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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 고꾸미 소재 개발을 위해 글루타치온 생산 효모 탐색과 균주개량을 통해 얻은 고글루타치온 함유 효모의 관능적 특성과 생리활성을 조사하고자 하였다. 즉, 상업용 및 식품소재 발효물로부터 글루타치온을 생산하는 효모를 분리하여, UV 조사법을 이용한 균주개량으로 고글루타치온 함유 효모를 개발하고, 이의 고꾸미 부여능과 항산화 활성을 분석하였다.
제안 방법
- 조사한 균액을 30 µg/mL의 sodium azide가 첨가된 YM broth에 2%(v/v) 농도가 되도록 접종하였다. 25℃에서 4일간 진탕 배양한 다음 YM agar(Yeast Mold agar, Difco)에 도말하여 균주의 생육유무를 확인하였다.
- 관능검사 항목은 이미, 이취(쓴맛), 우마미(감칠맛), 고꾸미(맛의 지속성, continuity; 부드럽고 깊은 맛, mouthfulness; 치킨콘소메 스프의 향미 강화, chicken flavor enhance)와 함께 전체적인 기호도 등에 대해 9점 평가법을 행하였다. 각 시료의 용기에는 검사물에 대한 편견을 없애기 위하여 난수표에서 추출한 세 자리 숫자를 표기하였으며, 추출물의 관능적 특성 강도는 9점 항목 척도를 사용하였고, 시료 제시는 랜덤하게 하였다. 또한 평가 사이에 입을 헹굴 수 있도록 정수기를 통과시킨 상온(27±2℃)의 물을 함께 제시하였다.
- 고꾸미를 나타내는 항목 중 맛의 지속성과 치킨향미 강화능은 마늘추출물→양파추출물→효모추출물로 평가된 반면, 부드럽고 깊은 맛은 효모추출물→양파추출물→마늘추출물 순으로 각 항목별로 다르게 조사되었다.
- 3%가 되도록 물에 용해하여 패널에게 제시하고 관능평가를 수행하였다(Table 1). 관능검사 항목은 이미, 이취(쓴맛), 우마미(감칠맛), 고꾸미(맛의 지속성, continuity; 부드럽고 깊은 맛, mouthfulness; 치킨콘소메 스프의 향미 강화, chicken flavor enhance)와 함께 전체적인 기호도 등에 대해 9점 평가법을 행하였다. 각 시료의 용기에는 검사물에 대한 편견을 없애기 위하여 난수표에서 추출한 세 자리 숫자를 표기하였으며, 추출물의 관능적 특성 강도는 9점 항목 척도를 사용하였고, 시료 제시는 랜덤하게 하였다.
- 관능검사에 관심과 참여 의지가 있는 샘표식품(주)의 훈련된 관능검사원을 선별하여 1주일에 3일씩 12주간 훈련시킨 후 효모추출물의 관능검사에 참여시켰다. 치킨콘소메 스프(Herbox, Hormel Foods, Austin, MN, USA)를 기본베이스로 효모추출물, 양파추출물, 마늘추출물을 각각 배합한 치킨 콘소매 혼합물을 최종 농도 5.
- 1×103 CFU/mL까지 사멸하였다. 따라서 SEM-Y8의 균주 개량 조건은 108-109 CFU/mL에 대해 6분간 UV를 처리한 다음, plate상에서 생존한 효모 균주만을 선택 배양하면서 생성된 글루타치온 농도를 비교하였다. Fig.
- 효모추출물을 조미소재로 사용하려면 효모 자체의 정미성이 우수하고, 이미이취가 적은 것이 바람직하다. 따라서 효모 균체를 자가소화시켜 관능적으로 우수한 균주를 선별한 후, 그 균주를 대상으로 글루타치온 생산량이 증가된 특성을 갖도록 균주를 개량하였다. 상업용 시판균주 및 자연발효물에서 분리한 균주 등 68종의 효모균주를 대상으로 관능검사를 수행하였다.
- 또한 평가 사이에 입을 헹굴 수 있도록 정수기를 통과시킨 상온(27±2℃)의 물을 함께 제시하였다.
