Lophatheri Herba is the aerial part of Lophatherum gracile Bronghiart(淡竹葉, Gramineae). 25~75 cm in length. Stem: cylindrical with nodes, empty inside, externally pale yellowish green. Leaf: dehiscent of lanceolate lamina, shrunken and rolled, 5~20 cm long, 10~35 mm wide; surface: pale green ~ yellow...
Lophatheri Herba is the aerial part of Lophatherum gracile Bronghiart(淡竹葉, Gramineae). 25~75 cm in length. Stem: cylindrical with nodes, empty inside, externally pale yellowish green. Leaf: dehiscent of lanceolate lamina, shrunken and rolled, 5~20 cm long, 10~35 mm wide; surface: pale green ~ yellowish green, parallel-formed with veins of square reticulate, more distinct of appearance on the lower surface. Banbusae Caulis In Taeniam is the stringy strip derived from the stem with the peeled-off epidermis of Phllostachys nigra Munro var. henosis Stapf, and Phllostachys bambusoides Siebold et Zuccarini(竹葉, Gramineae). Irregular in size and shape, thin plane ~ strip-shaped, sometimes powdery, sometimes 1~3 mm thick. Outer surface: pale green ~ yellowish green, sometimes grayish white L. gracile and P. nigra have different origins although they show similar morphologic features. We were able to distinguish between L. gracile and P. nigra which are almost indistinguishable through this study. AFLP(Amplifide Fragment Length Polymorphism) was more suitable for identifying differences between L. gracile and P. nigra in comparison with other genetic analysis using chemical analysis. Therefore. molecular biological methods are believed to be useful for discovering origins of herbal medicines.
Lophatheri Herba is the aerial part of Lophatherum gracile Bronghiart(淡竹葉, Gramineae). 25~75 cm in length. Stem: cylindrical with nodes, empty inside, externally pale yellowish green. Leaf: dehiscent of lanceolate lamina, shrunken and rolled, 5~20 cm long, 10~35 mm wide; surface: pale green ~ yellowish green, parallel-formed with veins of square reticulate, more distinct of appearance on the lower surface. Banbusae Caulis In Taeniam is the stringy strip derived from the stem with the peeled-off epidermis of Phllostachys nigra Munro var. henosis Stapf, and Phllostachys bambusoides Siebold et Zuccarini(竹葉, Gramineae). Irregular in size and shape, thin plane ~ strip-shaped, sometimes powdery, sometimes 1~3 mm thick. Outer surface: pale green ~ yellowish green, sometimes grayish white L. gracile and P. nigra have different origins although they show similar morphologic features. We were able to distinguish between L. gracile and P. nigra which are almost indistinguishable through this study. AFLP(Amplifide Fragment Length Polymorphism) was more suitable for identifying differences between L. gracile and P. nigra in comparison with other genetic analysis using chemical analysis. Therefore. molecular biological methods are believed to be useful for discovering origins of herbal medicines.
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문제 정의
p>두통, 감기로 인한 인후통 및 기침 등의 적응증에 사용되는 은교산 처방 중 담죽엽이 죽엽과 오용되어 사용될 수 있으나, TLC법 등의 과학적인 확인시험법등 감별법이 설정되지 않아 품질관리에 어려움이 있어 본 연구를 실시하였다.
따라서, 담죽엽과 죽엽은 동일한 벼과의 식물로서 외부 형태학적 특징은 유사하나 속이 다른 식물로서 유전자를 이용한 분자생물학적 기법을 응용하는 것이 두 식물을 구별하는데 보다 효과적이라 판단되어 본 연구를 수행하게 되었다. 분자생물학적 기법은 Genomic DNA를 분리하여 유전자 염기서열의 차이에 따라 식물의 종을 구별하는 방법으로 식물의 약용 부위와 생장 기간과는 상관없이 동일한 유전자와 염기서열을 가지는 특징이 있다.
본 연구는 이러한 한계점을 극복하기 위해 유전자분석법을 통한 담죽엽의 확인시험법을 연구하였으며, 개발된 시험법을 이용하여 기원이 정확한 약재가 유통될 수 있도록 품질관리에 이바지 하고자 한다. 또한 본 연구에서 개발된 시험법을 응용하여 감별이 어려운 다른 생약(한약)에 대해 과학적이고 객관적인 감별법으로 폭넓게 활용되리라 기대된다.
제안 방법
AFLP법을 이용한 감별 − 담죽엽과 죽엽 샘플은 현미경법으로 확인된 각 10개의 샘플에 대해 AFLP법으로 실험하였다.
국내에서는 담죽엽과 죽엽을 구분하여 판매하고 있으며 대부분이 중국에서 수입된다. 구입한 담죽엽과 죽엽은 각각 10 건씩으로 감별전문가로부터 감별 후 현미경 검경을 통해 담죽엽과 죽엽을 재분류하였다.
