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문제 정의
- 본 연구는 현미, 녹미, 홍미, 흑미 4종의 유색미의 발아에 따른 GABA 함량을 분석하고 백미와 함께 비교하였다. HPLC/FLD 를 이용하여 GABA의 정성 및 정량 분석을 실시하였으며, 회수율과 검출한계를 설정하였다.
제안 방법
- 침지를 시작한지 16시간이 지난 후에 전분 등의 불순물을 제거하기 위해 물을 교환해 주었다. 20시간 침지가 끝나면 마지막으로 물을 교환 후에 30˚C의 암실에서 싹의 길이가 3 mm가 되도록 현미와 녹미는 24시간, 홍미와 흑미는 20시간 동안 발아시켰다. 그 후에 55℃의 오븐(Jeotech, Seoul, Korea)에서 6시간 동안 건조하여 건조 후 수분 함량이 13%가 되도록 하였다.
- GABA의 정성 분석은 두 가지 단계의 실험을 통해 실시하였다. 첫 번째는 표준 용액의 피크와 시료 피크의 머무름 시간을 비교하여 정성 분석을 실시하였으며, 두 번째는 시료에 일정 농도의 표준 용액을 첨가하여 피크의 면적이 증가하는 경향을 보고 정성 분석을 실시하였다.
- GABA의 추출은 Oh와 Choi(13)의 방법을 수정하여 실험하였다. 시료는 분쇄기(HR1351, Philips, Eindhoven, Netherlands)를 이용하여 잘게 분쇄한 다음, Conical centrifuge tube(SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)에 1.
- 본 연구는 현미, 녹미, 홍미, 흑미 4종의 유색미의 발아에 따른 GABA 함량을 분석하고 백미와 함께 비교하였다. HPLC/FLD 를 이용하여 GABA의 정성 및 정량 분석을 실시하였으며, 회수율과 검출한계를 설정하였다. 회수율을 측정한 결과 122.
- HPLC/FLD를 이용하여 발아 전후의 현미, 녹미, 홍미, 흑미 4종의 유색미의 GABA 함량을 측정하였다. 시료 중 발아 홍미의 GABA 함량이 293.
- 정량 분석은 크로마토그램의 농도면적비에 대해 1, 2, 4, 8, 100 µg/mL의 농도에서 검량선을 작성하고 이를 통해 시료 중의 GABA 함량을 구하였다. 각각의 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하였으며, 확립된 분석 조건에 따라 각각의 시료를 전처리 한 후에, HPLC에 주입하여 각 시료가 함유하고 있는 GABA의 양을 정량 분석하였다.
- 따라서 본 연구에서는 현미와 유색미에 존재하는 GABA 함량 분석을 위해 기존의 분석법을 개선하고 회수율과 검출한계, 정량 한계를 설정하였다. 아울러 현미, 녹미, 홍미, 흑미 등 유색미4종의 발아 전후의 GABA 함량을 분석하고, 이를 백미와 함께 비교하였다.
- 8 ng/mL이었다(27). 또한 본 논문에서는 GABA의 추출을 위해 참고로 한 Oh와 Choi(13)의 분석 방법과 달리, 동결 건조 전에 GABA 추출 용액에서 유기 용매를 감압증류 시킴으로써 동결 건조 시간을 단축하였다. 또한, Waters사의 AccQ-Tag amino acid analysis 방법의 HPLC 분석을 위한 이동상의 조성을 수정하여 분석함으로써 GABA의 elution 시간을 단축시켰다.
- 또한 본 논문에서는 GABA의 추출을 위해 참고로 한 Oh와 Choi(13)의 분석 방법과 달리, 동결 건조 전에 GABA 추출 용액에서 유기 용매를 감압증류 시킴으로써 동결 건조 시간을 단축하였다. 또한, Waters사의 AccQ-Tag amino acid analysis 방법의 HPLC 분석을 위한 이동상의 조성을 수정하여 분석함으로써 GABA의 elution 시간을 단축시켰다.
- 분쇄한 현미에 표준 용액 1,000 µg/mL 을 1 mL 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 전처리를 실시한 후에 회수율을 구하였다.