- 0 mL을 가한 후 aluminum foil을 이용하여 빛을 차단하고 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응액의 흡광도는 305 nm(Spectrophotometer UV-1201, Shimadzu Co., Tokyo, Japan)에서 측정하였고, 0-200 uM의 글루타치온(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하여 검량선을 구하였다.
- 효모를 YM broth에 접종하여 30℃에서 36시간 진탕 배양한 종균 배양액을 배지부피에 대해 1%(v/v)가 되도록 YM broth에 접종하고, 24시간 진탕 배양 하였다. 배양액 6 mL을 원심분리 하여 회수한 균체를 생리식염수 6 mL에 현탁 시킨 후 petri-dish에 옮겨 UV lamp(40 Watt)로 부터 30 cm의 거리에서 6분 동안 UV를 조사하였다. 조사한 균액을 30 µg/mL의 sodium azide가 첨가된 YM broth에 2%(v/v) 농도가 되도록 접종하였다.
- 배지조성에 따른 글루타치온 생성능을 비교하고자, 효모 배양용 기본 배지인 YM broth와 선택 배지를 이용하여 SY8-M2-1 효모에서의 글루타치온 생산농도를 비교하였다. Table 2에서 나타낸 것과 같이, 배지종류에 따라 생성된 글루타치온 농도는 YM broth 113.
- 본 연구에서 개량한 효모추출물의 정미성 검사는 치킨콘소메스프를 기본베이스로 마늘 또는 양파추출물을 첨가한 경우를 비교군으로 정하여 관능검사를 수행하였다. Fig.
- 본 연구에서 사용한 효모는 YM broth(Yeast Mold broth, Difco, Detroit, MI, USA)에 균주를 접종한 다음 30℃에서 30시간 배양하여 얻은 배양액을 멸균수로 희석하여 600 nm에서 흡광도를 측정한 후 동일하게 보정하였다. 배양액은 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상층액을 제거하고, 멸균수를 이용하여 3회 반복하여 세척한 다음, 침전물(yeast cream)만 회수하여 자가소화에 이용하였다.
- 따라서 효모 균체를 자가소화시켜 관능적으로 우수한 균주를 선별한 후, 그 균주를 대상으로 글루타치온 생산량이 증가된 특성을 갖도록 균주를 개량하였다. 상업용 시판균주 및 자연발효물에서 분리한 균주 등 68종의 효모균주를 대상으로 관능검사를 수행하였다. 1차 선별 균주로는 Saccharomyces cerevisiae 3종(SEM-Y4, SEM-Y5, SEM-Y6), Candida utilis 4종(SEM-Y8, SEM-Y9, SEM-Y10, SEMY11) 및 Zygosaccharomyces rouxii 1종(SEM-Y12) 등 모두 8종의 효모가 정미성이 우수한 균주로 선별되었다.
- 5에서 배양하였다. 이때, 글루타치온의 생산을 위하여 YM broth(1.0% glucose, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract)와 선택 배지(4.0% yeast extract, 1.5% glucose, 0.04% NH4H2PO4, 0.04% L-cystein)에서의 글루타치온 생산농도를 비교하였다.
- 조사한 균액을 30 µg/mL의 sodium azide가 첨가된 YM broth에 2%(v/v) 농도가 되도록 접종하였다.
- 따라서 본 연구에서는 고꾸미 소재 개발을 위해 글루타치온 생산 효모 탐색과 균주개량을 통해 얻은 고글루타치온 함유 효모의 관능적 특성과 생리활성을 조사하고자 하였다. 즉, 상업용 및 식품소재 발효물로부터 글루타치온을 생산하는 효모를 분리하여, UV 조사법을 이용한 균주개량으로 고글루타치온 함유 효모를 개발하고, 이의 고꾸미 부여능과 항산화 활성을 분석하였다.
