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문제 정의
- 본 연구에서는 국화과 Chrysanthemum속의 마가렛, 국화 및 낙동구절초의 꽃과 잎줄기 추출물의 항산화물질 함량 및 항산화활성을 분석하여 식물의 부위에 따른 항산화효과를 비교하고, 천연 항산화 소재로 개발 가치가 높은 식물과 부위를 선발하여 향후 국화과 식물을 이용한 기능성 소재 개발의 기초자료로 활용하고자 하였다. 특히 기능성 식물소재로 활용도가 낮았던 잎줄기의 생리활성을 분석하여 부산물로 버려지는 잎줄기의 활용도를 증가시키고자 하였다.
- 본 연구에서는 국화과 Chrysanthemum속의 마가렛, 국화 및 낙동구절초의 꽃과 잎줄기 추출물의 항산화물질 함량 및 항산화활성을 분석하여 식물의 부위에 따른 항산화효과를 비교하고, 천연 항산화 소재로 개발 가치가 높은 식물과 부위를 선발하여 향후 국화과 식물을 이용한 기능성 소재 개발의 기초자료로 활용하고자 하였다. 특히 기능성 식물소재로 활용도가 낮았던 잎줄기의 생리활성을 분석하여 부산물로 버려지는 잎줄기의 활용도를 증가시키고자 하였다.
가설 설정
- 3)Concentration of the material which is required to reduction 50% of ferrous ion.
제안 방법
- 5 mL를 갈색병에 첨가하여 반응액을 만들었으며, 40oC 암소에 저장하였다. 4일 간격으로 반응액 0.1 mL, 75% 에탄올 2.7 mL, 30% ammonium thiocyanate (221988, Sigma) 0.1 mL, 20 mM ferrous chloride[iron(II) chloride tetrahydrate; 220299, Sigma] 0.1 mL를 첨가하여 혼합한 후 3분 후에 500 nm에서 흡광도를 조사하여 산화 정도를 측정하였다(15). 양성 대조군은 추출물 대신 BHT를 동일 농도로 반응액을 조성하여 실험하였다.
- 농도별 추출물 50 μL에 ABTS 용액 950 μL를 첨가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거능(RC50)은 DPPH radical 소거능과 같은 방법으로 계산하였으며, 소거능을 비교하기 위한 양성 대조군은 BHT와 ascorbic acid를 사용하였다.
- DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; D9132, Sigma) radical 소거능은 추출물 0.2 mL와 0.15 mM DPPH 용액 0.8mL을 혼합하여 실온 암상태에서 30분 동안 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정한 다음 시료 첨가구와 시료 대신 용매를 첨가한 대조군의 흡광도 차이를 아래의 식에 의하여 백분율(%)로 구하였다(12). 단순회귀분석을 통하여 시료 무첨가구의 EDA를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도 (mg·mL-1)를 RC50값으로 나타냈다.
- 모든 실험은 3반복을 1회로 하여 2회 이상 반복 실험하였다. 통계처리는 SAS version 9.
- 1 mL를 첨가하여 혼합한 후 3분 후에 500 nm에서 흡광도를 조사하여 산화 정도를 측정하였다(15). 양성 대조군은 추출물 대신 BHT를 동일 농도로 반응액을 조성하여 실험하였다. 지질과산화 억제율은 아래와 같이 구하였다.
- 천연 항산화제를 개발하기 위하여 80% 에탄올을 용매로 환류냉각 추출한 마가렛, 국화 및 낙동구절초의 꽃과 잎줄기(shoot)의 페놀성 물질 함량, DPPH radical과 ABTS radical 소거능, ferrous ion chelating 효과 및 linoleic acid에 대한 지질과산화 억제활성을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량, 총플라보노이드 함량, DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능은 국화 잎줄기 추출물에서 가장 높았으며, 특히 국화 잎줄기 추출물의 ABTS radical 소거능은 천연 항산화제인 ascorbic acid와 합성 항산화제인 BHT와 유사하였다.
