해양 미세조류 Nannochloropsis oculata 추출.분획물의 ACE, α-glucosidase 및 암세포 저해 활성 ACE, α-Glucosidase and Cancer Cell Growth Inhibitory Activities of Extracts and Fractions from Marine Microalgae, Nannochloropsis oculata원문보기
Extracts of the marine microalgae Nannochloropsis oculata were obtained using 80% methanol (MeOH) and water. The 80% MeOH extract was further fractionated with n-hexane, chloroform, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH), and water to isolate the active fraction. Seven samples were prepared and t...
Extracts of the marine microalgae Nannochloropsis oculata were obtained using 80% methanol (MeOH) and water. The 80% MeOH extract was further fractionated with n-hexane, chloroform, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH), and water to isolate the active fraction. Seven samples were prepared and their angiotensin converting enzyme (ACE), $\alpha$-glucosidase, and cancer cell growth inhibitory activities in vitro were determined. The most profound ACE inhibitory activity was observed in the chloroform fraction, while the others had moderate effects. By contrast, greater $\alpha$-glucosidase inhibitory activity was found in the EtOAc fraction, n-hexane fraction, and water extract of N. oculata. The antiproliferative effects of the extracts and fractions against HL-60, U937, CT-26, and SK-Hep1 cancer cells were also determined. The n-BuOH fraction had the strongest antiproliferative effects on CT-26 cells in a time-dependant manner (P<0.05). These results suggest that the extracts and fractions from N. oculata could be used as a potential functional food or as pharmaceutical ingredients.
Extracts of the marine microalgae Nannochloropsis oculata were obtained using 80% methanol (MeOH) and water. The 80% MeOH extract was further fractionated with n-hexane, chloroform, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH), and water to isolate the active fraction. Seven samples were prepared and their angiotensin converting enzyme (ACE), $\alpha$-glucosidase, and cancer cell growth inhibitory activities in vitro were determined. The most profound ACE inhibitory activity was observed in the chloroform fraction, while the others had moderate effects. By contrast, greater $\alpha$-glucosidase inhibitory activity was found in the EtOAc fraction, n-hexane fraction, and water extract of N. oculata. The antiproliferative effects of the extracts and fractions against HL-60, U937, CT-26, and SK-Hep1 cancer cells were also determined. The n-BuOH fraction had the strongest antiproliferative effects on CT-26 cells in a time-dependant manner (P<0.05). These results suggest that the extracts and fractions from N. oculata could be used as a potential functional food or as pharmaceutical ingredients.
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문제 정의
본 연구에서는 이 연구에서는 새로운 기능성 식품 및 제약 소재 탐색을 목적으로 대표적인 해양미세조류인 Nannochloropsis oculata를 대량 배양하고 분획하여 이에 대한 다양한 생리활성을 평가하였다.
제안 방법
16시간이 지난 후 1% FBS가 포함되어 있는 배지로 교환하여 혈청에 들어있는 여러 성분들의 효과를 최소화화 한 후 미세조류 추출물 및 분획물 (500μg/mL)을 첨가하여 0, 1, 2, 3일 동안 배양한 후 MTT assay 방법 (Denizot and Lang, 1986)을 이용하여 살아있는 세포수를 측정하였다.
ACE 저해활성 측정 방법은 Cushman and Cheung (1971)의 방법을 약간 응용하여 기질인 hippuryl-L-histidyl-L-leucine (Hip-His-Leu)에 ACE가 작용하여 생성된 hippuric acid를 측정하는 방법을 사용하였다. 기질용액은 300 mM NaCl (pH 8.
기질 첨가후 변화된 흡광도의 차이로부터 효소 저해율을 산출하였다. 각 실험은 3회 반복 수행하였으며 각 실험치의 평균치를 구하였다.
그런 다음 기질 용액을 50 μL씩 첨가하고 5 분 동안 실온에서 반응시킨 후에 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기질 첨가후 변화된 흡광도의 차이로부터 효소 저해율을 산출하였다. 각 실험은 3회 반복 수행하였으며 각 실험치의 평균치를 구하였다.
미세조류 추출물 및 분획물이 HL60, U937, CT-26 및 SK-Hep1 세포의 증식에 미치는 영향을 측정하기 위해 세포를 10% FBS가 첨가된 배지로 희석하여 1×105 cells/well의 밀도로 96 well plate 에 분주하였다.
)에서 배양하였다. 세포가 배양 접시의 80% 정도 차면 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)으로 세포의 단층을 씻어낸 후 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA로 처리하여 계대 배양하였고 배지는 2일마다 교환하였다.