- 관능검사에 관심과 참여 의지가 있는 샘표식품(주)의 훈련된 관능검사원을 선별하여 1주일에 3일씩 12주간 훈련시킨 후 효모추출물의 관능검사에 참여시켰다. 치킨콘소메 스프(Herbox, Hormel Foods, Austin, MN, USA)를 기본베이스로 효모추출물, 양파추출물, 마늘추출물을 각각 배합한 치킨 콘소매 혼합물을 최종 농도 5.3%가 되도록 물에 용해하여 패널에게 제시하고 관능평가를 수행하였다(Table 1). 관능검사 항목은 이미, 이취(쓴맛), 우마미(감칠맛), 고꾸미(맛의 지속성, continuity; 부드럽고 깊은 맛, mouthfulness; 치킨콘소메 스프의 향미 강화, chicken flavor enhance)와 함께 전체적인 기호도 등에 대해 9점 평가법을 행하였다.
- 효모의 생육특성은 YM broth에 균주를 접종한 다음 30℃에서 30시간 동안 배양한 후 균주의 성장정도는 600 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였고, 배양 시간에 따른 pH 변화는 pH meter(Model EA 940, Orion, Boston, MA, USA)를 이용하여 측정하였다.
이론/모형
- 글루타치온 함량분석은 Alloxan reagent method를 사용하였다(9). 즉, 일정농도의 시료 1 mL를 0.
성능/효과
- 1차 선발균주를 대상으로 2차 관능검사를 실시한 결과(Fig. 1), SEM-Y4→SEM-Y6→SEM-Y9→SEM-Y10→SEM-Y8→SEM-Y11→SEM-Y5→SEMY12 순으로 높은 선호도를 나타내었다.
- 상업용 시판균주 및 자연발효물에서 분리한 균주 등 68종의 효모균주를 대상으로 관능검사를 수행하였다. 1차 선별 균주로는 Saccharomyces cerevisiae 3종(SEM-Y4, SEM-Y5, SEM-Y6), Candida utilis 4종(SEM-Y8, SEM-Y9, SEM-Y10, SEMY11) 및 Zygosaccharomyces rouxii 1종(SEM-Y12) 등 모두 8종의 효모가 정미성이 우수한 균주로 선별되었다. 1차 선발균주를 대상으로 2차 관능검사를 실시한 결과(Fig.
- 즉, 1-10 mg/mL의 농도범위에서 SEM-Y8, SY8-M2, SY8-M2-1 추출물은 각각 14-61%, 21-75%, 36-81%의 라디컬 소거효과를 보였다. DPPH 라디컬의 50%를 소거함에 필요한 농도인 IC50값은 wild type인 SEM-Y8 추출물은 3.8 mg/mL, 1차 변이종인 SY8-M2 추출물은 1.5 mg/mL, 2차 변이종 SY8-M2-1 추출물은 1.2 mg/mL을 보임으로써 변이에 의해 최대 3.2배 활성이 증가하였다. Lee 등(14)은 전통발효주에서 분리한 S.
- Fig. 3과 같이, 10가지 변이균주 중 SY8-M2 균주가 69.7 µg/mL의 글루타치온을 생산함으로써 SEM-Y8(54.8 µg/mL)에 비해 1.3배 향상된 글루타치온 생성능을 보였다.
- 균체건중량 대비 글루타치온 농도는 YM broth 56.7 µg/g, 선택배지 86.4 µg/g으로 선택배지에서 1.5배 향상됨을 보였다.
- 5배 우수한 것으로 나타났다. 따라서 4.0% yeast extract, 1.5% glucose, 0.04% NH4H2PO4, 0.04% L-cystein의 배지조성을 갖는 선택배지를 사용함으로써 향상된 고글루타치온 함유 효모추출물 제조가 가능할 것으로 사료된다.
- 은 92 µg/mL의 글루타치온 농도를 보였다(13). 따라서 본 연구에서 C. utilis로부터 개량한 SY8-M2-1이 기존 결과보다 1.7-2.4배 향상된 글루타치온 생성능을 보임으로써 우수한 고글루타치온 생성 효모임을 확인하였다.