- GABA의 추출은 Oh와 Choi(13)의 방법을 수정하여 실험하였다. 시료는 분쇄기(HR1351, Philips, Eindhoven, Netherlands)를 이용하여 잘게 분쇄한 다음, Conical centrifuge tube(SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)에 1.0 g씩 칭량하였다. 시료 중 GABA의 1차 추출을 위해 메탄올 12 mL, 클로로포름 5 mL, 물 3 mL를 가한 후, 교반기(RS-1, JEIO TECH, Daejeon, Korea)를 290 rpm으로 조정하여 30분간 흔들어 주었다.
- 따라서 본 연구에서는 현미와 유색미에 존재하는 GABA 함량 분석을 위해 기존의 분석법을 개선하고 회수율과 검출한계, 정량 한계를 설정하였다. 아울러 현미, 녹미, 홍미, 흑미 등 유색미4종의 발아 전후의 GABA 함량을 분석하고, 이를 백미와 함께 비교하였다.
- 원심분리기(Combi-514R, Hanil Science Industrial, Incheon, Korea)는 상대원심력(Relative centrifugal force, RCF) 12,000×g, 4℃로 설정하여 15분간 원심 분리를 실시하였다.
- 유속은 분당 1 mL로 설정하였고 10 µL를 주입 하였다. 이동상 A는 AccQTag Eluent A 100 mL를 물 1L로 희석하여 사용하였으며, 이동상 B는 60%의 Acetonitrile (물:Acetonitrile, 40:60, v/v)을 사용하여 gradient mode로 분석하였다. 이동상의 조성은 Waters사의 AccQ-Tag amino acid analysis 방법을 약간 수정하여 분석하였으며, Table 1에 나타내었으며, 피크의 면적은 Waters Empower 2소프트웨어(Waters)를 사용하여 구하였다.
- 이동상 A는 AccQTag Eluent A 100 mL를 물 1L로 희석하여 사용하였으며, 이동상 B는 60%의 Acetonitrile (물:Acetonitrile, 40:60, v/v)을 사용하여 gradient mode로 분석하였다. 이동상의 조성은 Waters사의 AccQ-Tag amino acid analysis 방법을 약간 수정하여 분석하였으며, Table 1에 나타내었으며, 피크의 면적은 Waters Empower 2소프트웨어(Waters)를 사용하여 구하였다.
- 회수율은 GABA의 함량이 낮은 현미에 일정 농도의 표준 용액을 첨가(1000 µL/mL을 1 mL 첨가)하여 GABA 분석과 동일한 시료전처리를 실시하였다. 이후 HPLC로 분석하여 얻은 피크의 면적을 검량선을 통해 농도를 구하여 측정하였다. 회수율을 측정한 결과, 122.
- 정량 분석은 크로마토그램의 농도면적비에 대해 1, 2, 4, 8, 100 µg/mL의 농도에서 검량선을 작성하고 이를 통해 시료 중의 GABA 함량을 구하였다.
- GABA의 정성 분석은 두 가지 단계의 실험을 통해 실시하였다. 첫 번째는 표준 용액의 피크와 시료 피크의 머무름 시간을 비교하여 정성 분석을 실시하였으며, 두 번째는 시료에 일정 농도의 표준 용액을 첨가하여 피크의 면적이 증가하는 경향을 보고 정성 분석을 실시하였다. 정량 분석은 크로마토그램의 농도면적비에 대해 1, 2, 4, 8, 100 µg/mL의 농도에서 검량선을 작성하고 이를 통해 시료 중의 GABA 함량을 구하였다.
- 현미에 포함된 GABA 함량 분석과 농도를 증가시키기 위한 연구는 상당부분 진행 되었다. Komatsuzaki 등(23)과 Choi 등(12)은 수침 조건과 혐기적인 처리를 통해 현미 및 발아현미에서 GABA의 함량을 증진시키는 조건을 확립하였다.
- 회수율은 GABA의 함량이 낮고 대표할 수 있는 시료인 현미를 선택하여 측정하였다. 분쇄한 현미에 표준 용액 1,000 µg/mL 을 1 mL 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 전처리를 실시한 후에 회수율을 구하였다.
- 회수율은 GABA의 함량이 낮은 현미에 일정 농도의 표준 용액을 첨가(1000 µL/mL을 1 mL 첨가)하여 GABA 분석과 동일한 시료전처리를 실시하였다.