담죽엽과 죽엽의 감별법을 개발하기 위해 본 연구에는 재현성이 좋은 AFLP법을 활용하였으며, 국내 약재 시장과 일본 및 중국 등에서 직접 구입한 샘플에 대해 현미경법으로 1차 확인 후 본 실험에 활용하였다. 현미경 검경법을 통해 확인한 결과 담죽엽과 죽엽은 식물 조직에서 뚜렷한 차이가 있었으며 이를 토대로 AFLP법의 실험 결과와 비교하였을 때 현미경법으로 확인된 결과와 일치하였다.
본 시험법의 원리는 PCR반응에서 특이 프라이머가 인식할 수 있는 반응 부위가 많지 않은 유전자에 제한효소를 이용하여 절단한 다음 절단면 끝에 임의로 합성한 DNA 조각(“adaptor”)를 붙이고 이 부위에 PCR이 되도록 특이 프라이머를 제작한다.
유전자 증폭 결과를 확인하기 위해 1.2% 아가로즈겔 상에서 증폭반응이 끝난 시료 10 µL를 전기영동법으로 확인하였다.
유전자 증폭 반응은 멸균된 0.5 mL 튜브에 PCR용 완충액(10 × amplification buffer) 2 µL, 60 ng의 EcoR I primer, 60 ng의 Mse I primer, 4 µL의 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP : 각 2.5 mM), 0.2 L의 Taq polymerase ((Finnzymes Fusion Taq polymerase and buffer : 2.5 units/µL)와 5 µL의 1 차 선택 증폭된 유전자 산물을 넣어 최종 반응액 20 µL로 하였다.
유전자증폭 반응에 사용된 기기는 PTC-200 PCR machine(MJ Research Co.)를 이용하였으며 1 차 변성은 95℃에서 2 분, 변성은 95℃에서 45 초, 결합반응은 56℃에서 45 초 및 증폭반응은 72℃에서 1 분 30 초간 진행하였으며 본 과정을 35 회 실시하였다. 유전자 증폭 결과를 확인하기 위해 1.
유전자증폭 반응은 온도 구배를 이용한 방법으로 진행하였으며 반응 조건은 1 차 변성은 94℃에서 2 분, 변성은 94℃ 에서 1 분 및 증폭반응은 72℃에서 2 분 진행하였으며 본 과정은 36 회 실시하였다. 결합 반응 온도는 65℃에서 56℃ 까지 설정하였으며 1 회전이 진행된 이후 0.
전개액은 10 µL를 넘지 않도록 하였으며 2% 아가로즈 겔을 이용해 각 증폭 밴드를 확인하였다.
대상 데이터
실험재료 − 본 실험에 사용된 담죽엽과 죽엽 샘플은 국내 5 개 지역(부산, 대구, 대전, 광주, 원주), 중국 2 개 지역 및 일본 2 개 지역(동경, 오사카)에서 구입하였다.
성능/효과
AFLP법은 식물 조직을 구성하고 있는 세포 속의 유전자가 동일한 유전자이며 동일한 염기서열을 갖는다면 유전자 증폭 패턴도 동일하게 보여짐을 확인 할 수 있었다.
즉, 유전자 증폭 패턴이 다르다는 것은 염기서열이 다른 식물로 기원이 서로 다른 식물임을 간접적으로 입증하는 것이다. AFLP법을 이용한 담죽엽과 죽엽의 감별 결과는 현미경 실험결과와도 일치함으로서 실험의 정확성도 검증되었다. 다만 죽엽의 경우 샘플간 유전자 증폭 패턴이 일치하지 않은 것은 우리나라는 솜대(Phllostachys nigra Munro var.
표면 형태도 담죽엽은 맑고 선명한 특징을 보이나 죽엽은 거칠고 탁한 특징을 보인다. 또한 위품으로 판별된 샘플은 현미경으로 관찰하였을 때 담죽엽과 죽엽의 특징과는 전혀 다른 형태를 보였으며 외부 형태도 담죽엽과는 차이가 있었다(Fig. 3).
담죽엽은 감기에 주로 사용되는 “은교산” 처방에 사용되나 확인시험법 등의 이화학적 시험법이 설정되어 있지 않아 품질 관리에 어려움이 있다. 본 연구는 현미경법을 이용하여 담죽엽과 죽엽 샘플에 대해 1 차 확인하였으며, 현미경을 이용한 감별에서 담죽엽과 죽엽의 세포조직에 차이가 있었다.
AFLP법을 이용한 감별 − 담죽엽과 죽엽 샘플은 현미경법으로 확인된 각 10개의 샘플에 대해 AFLP법으로 실험하였다. 유전자를 이용한 AFLP법은 PCR과정에서 특이 프라이머가 시료에 들어있는 주형 유전자와 결합하여 증폭 밴드의 크기에 따라 다양한 패턴을 보였다(Fig. 4). 이러한 증폭 밴드의 패턴은 담죽엽과 죽엽이 서로 다른 염기구조를 갖는 것에서 기인된 것이다.