- utilis 중에서 가장 좋은 균체 성장은 SEMY8에서 나타났다. 따라서 효모엑기스의 관능적인 차이에도 불구하고 공정개선을 고려할 때 S. cerevisiae보다 C. utilis가 더 높은 상업적 가치가 있다고 사료되어 균주 개량용 효모균주로 C. utilis인 SEM-Y8 균주를 선발하였다.
- cerevisiae보다 대수기와 정지기에 이르는 시간이 느리고, pH 저하도 크게 나타남으로써 같은 속의 효모일지라도 그 종류에 따라 생육특성이 다르게 나타남을 보여준다. 또한 Z. rouxii인 SEM-Y12는 배양 8시간까지 지체기를 보이다가, 이 후 30시간까지 대수증식기를 보였으며, 8균주 중 가장 느린 생육곡선을 보였다.
- 5배 향상됨을 보였다. 또한 글루타치온 생산속도에서도 YM broth(1.8)보다 선택배지(2.7)가 1.5배 우수한 것으로 나타났다. 따라서 4.
- utilis로부터 개량한 변이균주 SY8-M2-1를 이용하여 생산한 효모추출물은 글루타치온을 다량 함유하고, 관능적으로도 우수한 정미성을 보였다. 또한, 변이균주 SY8-M2-1의 항산화 활성은 wild type과 비교하여 3.2배 향상됨으로써 생리활성이 겸비된 기능성 고꾸미 소재로 사용 가능하다고 판단된다.
- 또한, 전체적인 기호도는 마늘추출물→효모추출물→양파추출물 순을 보여, 음식 본연의 향미를 오랜 시간 강하게 지속시켜줄 수 있는 특성을 정미소재에 부여하는 것이 필요함을 알 수 있었다.
- 014%)로 첨가 시 비교군으로 사용한 마늘 또는 양파추출물보다 우수한 감칠맛(우마미)과 부드럽고 깊은 맛(고꾸미)을 보였다. 또한, 전체적인 기호도에서도 마늘추출물보다는 낮으나 양파추출물보다는 우수한 정미성을 보였다.
- 4와 같다. 모든 효모추출물에서 농도의존적인 효과를 보였으며, 균주 변이에 의해 그 활성이 증가함을 알 수 있었다. 즉, 1-10 mg/mL의 농도범위에서 SEM-Y8, SY8-M2, SY8-M2-1 추출물은 각각 14-61%, 21-75%, 36-81%의 라디컬 소거효과를 보였다.
- utilis의 일종인 SEM-Y11은 전반적으로 낮은 증식능을 나타내었고, 배양 24시간 이후에는 균체 증식이 감소하는 경향을 보였다. 배양 시간에 따른 pH 변화는 SEM-Y6(S. cerevisiae)을 제외한 모든 균주에서 배양 12시간까지 감소하다가, 이 후 일정한 pH를 유지함을 보였다. 반면, SEM-Y6은 배양 12시간까지 pH가 다소 증가함으로써 다른 경향을 나타내었다.
- 또한, 가열에 의해 글루타치온이 어느 정도 파괴되어 산화형 글루타치온(GSSG)과 pyroglutamic acid 등으로 전환되지만 고꾸미 부여능은 유지됨을 보고하였다. 본 연구에서 개량한 효모로부터 얻은 글루타치온 다량 함유한 효모추출물은 치킨콘소메 스프에 0.016%(글루타치온 함량 0.014%)로 첨가 시 비교군으로 사용한 마늘 또는 양파추출물보다 우수한 감칠맛(우마미)과 부드럽고 깊은 맛(고꾸미)을 보였다. 또한, 전체적인 기호도에서도 마늘추출물보다는 낮으나 양파추출물보다는 우수한 정미성을 보였다.
- utilis가 생산하는 평균 단백질 함량이 58% 이상이라는 것은 중요하다. 본 연구에서 선정한 4종의 C. utilis 중에서 가장 좋은 균체 성장은 SEMY8에서 나타났다. 따라서 효모엑기스의 관능적인 차이에도 불구하고 공정개선을 고려할 때 S.