7 mL ethyl acetate (EtOAc)를 넣고 잘 섞어 주었으며, 앞의 반응물을 원심 분리 (800 × g, 15분)한 후 상층액 1 mL를 microtube에 옮기고약 40분정도 원심농축기 (VS802, Vision, Korea)에서 EtOAc를 모두 휘발시킨 다음 1 mL 증류수를 첨가하여 잘 섞었다. 이어서 ACE 저해활성은 혼합물을 228 nm에서 흡광도를 측정하고, 각 실험은 3회 반복 수행하였으며 각 실험치의 평균치로 나타내었다.
대상 데이터
Bovine serum albumin (BSA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), α-glucosidase, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, DMSO (dimethyl sulfoxide)과 본 연구에 사용한 일반적인 시약은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였다.
이 후 EtOAC 및 n-BuOH을 순차적으로 위와 동일한 방법으로 분리하여 각각 농축한 후 동결 건조하였다. 각 동결 건조하여 얻은 80% MeOH, n-hexane, chloroform, EtOAC, n-BuOH 및 수층 분획물과 물추출물을 실험에 사용하였다 (Fig. 1).
세포배양에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin 및 Trypsin-EDTA는 Gibco/BRL (Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
수집된 결과는 SPSS (SPSS Inc., Version 12.0) 프로그램을 이용하여 통계분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 P<0.05 수준에서 analysis of variance와 Duncan's multiple range test에 의해 분석하였다.
이론/모형
Alpha-glucosidase 저해 활성은 Watanabe et al. (1997)의 방법을 이용하였으며, 효소는 효모로부터 얻어진 α-glucosidase를 사용하였고, 기질은 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside를 사용하였다.
성능/효과
이 연구 결과에 의하면 N. oculata 에 함유된 α-glucosidase 효소활성 저해 성분들은 주로 EtOAc 분획물에 분포하는 것으로 예측되며 이 EtOAc 분획물로부터 효소활성 저해성분의 분리 정제가 필요할 것으로 사료된다.
이 연구에서 해양 미세조류 N. oculata 추출물 및 분획물이 4종류의 암세포 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포 배양액에 N. oculata 추출물 및 분획물을 첨가하여 세포를 24, 48 및 72시간 배양한 후 MTT assay를 실시하여 살아있는 세포수를 측정 해 본 결과, 혈액암 세포인 HL-60 (human promyelocytic leukemia cell), U937 (human leukemic monocyte lymphoma cell) 세포의 증식억제 효과는 없었고, 인간 간암세포 SK-Hep1 (human hepatocellular carcinoma cell)의 세포 증식 억제에는 영향을 주지 못하였지만, 대장암세포인 CT-26 (murine colon carcinoma cell)에서는 우수한 세포 성장 억제 효과를 보여 주었다. 특히, n-BuOH 분획물에서 암세포 성장률이 약 34%로 약 66%의 암세포 성장억제로 가장 높은 저해 활성을 보여주었다.
이 연구에서는 해양 미세조류 N. oculata 추출물 및 분획물을 대상으로 ACE 저해 활성을 검색하여 본 결과, chloroform 분획물이 유의적으로 가장 높았다. 즉 Hip-His-Leu를 기질로 사용하여 in vitro상에서 ACE 저해효과 검색실험 결과, N.
이와 관련하여 이 연구에서 해양 미세조류 N. oculata 추출물 및 분획물을 대상으로 α-glucosidase 저해 활성을 검색하여 본 결과, EtOAc 분획물이 유의적으로 가장 높은 α-glucosidase 저해효과를 나타내었다.
즉 Hip-His-Leu를 기질로 사용하여 in vitro상에서 ACE 저해효과 검색실험 결과, N. oculata chloroform 분획물 500 μg/mL의 측정농도에서 약 60% 효소 저해율을 보여주었다.
즉 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside를 기질로 사용하여 in vitro상에서 α-glucosidase 저해효과 검색실험 결과, N. oculata EtOAc 분획물 500 μg/mL의 측정농도에서 약 63% 효소 저해율을 보여주었다.
oculata 추출물 및 분획물을 첨가하여 세포를 24, 48 및 72시간 배양한 후 MTT assay를 실시하여 살아있는 세포수를 측정 해 본 결과, 혈액암 세포인 HL-60 (human promyelocytic leukemia cell), U937 (human leukemic monocyte lymphoma cell) 세포의 증식억제 효과는 없었고, 인간 간암세포 SK-Hep1 (human hepatocellular carcinoma cell)의 세포 증식 억제에는 영향을 주지 못하였지만, 대장암세포인 CT-26 (murine colon carcinoma cell)에서는 우수한 세포 성장 억제 효과를 보여 주었다. 특히, n-BuOH 분획물에서 암세포 성장률이 약 34%로 약 66%의 암세포 성장억제로 가장 높은 저해 활성을 보여주었다. 또한 물 추출물에서는 약 40%의 암세포 성장억제 활성을 나타내었다 (Fig.