- 1 mL를 첨가한 다음 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켰으며, 562 nm에서 흡광도를 측정하였다(14). 추출물의 chelating 효과는 아래의 수식에 따라 산출한 후, 단순회귀분석을 이용하여 ferrous ion을 50% chelating 시키는데 필요한 시료의 농도(RC50)를 구하였으며, 대조구로는 대표적 chelating agent인 EDTA를 사용하였다.
대상 데이터
- 충북 청원군에 소재한 노지 실험포장에서 재배하던 마가렛(Chrysanthemum frutescens)의 꽃은 6월, 잎줄기는 8월에 수확하였다. 국화(Chrysanthemum morifolium)의 잎줄기는 충북 청원군의 노지 실험포장에서 9월에 수확하였으며, 꽃은 충북 청주시에 위치한 비닐하우스에서 10월에 수확 하였다. 낙동구절초(Chrysanthemum zawadskii ssp.
- 국화(Chrysanthemum morifolium)의 잎줄기는 충북 청원군의 노지 실험포장에서 9월에 수확하였으며, 꽃은 충북 청주시에 위치한 비닐하우스에서 10월에 수확 하였다. 낙동구절초(Chrysanthemum zawadskii ssp. naktongense)의 꽃, 잎 및 줄기는 충북 청주시의 비닐하우스에서 10월에 수확하였다. 식물재료는 수확 후 바로 수세하여 동결건조기(FD8512, Il Shin Lab.
- 단순회귀분석을 통하여 시료 무첨가구의 EDA를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도 (mg·mL-1)를 RC50값으로 나타냈다. 양성 대조군으로는 BHT(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol; B1378, Sigma, Deisenhofen, Germany)와 ascorbic acid(A5960, Sigma, Beijing, China)를 사용하였다.
- 분쇄한 건조시료는 80% 에탄올을 용매로 60oC에서 6시간 동안 환류냉각 추출하였다. 추출물은 여과지(Advantec No. 2, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan) 2장으로 감압여과 한 후 잔사를 2회 재추출하여 총 3회 추출하여 실험에 사용하였다. 최종 추출물은 아래의 식에 의하여 추출수율을 구하였으며, 질소를 충전 하여 -70oC(SW-UF-200, Samwon Engineering Co.
- 충북 청원군에 소재한 노지 실험포장에서 재배하던 마가렛(Chrysanthemum frutescens)의 꽃은 6월, 잎줄기는 8월에 수확하였다. 국화(Chrysanthemum morifolium)의 잎줄기는 충북 청원군의 노지 실험포장에서 9월에 수확하였으며, 꽃은 충북 청주시에 위치한 비닐하우스에서 10월에 수확 하였다.
데이터처리
- 1)Means within the same column with different superscripts are significantly different by Duncan's multiple range test (p＜0.05).
- 3)Means within the same column with different superscripts are significantly different by Duncan's multiple range test (p＜0.05).
- 4)Means within the same column with different superscripts are significantly different by Duncan's multiple range test (p＜0.05).
- 통계처리는 SAS version 9.1(SAS instritute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 Duncan의 다중검정방법(Duncan's multiple range test)로 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- ABTS[2,2´-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt; A9941, Sigma, St. Louis, MO, USA] radical 소거활성은 ABTS radical cation decolorization assay를 이용하여 측정하였다(13).
성능/효과
- 0.125 mg·mL-1의 농도로 조절한 추출물의 linoleic acid 과산화 억제활성을 조사한 결과, 반응 4일째에는 마가렛의 꽃 추출물에서 지질과산화 억제활성이 가장 우수하였으며 (90.19%), BHT와 지질과산화 억제활성이 유사하였다 (Table 4).
- Free radical의 일종이며, 체내 산화의 원인으로 알려진 DPPH radical(12)이 항산화물질에 의하여 환원되는 원리를 이용하여 DPPH radical 소거능을 측정한 결과, 국화의 잎줄기 추출물에서 소거능이 가장 우수했으며(RC50 ＝0.13 mg· mL-1), 국화의 꽃 추출물(RC50 ＝0.54 mg·mL-1)에서 소거능이 가장 낮았다(Table 3).