- 선발된 SEM-Y8 균주를 이용하여 돌연변이원(UV) 처리시 발생하는 사멸율을 표준곡선을 이용하여 계산한 결과, 초기 균체량은 4.6×108 CFU/mL에서 6분간 UV 처리시 1.1×103 CFU/mL까지 사멸하였다.
- 3까지 저하됨을 보고하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 사용한 S. cerevisiae보다 대수기와 정지기에 이르는 시간이 느리고, pH 저하도 크게 나타남으로써 같은 속의 효모일지라도 그 종류에 따라 생육특성이 다르게 나타남을 보여준다. 또한 Z.
- 이상과 같이, 본 연구에서 C. utilis로부터 개량한 변이균주 SY8-M2-1를 이용하여 생산한 효모추출물은 글루타치온을 다량 함유하고, 관능적으로도 우수한 정미성을 보였다. 또한, 변이균주 SY8-M2-1의 항산화 활성은 wild type과 비교하여 3.
- cerevisiae FF-8로부터 얻은 효모배양액의 DPPH 라디컬 소거능이 배양에 사용한 배지에 따라 55-67%의 활성을 보인다고 보고하였다. 이상의 연구 결과로부터 효모추출물의 라디컬 소거능이 변이주의 종류 및 배양 시 사용한 배지종류 등에 따라 생성된 글루타치온의 농도에 비례함을 알 수 있었다.
- 8 µg/mL의 글루타치온이 생성되었다. 이와 같이, 두 번의 UV 조사를 통해 얻어진 SY8-M2-1의 글루타치온 생성능은 wild type인 SEM-Y8과 1차 변이주인 SY8-M2에 비해 각각 2.0배 및 1.6배 증가함을 알 수 있었다.
- 1), SEM-Y4→SEM-Y6→SEM-Y9→SEM-Y10→SEM-Y8→SEM-Y11→SEM-Y5→SEMY12 순으로 높은 선호도를 나타내었다. 전반적으로 S. cerevisiae의 정미성이 C. utilis나 Z. rouxii 효모보다 우수하게 평가되었다. 특히, 이들 중에 전체적인 기호도는 SEM-Y4와 SEM-Y6이 비교적 좋았으나, 느끼한 맛, 역겨운 향, 이취, 비린 맛 등이 단점으로 지적되었다.
- 정미성이 우수한 8균주의 생육특성을 분석한 결과(Fig. 2), 균체 증식은 배양 12시간까지 대수증식기로 성장하였으며, 배양 12시간 이후는 정지기에 다다랐다. 특히, C.
- 모든 효모추출물에서 농도의존적인 효과를 보였으며, 균주 변이에 의해 그 활성이 증가함을 알 수 있었다. 즉, 1-10 mg/mL의 농도범위에서 SEM-Y8, SY8-M2, SY8-M2-1 추출물은 각각 14-61%, 21-75%, 36-81%의 라디컬 소거효과를 보였다. DPPH 라디컬의 50%를 소거함에 필요한 농도인 IC50값은 wild type인 SEM-Y8 추출물은 3.
- 2), 균체 증식은 배양 12시간까지 대수증식기로 성장하였으며, 배양 12시간 이후는 정지기에 다다랐다. 특히, C. utilis의 일종인 SEM-Y11은 전반적으로 낮은 증식능을 나타내었고, 배양 24시간 이후에는 균체 증식이 감소하는 경향을 보였다. 배양 시간에 따른 pH 변화는 SEM-Y6(S.
- 반면, SEM-Y6은 배양 12시간까지 pH가 다소 증가함으로써 다른 경향을 나타내었다. 특히, 가장 낮은 증식율을 보인 SEM-Y11 균주는 pH 변화에서 급격한 감소를 보임으로써 pH 감소와 균체성장 간의 상관관계가 있음을 보여주었다. Kim 등(10)은 안동식혜에서 분리한 S.
- rouxii 효모보다 우수하게 평가되었다. 특히, 이들 중에 전체적인 기호도는 SEM-Y4와 SEM-Y6이 비교적 좋았으나, 느끼한 맛, 역겨운 향, 이취, 비린 맛 등이 단점으로 지적되었다.
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