%, 결명자 17.1%, 복분자 13.2%, 감초 35.6%, 생강 9.0%,무 20.9%의 소거효과를 보였다는 보고(31)와 비교할 때, 본 연구에서 모든 호박의 효소 분해물들이 이들과 비슷하거나 아주 높은 소거활성을 보이는 것으로 보아 이들에 비하여 그 효과가 높다고 평가할 수 있다.
- 애호박 분말의 AMG와 Termamyl 소화로 조제된 효소가수분해물의 DPPH 유리기 소거활성 또한 늙은호박 및 단호박에 비하여 매우 높게 나타났다. 한편,Visozyme 처리 가수분해물을 제외한 늙은호박과 단호박의 대부분 가수분해물은 애호박보다 더 높은 superoxide anion 소거활성을 나타내었다. 애호박 가수분해물(Ultraflo 예외) 의 hydrogen peroxide 소거활성은 다른 호박의 효소 분해물보다 약간 높았으나, hydroxyl radical 소거활성은 모든 호박품종에서 14% 미만으로 낮았다.
- 호박 품종별로 보면 늙은호박은 28.0±1.0～42.0±3.2% 범위로써 Celluclast, Termamyl 및 AMG 분해물에서 40% 이상의 활성을 보였으나, Ultraflo와 Viscozyme 분해물에서는 33% 미만의 활성을 보였다.
- 호박의 효소 분해물들의 DPPH 유리기 소거활성은 호박 품종별 및 분해효소별로 많은 차이를 나타내었다. 호박 품종별로 비교해 보면 애호박이 다른 호박들에 비하여 활성이 높았으며, 특히 Ultraflo 분해물을 제외하고는 50% 이상의 활성을 나타내었다. 그러나 시험된 모든 품종의 호박분해물들은 BHT와 αtocopherol에 비하여 낮은 활성을 보였다.
- 호박품종별로 보면 전반적으로 늙은호박과 단호박의 효소분해물 및 애호박의 Viscozyme 분해물은 superoxide 유리기 소거활성이 매우 높아 BHT나 α-tocopherol과 비슷하거나 오히려 더 높게 나타났다.
- 효소 별로 보면 늙은호박은 56.9±2.4～70.4±2.8% 범위로써 모든 효소 분해물에서 50% 이상의 비교적 높은 활성을 보였으며, 특히 Celluclast 분해물은 70.4%로 매우 높은 소거활성을 보였다.
- 호박분말에 각 탄수화물 분해효소를 소화한 후 조제된 효소가수분해물의 수율은 Table 3과 같다. 효소가수분해물은 단호박의 Ultroflo 처리군을 제외한 모든 호박분말 가수분해물에서 50% 이상의 높은 수율을 나타내었다. Viscozyme과 Termamyl 분해물들이 비교적 높게 나타났다.
- 효소별로 보면 늙은호박은 -3.4±0.1～5.7±0.5% 범위로써 실험에 사용된 모든 효소 분해물에서 매우 낮은 활성을 보였다.
- 효소별로 보면 늙은호박은 22.4±1.4～44.1±2.8% 범위로써 Viscozyme 분해물에서 가장 높은 활성을 보였다.
- 3 mg/100 g의 범위를 보였다. 효소별로 보면 늙은호박은 Viscozyme, Celluclast, Ultraflo, AMG, Termamyl의 순서로, 단호박은 Celluclast, Viscozyme, AMG, Ultraflo, Termamyl의 순서로, 그리고 애호박은 AMG, Viscozyme, Celluclast, Termamyl, Ultraflo의 순서로 높았다. 이상의 결과로부터 애호박에는 늙은호박과 단호박에 비하여 항산화 작용을 하는 폴리페놀 화합물이 좀 더 많이 함유되어 있었으며, 늙은호박과 단호박 간의 함량 차이는 거의 없었다.
후속연구
- 이는 니트로사민 생성을 억제하는 것으로 알려지고 있는 폴리페놀 화합물, 플라보노이드 화합물, 페놀산 등의 페놀성 화합물이라는 것이라는 보고(33,34)와 폴리페놀, 페놀산, 플라보노이드 등 페놀성 화합물의 전자공여능이 크고(35), 특히 식물의 플라보노이드가 항산화성이 강한 편으로 free radical terminator 또는 금속의 chelator로 작용한다는 보고(36,37)들에 비추어 볼 때 호박에 다량 함유되어 있는 페놀성 화합물에 의한 효과라고 할 수 있다. 이상의 결과로부터 단호박과 애호박의 Viscozyme 분해물에 의하여 nitrosamine 생성의 전구물질인 nitric oxide를 매우 효과적으로 소거할 수 있을 뿐만 아니라, 나머지 효소 분해물들에 의해서도 어느 정도 소거활성이 인정되므로, 호박의 효소 분해물에 의하여 발암물질 생성을 사전에 차단하는데도 일조할 것으로 기대된다.
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