선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한 본 연구에서는 개발된 유도체의 상용화 가능성을 높이기 위하여 선정된 펩타이드의 서열 중에 천연유래물질이 도입되는 쪽인 N 말단의 Proline (Pro)를 다른 구조가 간단한 아미노산으로 바꾼 형태의 작은 library를 제조하였다. C-말단 부분도 amidation을 진행하지 않은 acid 형태로 유지한 library도 제조하였으며, 준비된 각각의 유도체에 대하여 멜라닌 형성 억제 효과를 확인하여 새로운 미백 소재로 가장 개발 가능성이 높은 유도체를 찾고자 하였다.
- 결론적으로 미백기능을 갖는 천연유래물질과 펩타이드의 유도체화를 통해서 기존에 가지고 있던 천연유래물질의 효능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. Coumaric acid와 caffeic acid에 다양한 기능을 갖는 펩타이드의 결합을 통해서 더욱 강력한 미백 소재를 개발할 수 있는 가능성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 미백 효능을 갖는 펩타이드에 일반적인 유기물질 대신에 천연유래물질 또는 이와 유사한 구조를 갖는 물질을 결합하여 미백 효능의 상승효과를 발휘하면서도 안정성이 높은 인체에 안전한 신규 미백 소재를 개발하고자 하였다. 이를 위해서 미백 효능을 갖는 천연유래물질의 탐색하였고, 이 중에서 선정된 caffeic acid와 coumaric acid에 미백 효능을 갖는 펩타이드를 도입한 유도체를 합성하고 합성된 유도체의 미백 활성 변화를 평가하고자 하였다.
- 특히 최근 들어서는 기존에 상용화가 가장 많이 되어 있는 티로시나제의 저해라는 하나의 미백 기작[8,9]에서 벗어나 새로운 기작을 연구하고 적용하려는 경향이 늘고있다. 이는 기존에 상용화된 미백 소재들의 한계가 점차 드러남에 따라 새로운 접근 방법으로 이를 극복하고자 함이다. 이러한 새로운 접근 방법으로 멜라닌 형성을 촉진시키는 자외선, 사이토카인 및 호르몬 등의 영향을 감소시키거나[10], 티로시나제의 전사를 조절하는 멜라닌 생성 전 단계[11-16], 생성된 멜라닌이 멜라노좀의 형태로 각질형성 세포에 전달되는 멜라닌의 전달 단계 등을 조절하는 소재[17,18] 등 여러 가지 다른 기작을 조절하는 소재들이 개발되고 있다.
- 본 연구에서는 미백 효능을 갖는 펩타이드에 일반적인 유기물질 대신에 천연유래물질 또는 이와 유사한 구조를 갖는 물질을 결합하여 미백 효능의 상승효과를 발휘하면서도 안정성이 높은 인체에 안전한 신규 미백 소재를 개발하고자 하였다. 이를 위해서 미백 효능을 갖는 천연유래물질의 탐색하였고, 이 중에서 선정된 caffeic acid와 coumaric acid에 미백 효능을 갖는 펩타이드를 도입한 유도체를 합성하고 합성된 유도체의 미백 활성 변화를 평가하고자 하였다. 또한 합성의 용이성과 합성 유도체의 원가를 고려하여 미백효능이 알려진 펩타이드 중에서 가장 짧은 서열을 가지고 있는 펩타이드 중에 하나인 melanostatin을 이용하였다.
제안 방법
- Coumaric acid와 caffeic acid에 펩타이드를 도입하여 32종의 천연유래 물질 펩타이드 유도체를 합성하였다(Table 2). 합성된 천연유래물질 펩타이드 유도체의 순도와 분자량은 HPLC (Shimadzu LC-10Avp system, Shimaju, Japan)와 MALDI-TOF-MS (Kratos Kompact matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry, Shimaju, Japan)를 이용하여 분석하였다(Figures 1, 2).
- HPLC에서 컬럼은 ODS column (4.6 × 250 mm; Shim-pack)을 사용하였으며, gradient 조건은 0.1 % Trifluoroacetic acid (TFA) H2O에서 0.1 % TFA Acetonitrile 농도를 30 min 동안 5 %에서 65 %로 늘리는 것으로 하였으며 유속은 1 mL/min 로 하였다.