- 그러나 Fe2+ chelating 효과는 국화 잎줄기 추출물에서 가장 낮았으며, 국화 꽃 추출물에서 가장 우수하였다. Linoleic acid에 대한 지질과산화 억제활성은 마가렛과 국화 잎줄기 추출물에서 가장 우수하였으나, BHT보다 억제활성이 낮았다. 연구의 결과, 국화 잎줄기 추출물은 페놀성 물질 함량 및 radical 소거활성이 우수하여 천연 항산화제로 개발 가치가 매우 높은 것으로 생각되었다.
- Potassium persulfate와 반응하여 형성된 청록색의 ABTS radical cation이 추출용액의 항산화 물질에 의하여 소거되어 탈색되는 원리를 이용하여 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, ABTS radical 소거능은 국화의 잎줄기 추출물에서 가장 높고(RC50 ＝0.18 mg·mL-1), 낙동구절초의 꽃추출물(RC50＝0.42 mg·mL-1)에서 가장 낮았다(Table 3).
- 국화 잎줄기 추출물의 ABTS radical 소거능은 ascorbic acid (RC50 ＝0.20 mg·mL-1) 및 BHT(RC50 ＝0.22 mg·mL-1)와 유사하게 나타나 ABTS radical 소거능이 매우 강한 것을 알수 있었다.
- 54 mg·mL-1)에서 소거능이 가장 낮았다(Table 3). 국화의 잎줄기 추출물은 3종의 Chrysanthemum속 식물의 꽃과 잎줄기 추출물 중 DPPH radical 소거활성이 가장 높았으나, 시판중인 항산화제인 ascorbic acid와 BHT보다는 소거능이 낮았다.
- 총 플라보노이드 함량 또한 국화의 잎줄기에서 가장 높았다. 국화의 잎줄기에 함유된 총 플라보노이드의 함량은 꽃보다 3.4배 많았으며, 본 연구에서 총 플라보노이드의 함량이 가장 낮게 나타난 낙동구절초 꽃보다 총 플라보노이드의 함량이 4.8배 많았다.
- 3배 많이 함유되어 있었다. 국화의 잎줄기와 꽃의 총 폴리페놀 함량을 비교한 결과, 국화의 잎줄기는 국화의 꽃보다 2.7배많은 총 폴리페놀이 함유되어 있었다. 총 플라보노이드 함량 또한 국화의 잎줄기에서 가장 높았다.
- 8배 높았다. 대체로 꽃이 잎줄기보다 수분함량이 적고, 추출수율이 높았으므로 추출소재로 적합한 것으로 생각되었다. 그러나 꽃은 수확시기가 한정적이며, 수확량이 잎줄기보다 적으므로 산업화하기 위해서는 수확량과 추출효율을 같이 고려해야 할 것으로 생각된다.
- 98%로 억제활성은 미비하였다. 따라서 마가렛의 꽃과 국화의 잎줄기 추출물은 지질과산화 억제활성이 비교적 우수하지만 단독으로는 장기간 동안 지질과산화를 효과적으로 억제할 수 없으므로 다른 추출물 또는 항산화제와 혼용하여 사용해야할 것으로 생각되었다.
- 19%), BHT와 지질과산화 억제활성이 유사하였다 (Table 4). 마가렛 꽃의 추출물을 제외한 나머지 추출물은 68.69～77.40%의 우수한 지질과산화 억제활성을 보였다. 그러나 국화의 꽃 및 낙동구절초의 꽃과 잎줄기의 추출물은 반응 4일 이후에는 지질과산화 억제활성을 보이지 않았다.