한편 메탄올 추출물을 n-hexane, chloroform, EtOAc 및 n-BuOH로 단계적으로 용매분획하여 얻은 n-hexane 분획물 및 물 추물물은 500 μg/mL의 각각 55% 및 48% 의 효소활성 저해효과를 나타내었으며, 메탄올 추출물은 동일한 농도에서 40%, 그리고 n-BuOH 분획물 및 잔류 물층은 20% 이하의미미한 효소 저해율을 나타내었다 (Fig. 3).
한편 메탄올 추출물을 n-hexane, chloroform, ethyl acetate (EtOAc) 및 n-buthanol (n-BuOH)로 단계적으로 용매 분획하여 얻은 n-hexane 분획물은 500 μg/mL의 측정농도에서 약 40% 의 효소활성 저해효과를 나타내었으며, 메탄올 추출물은 동일한 농도에서 약 30%, 그리고 물 추출물은 25%의 효소활성 저해 효과를 보여주었으며, 그 밖의 EtOAC 분획물, n-BuOH 분획물 및 잔류 물 층은 20% 이하의 미미한 효소 저해율을 나타내었다 (Fig. 2).
후속연구
그렇기 때문에 해조류 분획물에 대한 ACE 저해 활성에 대한 더 많은 연구가 절실히 필요하다. N. oculata 에 함유된 ACE 저해 성분들은 주로 chloroform과 n-hexane 분획물에 분포하는 것으로 예측되며 이 두 분획물로부터 효소활성 저해성분의 분리 정제가 필요할 것으로 사료된다.
4). N. oculata 추출물 및 분획물을 이용하여 더 많은 암세포 성장 억제 활성에 대한 스크리닝이 요구되고, 이 연구를 통하여 n-BuOH 분획물에 대하여 대장암에 대한 좀 더 체계적인 항암 기작 연구가 필요할 것으로 사료되며 아울러 지속한 연구개발을 통해 N. oculata에서 생리활성 물질의 구조를 추적하면 항암효과를 지닌 기능성 식품의 산업화도 가능할 것으로 전망된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
혈관 수축 물질인 angiotensin Ⅱ는 어떤 역할을 하는가?
, 1978; Dzau, 2001). 이렇게 생성된 angiotensin Ⅱ는 동맥 혈관을 수축시키고 혈압을 상승시켜, 아드레날에서의 aldesterone의 분비를 촉진하여 신장의 sodium 및 수분의 재흡수를 증가시키는 역할을 한다. 또한 ACE는 혈관 확장, 장의 운동성 증대 등의 작용을 가진 bradykinin을 분해하여 불활성화시킴으로서 결과적으로 혈압을 상승시키는 역할을 한다 (Cushman and Cheung, 1971; Sealey and Larahg, 1990).
ACE 저해물질에는 무엇이 있는가?
또한 ACE는 혈관 확장, 장의 운동성 증대 등의 작용을 가진 bradykinin을 분해하여 불활성화시킴으로서 결과적으로 혈압을 상승시키는 역할을 한다 (Cushman and Cheung, 1971; Sealey and Larahg, 1990). 이와 같이 혈압을 강화하는 ACE의 저해제를 연구함으로써 고혈압이나 심장병 치료를 위해 ACE 저해물질인 alacepril, benazepril, captopril, cilazapril, enalapril, fosinopril, lisinopril, moexipril, perindopril, quinapril, ramipril, tandolapril 및 zofenopril 등을 포함하여 많은 연구가 이루어졌다 (Kato and Suzuko, 1971; Atkinson and Rovertson, 1979, Sawayama et al., 1990).
당뇨병에 대한 대안으로 사용되는 α-glucosidase 저해제는 어떤 효과를 가지는가?
, 2008; DeFronzo, 1992). 이 질병에 대한 대안으로 사용되는 α-glucosidase 저해제는 소장 점막의 brush border에 분포하고 있는 탄수화물 소화효소 즉 maltose, sucrose, glucoamylase 등 각종 α-glucosidase의 효소 활성을 저해함으로써 다당류가 단당류로 분해되는 과정을 억제하여, 식후 과도한 혈당상승을 지연시키는 효과를 나타내게 된다 (Del Prato et al., 2007; Van de Laar et al.
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