- MALDI-TOF는 일반적인 펩타이드의 matrix인 α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (CHCA)를 이용하여 측정하였다.
- Mushroom tyrosinase 활성 억제 평가를 통해 tyrosinase 활성 억제를 갖는 천연물을 coumaric acid와 caffeic acid로 선정하고 여기에 펩타이드를 도입한 신규 물질의 melanin 생성 억제 효능을 측정하였다. 펩타이드를 도입한 신규 미백 물질이 기존의 coumaric acid, caffeic acid보다 멜라닌 생성 저해효과가 뛰어남을 확인할 수 있다(Tables 3, 4).
- Tyrosinase는 melanogenesis과정에서 주요한 역할을 하는 효소로 알려져 있으며, tyrosinase의 활성을 저해하는 것을 주요 기능으로 하는 미백 효능을 갖는 물질들이 많이 알려져 있으며, 실제 임상적으로도 많이 사용이 되고 있다. Tyrosinase의 활성 저해정도를 알아보기 위해서 mushroom tyrosinase를 이용하여 천연물의 tyrosinase활성 저해 정도를 비교 평가하였다. 상업화되어 있는 천연유래물질 또는 천연유래 물질과 유사한 구조를 갖는 물질에 대하여 mushroom tyrosinase 활성을 비교 평가한결과 coumaric acid, caffeic acid가 기존에 많이 활용되고 있는 kojic acid, arbutin보다 tyrosinase활성 저해 효과가 뛰어난 것으로 나타났으며, 50 %의 활성을 저해하는 IC50값이 0.
- 계대배양된 B16F1 melanoma cell을 6 well plate에 3 × 105 cell/well의 농도로 분주한 후 1일 뒤에 각 약물들을 일정농도로 처리하였다.
- 또한 본 연구에서는 개발된 유도체의 상용화 가능성을 높이기 위하여 선정된 펩타이드의 서열 중에 천연유래물질이 도입되는 쪽인 N 말단의 Proline (Pro)를 다른 구조가 간단한 아미노산으로 바꾼 형태의 작은 library를 제조하였다. C-말단 부분도 amidation을 진행하지 않은 acid 형태로 유지한 library도 제조하였으며, 준비된 각각의 유도체에 대하여 멜라닌 형성 억제 효과를 확인하여 새로운 미백 소재로 가장 개발 가능성이 높은 유도체를 찾고자 하였다.
- 멜라닌을 녹인 용액을 470 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 합성멜라닌을 사용하여 작성된 표준 직선을 이용하여 정량하였다. 멜라닌 녹인 용액의 단백질 농도 확인을 위하여 멜라닌 용액 3 uL과 advanced protein assay reagent를 300 uL을 반응하여 590 nm 1 min 이내에 흡광도를 측정하였다. 단백질 농도는 1 % Bovine serum albumin (BSA)을 이용하여 표준 곡선을 작성하여 정량하였다.
- 버섯 tyrosinase 활성저해효과는 Jang[24,25] 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 에탄올에 용해한 적정 농도의 시험물질을 96well plate의 각 well에 50 uL씩 넣고 0.
- 반응기의 용액을 모두 제거하고 레진을 NMP, MeOH, DCM으로 각각 3회 세척 한 뒤, 마지막에 NMP로 다시 세척하였다. 세척이 완료된 레진에 20 % piperidine/NMP를 가하고 앞서 설명한 방법과 동일한 반응을 진행하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 뒤에 이어서 다른 2종의 Fmoc 아미노산을 같은 방법으로 레진에 도입한다.
- 위와 같이 tripeptide가 도입된 레진에 천연유래(유사)물질(치환기의 2당량), BOP reagent (아미노산 시약과 동량), HOBt (아미노산 시약과 동량), DIEA (아미노산 시약의 1.1 당량)을 가하고 NMP를 용매로 가한 뒤, 24 h 동안 반응한다. 반응의 종결은 kaiser's ninhydrin test를 이용하여 확인하였다.
- 위의 반응기에 Fmoc으로 아민 말단이 보호된 아미노산(치환기의 2당량), BOP reagent (아미노산 시약과 동량), HOBt (아미노산 시약과 동량), DIEA (아미노산 시약의 1.1 당량)을 가하고 NMP를 용매로 가한 뒤, 3시간 동안 반응한다. 반응의 종결은 kaiser's ninhydrin test를 이용하여 확인하였다.