또한, 담죽엽 샘플 대부분은 150 bp 부근에서 2 개의 증폭 밴드를 보이지만 죽엽 대부분의 샘플은 1 개의 증폭 밴드를 보였다. 이러한 특징을 보인 담죽엽 시료들은 현미경법에서 불규칙한 직사각형 무늬를 보였으며, AFLP법에서도 모두 유사한 유전자 증폭 패턴을 보였다.
전기영동 − 유전자증폭반응 결과는 아가로즈 겔 또는 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동법으로 확인할 수 있다.
현재, 관능검사 등을 통해 한약재의 기원, 성상 등을 확인하고 있으나 일부 생약(한약)의 경우 육안을 통한 생약(한약) 감별에 한계가 있으면 사람마다 객관성 확보에 어려움이 있다. 특히 본 연구를 위해 우리나라를 비롯한 중국 및 일본 현지에 직접 방문하여 샘플을 구입한 결과 동일한 약재라도 각 나라별 채취시기와 건조 방법, 유통 기간 및 보관 환경에 따라 성상이 달라질 수 있다는 문제점도 확인하였다.
담죽엽과 죽엽의 감별법을 개발하기 위해 본 연구에는 재현성이 좋은 AFLP법을 활용하였으며, 국내 약재 시장과 일본 및 중국 등에서 직접 구입한 샘플에 대해 현미경법으로 1차 확인 후 본 실험에 활용하였다. 현미경 검경법을 통해 확인한 결과 담죽엽과 죽엽은 식물 조직에서 뚜렷한 차이가 있었으며 이를 토대로 AFLP법의 실험 결과와 비교하였을 때 현미경법으로 확인된 결과와 일치하였다.
현미경법에서 죽엽으로 판명된 샘플에 대해 AFLP법으로 확인한 결과 대부분 150 bp 보다 작은 크기의 유전자 증폭 밴드가 확인되었으며, 담죽엽과 달리 샘플 상호간 유사한 유전자 증폭 패턴을 보이지는 않았다. 또한, 위품으로 확인된 샘플에서는 유전자 증폭 패턴이 담죽엽, 죽엽과는 차이를 보였다(Fig.
후속연구
따라서 본 연구를 통해 기원이 명확한 담죽엽이 유통될 수 있는 품질관리법을 개발함으로서 안전하고 우수한 한약재의 유통에 기여하고 국민의 신뢰를 확보하는데 이바지 할 것으로 기대된다.
본 연구는 이러한 한계점을 극복하기 위해 유전자분석법을 통한 담죽엽의 확인시험법을 연구하였으며, 개발된 시험법을 이용하여 기원이 정확한 약재가 유통될 수 있도록 품질관리에 이바지 하고자 한다. 또한 본 연구에서 개발된 시험법을 응용하여 감별이 어려운 다른 생약(한약)에 대해 과학적이고 객관적인 감별법으로 폭넓게 활용되리라 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
담죽엽(淡竹葉)은 무엇인가?
담죽엽(淡竹葉)은 대한약전외 한약(생약)규격집(2007)1)에 “벼과(Gramineae) 조릿대풀 (Lophatherum gracile Bronghiart)로 꽃피기 전의 지상부를 의미하며, 길이 25~75 cm, 줄기는 원주형으로 마디가 있으며 바깥면은 엷은 황록색이고 꺽은면은 속이 비어있다”로 기술되어 있다. 또한, 중약대사전2)에는 “쭈글쭈글하고 약간 목질화한 뿌리줄기가 있으며 수염뿌리의 중간부분이 팽대하고 원기둥꼴 모양의 덩이뿌리”로 되어있다.
은교산 처방 중 담죽엽은 어디에 사용되는가?
두통, 감기로 인한 인후통 및 기침 등의 적응증에 사용되는 은교산 처방 중 담죽엽이 죽엽과 오용되어 사용될 수 있으나, TLC법 등의 과학적인 확인시험법등 감별법이 설정되지 않아 품질관리에 어려움이 있어 본 연구를 실시하였다.
담죽엽과 죽엽은 동일한 벼과의 식물이나, 속이 다른 식물이다. 이를 구별하기 위한 기존의 방법은 어떤 어려움이 있었는가?
잎의 한쪽 면은 비교적 반들반들하고 다른 한쪽 면은 작은 톱니가 있고 거친 특징이 있다. 생약(한약)의 확인시험법으로는 TLC(Thin Layer Chromatography)와 HPTLC(High Performance Thin Layer Chromatography) 등이 널리 활용되고 있으나, 이러한 이화학적 시험법으로는 식물의 기원 종을 구별하는데 한계가 있으며 이마저도 설정되지 않아 품질관리에 어려움이 있다.
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