대상 데이터
- Baker Co.(Phillipsburg, NJ, USA)의 제품을 사용하였으며, Waters 사(Milford, MA, USA)의 1차, 2차 아미노산 모두를 안정한 형광 유도체화 물질로 바꿔주는데 필요한 AccQ-FluorTM Reagent Kit(AccQ-Fluor borate buffer, AccQ-Fluor reagent powder, AccQFluor diluent로 조합됨)와 Accq-Tag Eluent A를 구매하여 사용하였다.
- HPLC 기기는 1525 펌프(Binary HPLC Pump)와 474 형광검출기(Scanning Fluorescence Detector)로 구성된 Waters사 제품을 사용하였다. 또한 컬럼은 AccQ-Tag C18 컬럼(3.
- 또한 컬럼은 AccQ-Tag C18 컬럼(3.9×150 mm I.D., 4 µm)을 Waters사에서 구매하여 사용하였으며, 형광 검출기의 여기 파장은 250 nm, 측정 파장은 390 nm로 설정하였다.
- )는 경기도 파주의 생산업체인 (주)하동에서 구매하여 실험에 사용하였으며 백미도 함께 구매하여 실험에 사용하였다. 발아실험의 경우 (주)하동의 실험실(Cheongju, Korea)에서 실시하였다.
- 실험에 사용된 현미, 녹미, 홍미, 흑미(Oryza sativa L.)는 경기도 파주의 생산업체인 (주)하동에서 구매하여 실험에 사용하였으며 백미도 함께 구매하여 실험에 사용하였다. 발아실험의 경우 (주)하동의 실험실(Cheongju, Korea)에서 실시하였다.
- 표준품인 GABA는 Sigma-Aldrich Korea(St, Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 증류수, 클로로포름, 메탄올, Acetonitrile은 J.
데이터처리
- 시료의 GABA 함량에 대한 결과는 통계 분석 SAS 9.1을 이용하여 분산분석을 실시하였으며 유의성 검정(p<0.05)은 Duncan의 다중검정법(multiple range test)을 이용하였다.
- 연구에서 확립한 GABA 분석법의 유효성 검증을 위해, 검량선의 직선성(R2), 검출한계 및 정량한계, 회수율을 실시하였으며 그 결과를 Table 2에 나타내었다. 검량선은 GABA 표준품을 물로 희석하여 표준용액을 만든 후, 유도체화 과정을 거쳐 HPLC로 분석하여 작성하였으며, 검량선의 R2 값은 0.
이론/모형
- 건조한 시료를 10 mL의 물을 가하여 용해한 후, 0.45 µm의 PVDF(Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) 필터를 통과시켜 여과한 것을 Waters사의 AccQ-Tag Amino Acid Analysis 방법에 따라 유도체화하였다.
- 또한 검출한계 (limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 Harris(26)의 방법에 따라 구하였으며 표준용액과 동일한 방법으로 1 µL/mL을 제조하여 7회 반복하여 실험하였다.
성능/효과
- 검량선은 GABA 표준품을 물로 희석하여 표준용액을 만든 후, 유도체화 과정을 거쳐 HPLC로 분석하여 작성하였으며, 검량선의 R2 값은 0.998로 우수한 직선성을 나타내었다.
- 녹미를 제외한 현미, 홍미, 흑미는 미발아미에 비해 발아미의 GABA 함량이 유의적(p<0.05)으로 2.5-11.1배 정도로 더 높은 양을 함유하고 있었으며, 백미는 11.9 µg/g으로 유의적으로 가장 낮은 양을 함유하고 있었다.
- 현미 이외에도 발아 조건이 GABA의 함량을 증진시킴을 보여 주고 있는데, Matsuyama 등(30)은 대두를 발아시킨 후 GABA의 함량이 증가함을 보고 하였다. 따라서 본 결과를 통해 발아 후 GABA의 함량이 증진됨을 알 수 있었다.
- 또한, 발아 현미, 발아 녹미, 녹미, 발아 흑미는 각각 257.5, 226.5, 244.9, 253.0 µg/g의 GABA를 함유하고 있었으며 유의적(p<0.05)인 차이를 보이지는 않았다.
- 발아 현미, 발아 녹미, 발아 홍미, 발아 흑미는 각각 257.5, 226.5, 293.6, 253.0 µg/g 함유하고 있었으며, 이는 백미에 비해 각각 21.6, 19.0, 24.7, 21.3배 높은 함량이었다.