- 위의 반응기에 Fmoc으로 아민 말단이 보호된 아미노산(치환기의 2당량)과, BOP reagent, HOBt, DIEA을 각각 아미노산의 1당량, 1당량, 1.1당량을 가하고 NMP를 용매로 가한 뒤, 3 h 동안 반응한다. 반응의 종결은 kaiser's ninhydrin test를 이용하여 확인하였다[26].
- 분리된 펩타이드 유도체는 동일 조건에서 cold ether를 20 mL 가하여 원심분리하는 과정을 3회 반복하여 불순물을 제거하였다. 최종 생성물을 원심분리가 끝난 펩타이드 유도체를 24 h 동안 동결건조(FDU-2200, EYELA, Japan)하여 최종생성물을 얻었다.
- 치환율이 0.5 mmol/g인 Rink amid 레진을 반응기에 가하고 NMP 용매에서 2 h 동안 팽윤시켜준 뒤, Fmoc으로 아민 말단이 보호된 아미노산(치환기의 2당량), DIEA (아미노산 시약의 1.1 당량)을 가하고 NMP를 용매로 가한 뒤, 2 h 동안 반응한다. 반응의 종결은 kaiser's ninhydrin test를 이용하여 확인하였다.
- Coumaric acid와 caffeic acid에 펩타이드를 도입하여 32종의 천연유래 물질 펩타이드 유도체를 합성하였다(Table 2). 합성된 천연유래물질 펩타이드 유도체의 순도와 분자량은 HPLC (Shimadzu LC-10Avp system, Shimaju, Japan)와 MALDI-TOF-MS (Kratos Kompact matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry, Shimaju, Japan)를 이용하여 분석하였다(Figures 1, 2). HPLC에서 컬럼은 ODS column (4.
대상 데이터
- Louis, USA)사의 제품을 구입하여 사용하였고, 배지로 사용한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS)은 Gibco BRL (Grand Island, USA)를 사용하였다. B16F1 melanoma cell은 한국 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. Fmoc 아미노산은 BeadTech (Seoul, Korea)사의 제품을 구입하여 사용하였으며, benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)- phosphonium hexafluorophosphate (BOP reagent), Hydroxybenzotriazole (HOBt), diisopropylethylamine (DIEA)는 TCI (Tokyo, Japan)사의 제품을 사용하였고, Rink amide resin, 2-Chlorotrityl (CTC) resin은 GLS (shanghai, China)사의 제품을 사용하였다.
- B16F1 melanoma cell은 한국 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. Fmoc 아미노산은 BeadTech (Seoul, Korea)사의 제품을 구입하여 사용하였으며, benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)- phosphonium hexafluorophosphate (BOP reagent), Hydroxybenzotriazole (HOBt), diisopropylethylamine (DIEA)는 TCI (Tokyo, Japan)사의 제품을 사용하였고, Rink amide resin, 2-Chlorotrityl (CTC) resin은 GLS (shanghai, China)사의 제품을 사용하였다. 합성에 사용된 천연유래물질인 caffeic acid, coumaric acid는 TCI (Tokyo, Japan)사의 제품을 사용하였고, 천연유사물질인 4-hydroxyphenylacetic acid, 3-(4-hydroxyphenyl) propionic acid는 Acros (New Jersey, USA)사의 제품을사용하였으며, melanostatin은 ANYGEN사(Kwangju, Korea)의 제품을 사용하였다.
- 이를 위해서 미백 효능을 갖는 천연유래물질의 탐색하였고, 이 중에서 선정된 caffeic acid와 coumaric acid에 미백 효능을 갖는 펩타이드를 도입한 유도체를 합성하고 합성된 유도체의 미백 활성 변화를 평가하고자 하였다. 또한 합성의 용이성과 합성 유도체의 원가를 고려하여 미백효능이 알려진 펩타이드 중에서 가장 짧은 서열을 가지고 있는 펩타이드 중에 하나인 melanostatin을 이용하였다. Melanostatin은 α-MSH의 발현 자체를 억제하여 미백효능을 발휘하는 펩타이드이다[3-5].
- 시험에 사용된 시약은 Sigma Chemical Co (St. Louis, USA)사의 제품을 구입하여 사용하였고, 배지로 사용한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS)은 Gibco BRL (Grand Island, USA)를 사용하였다.