- 마가렛, 국화 및 낙동구절초의 꽃의 수분함량은 83.9～ 84.3%, 추출수율은 28.4～42.8%, 잎줄기의 수분함량은 70.6 ～90.4%, 추출수율은 16.1～26.4%로 나타났다(Table 1). 추출수율은 모두 꽃에서 우수하였는데, 마가렛, 국화 및 낙동구절초 꽃의 추출수율은 잎줄기의 추출물보다 각각 1.
- 22%의 높은 지질과산화 억제 활성을 유지하였으나, 12일 이후에는 활성을 보이지 않았다. 마가렛과 국화의 잎줄기 추출물은 반응 12일째에 각기 20.10과 60.73%의 지질과산화 억제활성을 보였으며, 반응 16일째에도 지질과산화 억제활성을 보였으나 각기 5.64와 3.98%로 억제활성은 미비하였다. 따라서 마가렛의 꽃과 국화의 잎줄기 추출물은 지질과산화 억제활성이 비교적 우수하지만 단독으로는 장기간 동안 지질과산화를 효과적으로 억제할 수 없으므로 다른 추출물 또는 항산화제와 혼용하여 사용해야할 것으로 생각되었다.
- 본 연구에서 페놀성 물질의 함량이 가장 우수한 것으로 나타난 국화의 잎줄기는 약용식물인 팔각, 뽕나무 잎, 육두구, 생강(16), 감초 뿌리, 오갈피나무 수피와 뿌리, 갈근뿌리, 산수유 열매, 당귀 뿌리(17), 국화과의 홍화(18), 참취 잎줄기와 해국, 벌개미취, 단양쑥부쟁이의 꽃과 잎줄기(19)보다 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높으므로 페놀성 물질 함량이 높은 식물성 항산화소재로 활용 가치가 높은 것으로 생각되었다.
- 식물의 부위별 총 폴리페놀의 함량을 비교한 결과, 마가렛은 부위에 따른 총 폴리페놀의 함량차가 없었으나 국화는 잎줄기, 낙동구절초는 꽃에서 총폴리페놀의 함량이 많았다. 부위별 총 플라보노이드의 함량을 비교한 결과, 마가렛은 꽃, 국화와 낙동구절초는 잎줄기에서 총 플라보노이드의 함량이 많았다. 따라서 식물의 종과 생리활성 물질의 종류에 따라 많이 함유된 부위가 다르므로 식물의 생리활성 물질을 이용하기 위해서는 각 식물과 이용하고자하는 생리활성 물질의 종류에 따라 적정 부위를 선택적으로 사용해야 할 것으로 생각되었다.
- 상기의 연구에서 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 가장 높게 나타난 국화의 잎줄기 추출물은 DPPH 및 ABTS radical 소거능도 가장 우수하게 나타났으나, Fe2+ chelating 효과는 가장 낮았다(RC50 ＝12.82 mg· mL-1).
- 연구의 결과, 식물 종에 따라 생리활성 물질의 함량이 다르며, 같은 식물도 부위에 따라 생리활성 물질의 함량이 크게 다른 것을 알 수 있었다. 식물의 부위별 총 폴리페놀의 함량을 비교한 결과, 마가렛은 부위에 따른 총 폴리페놀의 함량차가 없었으나 국화는 잎줄기, 낙동구절초는 꽃에서 총폴리페놀의 함량이 많았다. 부위별 총 플라보노이드의 함량을 비교한 결과, 마가렛은 꽃, 국화와 낙동구절초는 잎줄기에서 총 플라보노이드의 함량이 많았다.