- 발아미, 미발아미 및 백미의 GABA 함량을 분석한 결과, 발아 홍미가 293.6 µg/g으로 유의적으로 가장 많은 양을 함유하고 있었으며 홍미와 백미가 각각 26.4, 11.9 µg/g으로 가장 적은 양을 함유하고 있었다.
- 9 µg/g으로 가장 적은 양을 함유하고 있었다. 발아미와 미발아미의 GABA 함량을 비교한 결과, 녹미를 제외한 현미, 홍미, 흑미는 미발아미에 비해 GABA의 함량이 유의적으로 2.5-11.1배 증가 하였다. 백미와 미발아미를 비교해 본 결과, 백미와 홍미 사이에 유의적 차이를 보이지는 않았으며, 현미, 녹미와 흑미는 백미의 GABA 함량인 11.
- 이는 현미의 품종과 재배환경이 다르고, 발아 현미의 경우 발아 조건이 다른 점으로부터 기인하는 것으로 보여진다. 발아미와 미발아미의 GABA 함량을 비교한 결과, 녹미를 제외한 현미, 홍미, 흑미는 미발아미에 비해 발아미가 2.5-11.1배 정도로 더 높은 양을 함유하고 있었다. 발아현미는 257.
- 1배 증가 하였다. 백미와 미발아미를 비교해 본 결과, 백미와 홍미 사이에 유의적 차이를 보이지는 않았으며, 현미, 녹미와 흑미는 백미의 GABA 함량인 11.9 µg/g에 비해 7.6-20.6배 높은 함량이었다. 백미와 발아미 사이에는 발아미는 모두 백미와 유의적인 차이를 보였으며 백미에 비해 발아미의 GABA 함량은 19.
- 백미와 미발아미의 GABA 함량을 비교한 결과, 백미와 홍미 사이에 유의적(p<0.05) 차이를 보이지는 않았으며, 현미, 녹미와 흑미는 각각 91.0, 244.9, 101.6 µg/g을 함유하고 있었으며 이는 백미에 대해 각각 7.6, 20.6, 8.5배 높은 함량이었다.
- 백미와 발아 미의 GABA 함량을 비교한 결과, 발아미는 모두 백미와 유의적 (p<0.05)인 차이를 보였다.
- 6배 높은 함량이었다. 백미와 발아미 사이에는 발아미는 모두 백미와 유의적인 차이를 보였으며 백미에 비해 발아미의 GABA 함량은 19.0-24.7배 높았다.
- 9 µg/g으로 유의적으로 가장 낮은 양을 함유하고 있었다. 본 결과를 통해 발아 후 GABA의 함량이 증진됨을 확인할 수 있었다. 회수율과 LOD 및 LOQ를 측정한 결과, 회수율은 122.
- 시료 중 발아 홍미의 GABA 함량이 293.6 µg/g으로 가장 많은 양을 함유하고 있었다.
- 시료 중 발아 홍미의 GABA 함량이 293.6 µg/g으로 유의적으로 가장 많은 양을 함유하고 있었다.
- 시료 중에서 녹미를 제외한 발아미는 미발아미 보다 GABA의 함량이 높음을 확인할 수 있었다. Komatsuzaki 등(23)의 연구에 의하면, 각각 미발아 현미와 발아 현미의 GABA 함량이 73±20.
- 1에 나타내었다. 표준용액 및 각 시료에서 GABA의 피크는 25분대에 검출되었고, 분석을 저해하는 방해피크는 관찰되지 않았다. 각 시료의 GABA 함량은 Table 3에 나타내었다.
- 05)인 차이를 보이지는 않았다. 현미와는 달리 도정 과정을 거친 백미는 GABA 함량이 11.9로 가장 적은 양을 함유하고 있었다. 하지만 현미 시료 중 가장 함량이 낮은 미발아 홍미와는 유의적(p<0.
- 회수율과 LOD 및 LOQ를 측정한 결과, 회수율은 122.4±2.4%, RSD는 2.0%이었으며, 검출한계는 0.23 µg/g, 정량한계는 0.76 µg/g이었다.
- 회수율을 측정한 결과 122.4±2.4%, RSD는 2.0%이었으며, 검출한계는 0.23 µg/g, 정량한계는 0.76 µg/ g이었다.
- 회수율을 측정한 결과, 122.4±2.4%의 회수율을 보였으며 RSD 는 2.0%이었다.
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