- 실험에 사용된 B16F1 melanoma cell은 10 % FBS와 1 % streptomycin/penicillin이 첨가된 DMEM배지를 사용하였으며, 37 ℃에서 5 % CO2 조건에서 배양하여 사용하였다. 계대배양된 B16F1 melanoma cell을 6 well plate에 3 × 105 cell/well의 농도로 분주한 후 1일 뒤에 각 약물들을 일정농도로 처리하였다.
- Fmoc 아미노산은 BeadTech (Seoul, Korea)사의 제품을 구입하여 사용하였으며, benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)- phosphonium hexafluorophosphate (BOP reagent), Hydroxybenzotriazole (HOBt), diisopropylethylamine (DIEA)는 TCI (Tokyo, Japan)사의 제품을 사용하였고, Rink amide resin, 2-Chlorotrityl (CTC) resin은 GLS (shanghai, China)사의 제품을 사용하였다. 합성에 사용된 천연유래물질인 caffeic acid, coumaric acid는 TCI (Tokyo, Japan)사의 제품을 사용하였고, 천연유사물질인 4-hydroxyphenylacetic acid, 3-(4-hydroxyphenyl) propionic acid는 Acros (New Jersey, USA)사의 제품을사용하였으며, melanostatin은 ANYGEN사(Kwangju, Korea)의 제품을 사용하였다.
이론/모형
- plate를 37 ℃에 10 min 동안 반응시킨 뒤 ELISA microplate reader로 475 nm에서 흡광도를 측정 하였다. Tyrosinase 활성 억제율(%)을 하기식을 이용하여 구하였다.
- 반응의 종결은 kaiser's ninhydrin test를 이용하여 확인하였다.
- 반응의 종결은 kaiser's ninhydrin test를 이용하여 확인하였다[26].
- 상기와 같이 Rink amide 레진 위에서 제조된 최종생성물인 펩타이드 유도체를 reagent K를 이용하여 알려진 방법으로 레진에서 분리하였다[27]. 분리된 펩타이드 유도체는 cold ether를 이용하여 침전시킨 후, 0 ℃에서 원심분리하여 용액과 분리하였다.
성능/효과
- Coumaric acid와 caffeic acid에 멜라닌 생성을 유도하는 호르몬으로 알려진 α-MSH의 방출을 저해하며, 직접적으로 tyrosinase의 활성을 저해하는 효과를 가지는 펩타이드인 melanostatin (PLG-NH2)을 도입한 천연유래물질 펩타이드 유도체는 천연유래물질이나 펩타이드 단독 물질보다 멜라닌 생성 억제 능력이 증가하는 것을 확인하였다.
- 또한 천연유래물질 단독의 경우 tyrosinase의 효능을 억제하는 한가지의 기작을 가지지만, 펩타이드를 도입함에 따라 α-MSH의 발현을 저해하는 기능이 추가되었기 때문에 멜라닌 생성 억제 능력이 증가한 것으로 보인다. Tables 3, 4의 결과를 보면 기본적으로 본래의 melnostatin 서열인 PLG-NH2의 N말단에 caffeic acid나 coumaric acid를 도입했던 유도체의 경우 멜라닌 생성 저해 효능이 각각 46.4 %와 47.1 %로 기존의 천연유래 물질에 비해 그 효능이 향상되었음을 알 수 있다. 여기에 미백 원료로의 상용화의 가능성을 높이고자 amidation된 말단을 그 전의 acid 상태로 유지한 구조 역시 그 저해 효능이 각각 41.
- 결론적으로 미백기능을 갖는 천연유래물질과 펩타이드의 유도체화를 통해서 기존에 가지고 있던 천연유래물질의 효능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. Coumaric acid와 caffeic acid에 다양한 기능을 갖는 펩타이드의 결합을 통해서 더욱 강력한 미백 소재를 개발할 수 있는 가능성을 확인하였다.
- 본 연구를 통하여 천연물에 기능성을 갖는 펩타이드의 도입을 통하여 한 물질이 다양한 기능을 가질 수 있으며, 그 효과가 증가할 수 있다는 가능성을 확인하였다. 추가 적으로 각질형성세포와 멜라노 사이트의 co-culture를 통하여 자외선 등에 의해서 발현이 유발되는 α-MSH의 생성 변화를 확인하여 본 시험물질의 효능 기작을 확인해야 할 여지가 남아있다.