- 연구의 결과, Chrysanthemum 식물의 잎줄기는 꽃보다 수분함량이 높고 추출수율이 낮은 단점이 있으나, 항산화물 질의 함량이 높고 항산화활성이 비교적 우수하므로 항산화 기능성 소재로 활용할 수 있을 것으로 생각되었다. 특히 국화의 잎줄기는 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 가장 높고, radical 소거활성이 우수하며 지질과산화 억제활성도 비교적 우수하였으므로, 가을철 국화 축제 및 경관산업 등의 소재로 자주 사용되는 국화의 재배 중에 발생하는 잎줄기 및 꽃이 지고 남는 잎줄기를 이용하여 다양한 항산화 기능성 제품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
- Linoleic acid에 대한 지질과산화 억제활성은 마가렛과 국화 잎줄기 추출물에서 가장 우수하였으나, BHT보다 억제활성이 낮았다. 연구의 결과, 국화 잎줄기 추출물은 페놀성 물질 함량 및 radical 소거활성이 우수하여 천연 항산화제로 개발 가치가 매우 높은 것으로 생각되었다. 그러나 금속이온 chelating 및 지질 과산화 억제활성은 다소 낮으므로, 다발적으로 발생하는 산화스트레스를 방지하기 위한 항산화제를 개발하고자 할 때는 국화 잎줄기 추출물과 다른 항산화제를 같이 사용하는 것이 좋을 것으로 생각된다.
- 연구의 결과, 식물 종에 따라 생리활성 물질의 함량이 다르며, 같은 식물도 부위에 따라 생리활성 물질의 함량이 크게 다른 것을 알 수 있었다. 식물의 부위별 총 폴리페놀의 함량을 비교한 결과, 마가렛은 부위에 따른 총 폴리페놀의 함량차가 없었으나 국화는 잎줄기, 낙동구절초는 꽃에서 총폴리페놀의 함량이 많았다.
- 체내 radical을 제거하여 산화방지 효과를 내는 페놀성 물질인 총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량을 분석한 결과 총 폴리페놀의 함량은 23.31～77.50 mg·g-1,총 플라보노이드 함량은 11.84～56.49 mg·g-1으로 나타났다(Table 2).
- 체내에서 세포의 지질 및 단백질의 산화를 촉진하는 Fe2+ (19)의 chelating 효과를 분석한 결과, 국화의 꽃 추출물 (RC50 ＝0.94 mg·mL-1)에서 Fe2+ chelating 효과가 가장 우수 하였다(Table 3).
- 천연 항산화제를 개발하기 위하여 80% 에탄올을 용매로 환류냉각 추출한 마가렛, 국화 및 낙동구절초의 꽃과 잎줄기(shoot)의 페놀성 물질 함량, DPPH radical과 ABTS radical 소거능, ferrous ion chelating 효과 및 linoleic acid에 대한 지질과산화 억제활성을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량, 총플라보노이드 함량, DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능은 국화 잎줄기 추출물에서 가장 높았으며, 특히 국화 잎줄기 추출물의 ABTS radical 소거능은 천연 항산화제인 ascorbic acid와 합성 항산화제인 BHT와 유사하였다. 그러나 Fe2+ chelating 효과는 국화 잎줄기 추출물에서 가장 낮았으며, 국화 꽃 추출물에서 가장 우수하였다.
- 49 mg·g-1으로 나타났다(Table 2). 총 폴리페놀 함량은 국화의 잎줄기에서 가장 높았으며, 총 폴리페놀 함량이 가장 적게 나타난 낙동구절초의 잎줄기보다 3.3배 많이 함유되어 있었다. 국화의 잎줄기와 꽃의 총 폴리페놀 함량을 비교한 결과, 국화의 잎줄기는 국화의 꽃보다 2.
- 7배많은 총 폴리페놀이 함유되어 있었다. 총 플라보노이드 함량 또한 국화의 잎줄기에서 가장 높았다. 국화의 잎줄기에 함유된 총 플라보노이드의 함량은 꽃보다 3.
- 4%로 나타났다(Table 1). 추출수율은 모두 꽃에서 우수하였는데, 마가렛, 국화 및 낙동구절초 꽃의 추출수율은 잎줄기의 추출물보다 각각 1.6, 1.4, 1.8배 높았다. 대체로 꽃이 잎줄기보다 수분함량이 적고, 추출수율이 높았으므로 추출소재로 적합한 것으로 생각되었다.