- Tyrosinase의 활성 저해정도를 알아보기 위해서 mushroom tyrosinase를 이용하여 천연물의 tyrosinase활성 저해 정도를 비교 평가하였다. 상업화되어 있는 천연유래물질 또는 천연유래 물질과 유사한 구조를 갖는 물질에 대하여 mushroom tyrosinase 활성을 비교 평가한결과 coumaric acid, caffeic acid가 기존에 많이 활용되고 있는 kojic acid, arbutin보다 tyrosinase활성 저해 효과가 뛰어난 것으로 나타났으며, 50 %의 활성을 저해하는 IC50값이 0.005와 0.037 mM을 나타내었다. 후보 물질들의 tyrosinase 활성 저해 효과를 Table 1에 정리하였다.
- 1 %로 기존의 천연유래 물질에 비해 그 효능이 향상되었음을 알 수 있다. 여기에 미백 원료로의 상용화의 가능성을 높이고자 amidation된 말단을 그 전의 acid 상태로 유지한 구조 역시 그 저해 효능이 각각 41.4 %와 45.2 %로 향상되어 그 가능성을 볼 수 있었다. 천연유래물질의 도입 수율을 향상시키기 위하여 기존서열의 Pro를 다른 아미노산으로 전환한 구조들은 그 서열에 따라 멜라닌 저해 효능이 향상되기도 하였지만, 그렇지 못한 경우도 있었다.
- 천연유래물질의 도입 수율을 향상시키기 위하여 기존서열의 Pro를 다른 아미노산으로 전환한 구조들은 그 서열에 따라 멜라닌 저해 효능이 향상되기도 하였지만, 그렇지 못한 경우도 있었다. 이들 아미노산 중, 특히 Valine (Val)과 Isoleucine (Ile)이 기존의 Pro와 대등한 맬라닌 저해 효능의 향상효과를 보였다. 이는 이들 두 아미노산이 Pro와 비슷한 효과를 보일 수 있는 곁가지를 가지고 있기 때문으로 판단된다(Figure 3).
- 그리고 가장 중요한 것은 Pro 자체를 생략하고 caffeic acid나 coumaric acid를 도입한 경우이다. 이들은 각각 41.0 %와 45.3 %의 멜라닌 생성 억제 효과를 보여서 기존의 서열인 melanostatin을 도입한 유도체에 비해 손색이 없는 향상효과를 보였다. 아미노산 서열자체를 생략한 구조는 원료의 원가구조에 매우 좋은 영향을 줄 것이며, 그 결과로 미백원료로의 상용화 가능성이 더욱 향상 될 것으로 판단된다.
- Mushroom tyrosinase 활성 억제 평가를 통해 tyrosinase 활성 억제를 갖는 천연물을 coumaric acid와 caffeic acid로 선정하고 여기에 펩타이드를 도입한 신규 물질의 melanin 생성 억제 효능을 측정하였다. 펩타이드를 도입한 신규 미백 물질이 기존의 coumaric acid, caffeic acid보다 멜라닌 생성 저해효과가 뛰어남을 확인할 수 있다(Tables 3, 4).
후속연구
- 3 %의 멜라닌 생성 억제 효과를 보여서 기존의 서열인 melanostatin을 도입한 유도체에 비해 손색이 없는 향상효과를 보였다. 아미노산 서열자체를 생략한 구조는 원료의 원가구조에 매우 좋은 영향을 줄 것이며, 그 결과로 미백원료로의 상용화 가능성이 더욱 향상 될 것으로 판단된다.
- 추가 적으로 각질형성세포와 멜라노 사이트의 co-culture를 통하여 자외선 등에 의해서 발현이 유발되는 α-MSH의 생성 변화를 확인하여 본 시험물질의 효능 기작을 확인해야 할 여지가 남아있다.
- 추가적으로 α-MSH를 리간드로 하는 리셉터인 melanocortin receptor를 타겟으로 하는 펩타이드를 천연물에 도입하여, tyrosinase 활성을 억제하면서 α-MSH에 의한 melanogenesis도 저해하는 소재개발에 대한 연구도 진행될 예정이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.