후속연구
- 특히 국화의 잎줄기는 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 가장 높고, radical 소거활성이 우수하며 지질과산화 억제활성도 비교적 우수하였으므로, 가을철 국화 축제 및 경관산업 등의 소재로 자주 사용되는 국화의 재배 중에 발생하는 잎줄기 및 꽃이 지고 남는 잎줄기를 이용하여 다양한 항산화 기능성 제품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 국화의 잎줄기는 향이 강하고 쓴 맛이 강한 편이므로 차후 이를 제거 하여 소비자의 기호를 높일 수 있는 방법을 개발할 필요가 있는 것으로 생각된다.
- 연구의 결과, 국화 잎줄기 추출물은 페놀성 물질 함량 및 radical 소거활성이 우수하여 천연 항산화제로 개발 가치가 매우 높은 것으로 생각되었다. 그러나 금속이온 chelating 및 지질 과산화 억제활성은 다소 낮으므로, 다발적으로 발생하는 산화스트레스를 방지하기 위한 항산화제를 개발하고자 할 때는 국화 잎줄기 추출물과 다른 항산화제를 같이 사용하는 것이 좋을 것으로 생각된다.
- 부위별 총 플라보노이드의 함량을 비교한 결과, 마가렛은 꽃, 국화와 낙동구절초는 잎줄기에서 총 플라보노이드의 함량이 많았다. 따라서 식물의 종과 생리활성 물질의 종류에 따라 많이 함유된 부위가 다르므로 식물의 생리활성 물질을 이용하기 위해서는 각 식물과 이용하고자하는 생리활성 물질의 종류에 따라 적정 부위를 선택적으로 사용해야 할 것으로 생각되었다.
- 연구의 결과, Chrysanthemum 식물의 잎줄기는 꽃보다 수분함량이 높고 추출수율이 낮은 단점이 있으나, 항산화물 질의 함량이 높고 항산화활성이 비교적 우수하므로 항산화 기능성 소재로 활용할 수 있을 것으로 생각되었다. 특히 국화의 잎줄기는 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 가장 높고, radical 소거활성이 우수하며 지질과산화 억제활성도 비교적 우수하였으므로, 가을철 국화 축제 및 경관산업 등의 소재로 자주 사용되는 국화의 재배 중에 발생하는 잎줄기 및 꽃이 지고 남는 잎줄기를 이용하여 다양한 항산화 기능성 제품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 국화의 잎줄기는 향이 강하고 쓴 맛이 강한 편이므로 차후 이를 제거 하여 소비자의 기호를 높일 수 있는 방법을 개발할 필요가 있는 것으로 생각된다.
- 그동안 국화과 식물의 기능성 생리활성에 관한 연구 및 상품 개발은 주로 꽃에 한정되어왔으나(7,8), 식물은 부위에 따라 기능성 생리활성에 차이가 있으므로(9) 부위별 생리활성을 분석하여 적정 활용방안을 개발할 필요가 있다. 특히 꽃보다 수확량이 많은 잎줄기를 건강 기능성 소재로 활용할 수 있다면 경제적인 식물소재로 사용할 수 있으며, 국화류 재배 시 도장 방지 및 개화수 증가를 위한 적심처리에서 발생하는 부산물 및 꽃을 수확하고 남는 부산물을 효율적으로 처리할 수 있으므로 재배농가의 부산물 처리 비용을 절감하고 소득을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
- 이는 금속이온을 제거할 수 있는 물질과 radical을제거할 수 있는 물질이 다르기 때문이며(20), 따라서 국화의 잎줄기는 radical을 효과적으로 제거할 수 있는 페놀성 물질 의 함량은 높지만 금속이온을 제거할 수 있는 생리활성 물질의 함량은 매우 낮은 것으로 생각되었다. 한편 본 연구에서 사용한 모든 추출물은 금속이온 chelating agent인 EDTA보다 Fe2+의 chelating 효과가 극히 낮았으므로 체내에 생성된 Fe2+를 효과적으로 제거시킬 수 있는 천연물로 활용하기는 어려운 것으로 생각되었다.
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